Tài liệu Nghiên cứu đa hình gen liên quan đến vô sinh ở nam giới thăm khám tại bệnh viện trường đại học y hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN ĐOÀN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GEN LIÊN QUAN ĐẾN VÔ SINH Ở NAM GIỚI THĂM KHÁM TẠI BỆNH VIỆN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 8420114 Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS. Nguyễn Thùy Dƣơng (Người hướng dẫn thứ nhất) Ngƣời hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Mộng Điệp (Người hướng dẫn thứ hai) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thùy Dương và PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc rõ ràng và được phép công bố. Bình Định, tháng 08 năm 2022 Học viên ĐOÀN THỊ HUYỀN TRANG ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Thùy Dương và PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, bạn bè tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nơi tôi thực tập đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm việc. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên tôi, động viên và khích lệ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. Mặc dù tôi đã cố gắng để hoàn thành đề tài nhưng không tránh khỏi những thiếu xót nhất định. Tôi rất mong nhận được sự đánh giá, nhận xét và đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Bình Định, tháng 08 năm 2022 Học viên ĐOÀN THỊ HUYỀN TRANG iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vi DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ ........................................................... ix MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................ 3 3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .......................................................... 3 3.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 3 3.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 3 4 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 3 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ................................................... 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ..................... 5 1.1. Tổng quan về tình hình vô sinh và vô sinh nam .................................. 5 1.2. Gen TEX15 và vô sinh nam................................................................. 6 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước ............................... 7 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................ 7 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 10 1.4. Nguyên nhân gây vô sinh nam........................................................... 11 1.4.1. Môi trường ................................................................................... 11 1.4.2. Nguyên nhân do nội tiết............................................................... 11 1.4.3. Độ tuổi sinh sản ........................................................................... 12 1.4.4. Bệnh lý ảnh hưởng đến khả năng sinh sản ở nam giới ................ 13 1.4.5. Nguyên nhân di truyền ................................................................ 14 1.5. Tổng quan về đa hình nucleotide đơn ................................................ 17 1.5.1. Đặc điểm đa hình nucleotide đơn ................................................ 17 1.5.2. Các phương pháp xác định đa hình nucleotide đơn .................... 19 iv 1.5.2.1. Phản ứng chuỗi polymerase - đa hình chiều dài đoạn giới hạn (Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism - PCR-RFLP) ...................................................................................... 19 1.5.2.2. Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao (Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography - DHPLC) ............................. 20 1.5.2.3. Phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (Single-strand conformation polymorphism - SSCP) ................................................. 20 1.5.2.4. Điện di trên gel nhạy cảm với cấu trúc (ConformationSensitive Gel Electrophoresis - CSGE) .............................................. 21 1.5.2.5. Phân tách hóa học nucleotide ghép đôi lệch (Chemical Cleavage of Mismatch - CCM) ........................................................... 21 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 23 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................... 23 2.3. Trang thiết bị và hóa chất .................................................................. 24 2.3.1. Trang thiết bị................................................................................ 24 2.3.2. Hóa chất ....................................................................................... 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 24 2.4.1. Tách chiết DNA tổng số .............................................................. 24 2.4.2. Phương pháp thiết kế mồi ............................................................ 25 2.4.3. Khuếch đại vùng DNA có chứa đa hình TEX15 rs142485241 ... 25 2.4.4. Phương pháp PCR - RFLP .......................................................... 27 2.4.5. Phương pháp thống kê và so sánh ............................................... 29 2.5 Vấn đề y đức trong nghiên cứu y sinh học ......................................... 29 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................... 31 3.1. Kết quả xác định tần số alen và kiểu gen của đa hình TEX15 rs142485241 ở hai nhóm bệnh và nhóm chứng........................................ 31 3.1.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mẫu máu ......... 31 3.1.2. Khuếch đại vùng DNA có chứa TEX15 rs142485241 ................ 47 3.1.3. PCR - RFLP ................................................................................. 50 v 3.2. Phân tích sự liên quan của đa hình TEX15 rs142485241 và bệnh vô sinh nam .................................................................................................... 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 64 1. Tài liệu tiếng Anh ........................................................................... 64 2. Tài liệu tiếng Việt ........................................................................... 73 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 95% CI 95% Confident interval Khoảng tin cậy 95% AIS Androgen insensitivity Hội chứng không nhạy syndrome cảm androgen AR Androgen Thụ thể androgen Array Microarray-based CGH comparative genomic Lai so sánh hệ gen dựa trên hybridization microarray AZF Azoospermia factor Vùng yếu tố không tinh trùng bp Base pair Cặp cơ sở (cặp nucleotide) Chemical Cleavage of Phân tách hóa học nucleotide ghép CCM Mismatch đôi lệch CNV Copy number variantion Biến dị số lượng bản sao Conformation-Sensitive Điện di trên gel nhạy cảm với cấu Gel Electrophoresis trúc CSGE Dideoxynucleotide tripho ddNTP sphate Dideoxynucleotide triphosphate Denaturing HighPerformance Liquid DHPLC Chromatography Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao DNA Deoxyribonucleic acid deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide dNTP triphosphate DSB Double-strand break Etylene diamine tetra EDTA acetic acid Tách đôi sợi DNA vii EST Expressed sequence tags Các thẻ trình tự được thể hiện Fluorescence in situ Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh hybridization quang Genome-Wide Nghiên cứu dùng để xác định các GWAS Association Study biến thể bộ gen có ý nghĩa thống kê HWE Hardy – Weinberg Trạng thái cân bằng Hardy – equilibrium Weinberg FISH National Center for NCBI Biotechnology Trung tâm Thông tin Công nghệ Information sinh học Quốc gia Next Generation NGS Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới NonNOA obstructive Azoospermia Azoospermia không tắc nghẽn OD Optical density Mật độ quang học OR Odd ratio Tỷ suất chênh PCR Polemerase Chain RE Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Restriction Enzyme Enzyme giới hạn Restriction Fragment RFLP Length Polymorphism. Hạn chế mảnh chiều dài đa hình Sertoli cell only SCOS syndrome Hội chứng tế bào Sertoli đơn thuần Single-strand conformation SSCP polymorphism Phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn STSs Sequence-Tagged Site Vị trí được gắn thẻ trình tự viii Single-nucleotide Đa hình đơn nucleotide SNP polymorphism TEX15 Testis Expressed 15 WES Whole exome sequencing Giải trình tự hệ gen mã hóa World Health WHO Organization Tổ chức Y tế Thế giới Y-Chromosome YCMD Microdeletion Mất đoạn NST Y ix DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Tìm hiểu các gen liên quan đến vô sinh nam ..................................... 8 Hình 1.2 Tuổi tác ảnh hưởng đến quá trình sinh Testosteron ở nam giới ...... 13 Hình 1.3 Sơ đồ các locus của vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y ...................... 16 Hình 1.4 Đa hình nucleotide đơn trên DNA ................................................... 18 Hình 2.1 Chu kỳ chạy PCR ............................................................................. 27 Hình 2.2 Trình tự nhận biết của enzyme PfeI ................................................. 27 Hình 2.3 Trình tự đoạn DNA có chứa điểm đa hình TEX15 rs142485241 .... 28 Hình 3.1(a) Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ 227 mẫu máu của bệnh nhân vô sinh nam (VSN) trên gel agarose 1% ....................................... 46 Hình 3.1(b) Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ 202 mẫu máu của người nam bình thường (VSC) trên gel agarose 1%....................................... 47 Hình 3.2(a) Điện di đồ các sản phẩm PCR khuếch đại vùng DNA có chứa TEX15 rs142485241 của 227 mẫu từ bệnh nhân vô sinh nam (VSN) ............ 49 Hình 3.2(b) Điện di đồ các sản phẩm PCR khuếch đại vùng DNA có chứa TEX15 rs142485241 của 202 mẫu từ người bình thường (VSC) ................... 50 Hình 3.3 Sản phẩm xử lý PCR điện di trên gel agarose 3% ........................... 51 Hình 3.4(a) Điện di đồ các sản phẩm PCR sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn PfeI của 227 mẫu từ bệnh nhân vô sinh nam (VSN) trên gel agarose 1,5% .. 54 Hình 3.4(b) Điện di đồ các sản phẩm PCR sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn PfeI của 202 mẫu từ người bình thường (VSC) trên gel agarose 1,5% ... 55 Biểu đồ 3.1. So sánh tần số alen của đa hình TEX15 rs142485241 giữa kết quả nghiên cứu và các quần thể lân cận................................................................. 57 [1–10][11–20] [21–30][31–40][41–50][51–60][61–70][71,72][73–75] 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Vô sinh là một vấn đề ngày càng phức tạp ở những nước đang phát triển, đặc biệt là ở Việt Nam, khi tỷ lệ vô sinh của các cặp đôi trong độ tuổi sinh đẻ chiếm tới 7.7% [76]. Bệnh vô sinh có rất nhiều kiểu hình khác nhau, trải dài từ bất thường niệu sinh dục, rối loạn nội tiết tố, ảnh hưởng của các yếu tố miễn dịch cho tới suy giảm số lượng và chất lượng tinh trùng ở nam giới. Trong đó, các ca vô sinh có nguyên nhân từ nam giới chiếm tới 50% tổng số ca bệnh [61]. Dựa trên phương diện vị trí địa lí, một nghiên cứu để phân tích dữ liệu từ 40.000 nhiễm sắc thể Y ở người cũng cho thấy có sự hiện diện của mất đoạn siêu nhỏ trên nhiễm sắc thể Y (Y-Chromosome Microdeletion – YCMD) với khoảng 7,5% trong nam giới vô sinh trên toàn thế giới [10]. Bên cạnh những nguyên nhân do các tác động từ môi trường, yếu tố di truyền cũng được cho là đóng vai trò quan trọng và chiếm tới 10-15% nguyên nhân gây ra vô sinh ở nam giới [77]. Yếu tố di truyền gây ra vô sinh nam bao gồm đột biến số lượng nhiễm sắc thể, đột biến lặp đoạn, đảo đoạn, mất đoạn siêu nhỏ,...[39,45,52]. Trong đó, các gen liên quan đến quá trình sinh tinh được cho là những ứng cử viên cho việc xác định chính xác nguyên nhân gây ra bệnh vô sinh. Tuy nhiên, việc có đến hơn 2,000 gen liên quan đến quá trình sinh tinh khiến cho việc tìm hiểu nguyên nhân của bệnh càng trở nên khó khăn [36]. Hơn nữa, các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng những gen tham gia vào các chức năng phổ biến của tế bào nhưng có liên quan tới tế bào mầm như chết tế bào, sửa chữa DNA, giảm phân,… cũng được cho là nguyên nhân đáng kể gây vô sinh nam, chúng chiếm tới khoảng 70% những gen liên quan tới vô sinh nam [16,41,45]. Trong khi chỉ 30% còn lại là những gen liên quan tới hệ thống sinh sản của nam giới. Mặc dù đã có rất nhiều nỗ lực trong việc tìm kiếm nguyên nhân gây ra bệnh vô sinh ở nam giới, vẫn còn ít nhất 2 30% những ca vô sinh không tìm thấy nguyên nhân hay được phân loại thành những ca vô sinh không rõ nguyên nhân [16]. Ở các nghiên cứu sau này, các biến dị di truyền trên nhiễm sắc thể Y bao gồm đột biến điểm, đột biến mất đoạn hoặc biến dị số lượng bản sao (Copy number variants - CNV) đã được tìm thấy trên các bệnh nhân vô sinh nam và được chỉ ra rằng có thể làm giảm hoặc mất hoàn toàn quá trình sinh tinh [10,57]. Trong đó, mất đoạn siêu nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở “vùng yếu tố không tinh trùng” (Azoospermia factor - AZF) là sai lệch di truyền phổ biến thứ hai ở nam giới vô sinh, thường xảy ra ở vùng nguyên nhiễm sắc nằm ở Yq của nhiễm sắc thể Y [10,44,47]. Tần suất của chúng dao động trong khoảng 3% đến 15% ở nam giới mắc vô sinh không xuất hiện bất thường ở ống dẫn tinh, 6% đến 8% ở nam giới mắc chứng ít tinh trùng (oligozoospermia) nặng, và 0,025% ở dân số nói chung tùy thuộc vào tiêu chí lựa chọn bệnh nhân và kỹ thuật được sử dụng [1,35]. Hiện nay, nhờ sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ trong sinh học phân tử tiêu biểu như giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing NGS), những gen liên quan tới vô sinh nam đã được chỉ ra không chỉ nằm ở nhiễm sắc thể Y mà còn nằm rải rác ở những gen trên nhiễm sắc thể thường. Bên cạnh đó, những nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen (Genome-Wide Association Studies - GWAS) cũng góp phần vào việc chỉ ra những gen ứng cử viên quan trọng có mối quan hệ mật thiết với vô sinh nam. Cho đến nay, các microarray đa hình nucleotide đơn lẻ đã xác định thành công một vài gen, chẳng hạn như SPATA16, DPY19L2, DNAH1 và TEX15, liên quan đến vô sinh nam [7,11,13,43]. Tuy nhiên, ở nước ta, nghiên cứu mới chỉ đạt ở mức độ đơn gen hoặc một vài gen, các nghiên cứu xác định tần xuất của đa hình các gen tiềm năng liên quan đến vô sinh trong quần thể xuất hiện với số lượng rất hạn chế. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình gen liên quan đến vô sinh ở nam giới thăm khám tại bệnh viện 3 trƣờng Đại học Y Hà Nội". Nghiên cứu này đặt mục tiêu xác định tần số của một số đa hình trên những gen tiềm năng liên quan đến vô sinh nam trên nhóm bệnh và nhóm chứng. 2. Mục tiêu nghiên cứu  Xác định được tần suất alen và kiểu gen của đa hình TEX15 rs142485241 ở hai nhóm bệnh và nhóm đối chứng.  Phân tích sự liên quan của đa hình này với bệnh vô sinh nam. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu  Hai trăm hai mươi bảy (227) người nam giới mắc bệnh vô sinh.  Hai trăm lẻ hai (202) người nam giới khỏe mạnh có ít nhất một người con (sinh con tự nhiên) được tuyển chọn để làm mẫu đối chứng. Các đối tượng tình nguyện tham gia cung cấp mẫu máu cho nghiên cứu phải ký tên vào bản xác nhận đồng ý hiến mẫu cho mục đích nghiên cứu. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Mẫu nghiên cứu được thu thập tại Bệnh viện Trường Đại học Y, Hà Nội. Đề tài được thực hiện tại Phòng Hệ gen học người, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Đề tài này sử dụng phương pháp thực nghiệm bao gồm:  Phương pháp tách chiết và xác định nồng độ của DNA tổng số.  Phương pháp PCR - RFLP.  Phương pháp phân tích số liệu. 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là dẫn liệu khoa học về mối liên quan giữa đa hình gen và vô sinh nam. Ý nghĩa thực tiễn: Dẫn liệu nghiên cứu góp phần đánh giá sự ảnh hưởng 4 của đa hình đơn nucleotide đối với vô sinh ở nam, làm cơ sở khoa học cho việc chuẩn đoán, điều trị bệnh vô sinh nam, cải thiện chất lượng dân số, chất lượng sinh sản. 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về tình hình vô sinh và vô sinh nam Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng không có thai sau ít nhất 12 tháng quan hệ tình dục không sử dụng phương pháp bảo vệ hoặc do sự suy giảm hệ thống sinh sản của một trong hai người hoặc cả hai [71]. Theo thống kê, có khoảng 15% các cặp vợ chồng hiếm muộn và trong số đó, vô sinh nam chiếm khoảng 50% [36]. Vô sinh nam được chia ra thành vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát [39,52,62,71]. Vô sinh nguyên phát bao gồm những người vô sinh chưa từng thực hiện thành công việc thụ tinh trong cuộc đời. Trái lại, vô sinh thứ phát bao gồm những người không thể thụ tinh thành công nhưng trước đó đã từng thành công một hoặc nhiều lần. Hiện nay, hơn 186 triệu dân số trên toàn thế giới đang gặp phải những vấn đề liên quan đến sinh sản, với tỷ lệ 1 trong 4 cặp vợ chồng ở các nước đang phát triển mắc phải vô sinh [29,42,62]. Vô sinh đã ảnh hưởng đến khoảng 7% nam giới [24,36] và hiện đang được coi là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Điều này dẫn đến việc chính phủ ngày càng lo ngại về sự tăng trưởng dân số, tỷ lệ sinh và tỷ lệ tử vong, cân bằng nhân khẩu học và sức khỏe quốc gia. Hơn nữa, tỷ lệ vô sinh nam chuẩn hóa theo độ tuổi ở nam tăng 8,224% từ năm 1990 đến năm 2017 và với sự gia tăng 0.291% tỷ lệ này mỗi năm, vô sinh ở nam giới là một vấn đề ngày càng được quan tâm trên toàn thế giới [53]. Trong những năm gần đây, nhờ công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã giải mã toàn bộ hệ gen [20,48] hay hệ gen biểu hiện (exome) của những người nam giới vô sinh trong gia đình hoặc quần thể và so sánh số liệu thu được với những người khỏe mạnh. Qua đó, nhiều gen ứng viên được cho rằng có liên quan tới vô sinh nam đã được xác định, mà nổi bật nhất có thể kể đến nghiên cứu của nhóm tác giả Araujo và cộng sự về việc phân tích trình tự của 37 ứng của viên gen vô sinh nam [3]. 6 Trong nghiên cứu này cho thấy các gen DMRT1, DNMT38, REC8, TEX14,...có liên quan đến quá trình hình thành tinh trùng, nổi bật nhất có thể kể đến gen TEX15 (Testis Expressed 15). 1.2. Gen TEX15 và vô sinh nam TEX15 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 (8p12) có kích thước khoảng 81 kb với 11 exon. Gen này mã hóa cho một protein bao gồm 1,785 amino acid và đóng vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa tách đôi sợi DNA (Doublestrand break - DSB) trong tế bào mầm, đảm bảo quá trình tiếp hợp nhiễm sắc thể bình thường và tái tổ hợp tương đồng trong quá trình sinh tinh [3,69]. Sau khi quá trình này xảy ra, TEX15 sẽ điều hòa các protein sửa chữa ở trên những vùng tách đôi này để đảm bảo việc phân cắt theo đúng chiều từ 5’ đến 3’ [28]. Vào năm 2015, Okutman và cộng sự đã giải mã toàn bộ hệ gen biểu hiện của 2 anh em bị vô sinh trong một gia đình gồm 8 anh chị em [46]. Qua phân tích số liệu cả hai anh em đó đều có đột biến vô nghĩa ở gen TEX15 dẫn đến mã kết thúc và do đó biểu hiện ra protein bị ngắt đoạn và không có hoạt tính. Ở một nghiên cứu khác, hai đột biến dị hợp tử mới (c.2419A>T, p.Lys807*, và c.3040delT, p.Ser1014Leufs*5) được tìm thấy trên gen TEX15 ở hai anh em bệnh nhân vô sinh cũng góp phần củng cố vai trò quan trọng của gen này trong quá trình sinh tinh bình thường khi sự suy giảm của nó có thể là nguyên nhân gây ra một số ca vô sinh không xuất hiện bất thường ở ống dẫn tinh [11]. Ngoài ra, mô hình chuột knockout gen TEX15 đã tạo ra chuột có tinh hoàn không phát triển và quá trình giảm phân bị ức chế [69]. Từ kết quả của những nghiên cứu độc lập trên, gen TEX15 đã được cho là có liên quan trực tiếp đến vô sinh ở nam giới. Bên cạnh đó, các nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen (Genome-Wide Association Studies - GWAS) cũng được phát triển để khám phá đặc điểm di truyền của những người nam giới mắc vô sinh nam, góp phần chỉ ra những gen liên quan đến vô sinh nam. 7 Cho đến nay, đã có một số GWAS được thực hiện từ châu Âu cho tới châu Á [5,25,33,38]. Ít nhất 300 đa hình đơn nucleotide (Single-nucleotide polymorphism - SNP) phân bố trên hơn 123 gen đã được đề xuất rằng có liên quan đến bệnh vô sinh nam, nhưng những kết quả này vẫn còn gây tranh cãi và không đồng nhất [3,36]. Một loạt những nghiên cứu tiếp nối kết quả của các GWAS cũng được thực hiện ngay sau đó để chỉ ra thêm các đa hình liên quan tới bệnh trên, những gen ứng cử viên mới cũng như là kiểm chứng lại các đa hình đã được chỉ ra trước đó. Trong đó, một số đa hình trên gen TEX15 cũng đã được nghiên cứu về sự liên quan tới vô sinh ở các quần thể người Châu Âu [6], Trung Quốc [72], Thổ Nhĩ Kì [46], và quần thể những người có nguồn gốc khác nhau. 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nƣớc 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Mặc dù việc tìm kiếm nguyên nhân di truyền của vô sinh nam đã bắt đầu từ giữa thế kỉ XX, nhưng hiện tại vẫn đang là lĩnh vực rất hấp dẫn với các nhà nghiên cứu do sự phát triển của các công nghệ sinh học phân tử hiện đại, [68] (Hình 1.1). Phương pháp sớm nhất và phổ biến nhất để xác định các bất thường di truyền tiềm ẩn ở nam giới vô sinh là lập nhiễm sắc thể đồ (hay còn gọi là lập bộ nhiễm sắc thể - xét nghiệm karyotyping) [36,68]. Ứng dụng của nó là xác định sự hiện diện của việc có thêm một nhiễm sắc thể X, được tìm thấy trong hội chứng Klinefelter (47, XXY) [30], hoặc bằng cách sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH), phát hiện ra một số rối loạn đảo ngược giới tính; ví dụ 46, XX nam [58]; chuyển vị Robertsonian [22]. Năm 1976, bằng cách phân tích karyotype. Tiepolo và các đồng nghiệp đã phát hiện ra ở 6 người đàn ông bị vô tinh (azoospermia) bị mất một đoạn ở dải q11 trên nhánh dài của nhiễm sắc thể Y (Yq11) so với tình trạng nam giới bình thường [57], cho thấy rằng khu vực cánh tay dài của nhiễm sắc thể Y là không thể thiếu cho quá trình sinh tinh, sau này được gọi là vùng yếu tố không tinh 8 trùng (Azoospermia Factor - AZF). Tuy nhiên, tất cả các bệnh đã được báo cáo ở trên bằng cách sử dụng karyotyping được giới hạn trong việc xác định nguyên nhân vô sinh nam ở bệnh nhân không có tinh trùng (azoospermia) và có số lượng tinh trùng thấp (oligospermia) [36,45,68]. Các gen quan trọng đã được xác định trong vô sinh nam Hình 1.1. Tìm hiểu các gen liên quan đến vô sinh nam [68] Việc phát minh ra kỹ thuật giải trình tự Sanger vào năm 1977 và phản ứng chuỗi polymerase (Polemerase Chain Reaction - PCR) vào năm 1983 đã hỗ trợ cho việc nghiên cứu phân tử trở nên dễ dàng hơn, do chúng đã giúp việc xác định các đột biến dẫn đến vô sinh nam giới. Tuy nhiên, gen đầu tiên được nhắc đến là có liên quan đến vô sinh nam vào năm 1988 lại nằm trên nhiễm sắc thể X, thay vì trên nhiễm sắc thể giới tính của nam giới. Sử dụng phương pháp tiếp cận dựa trên PCR, Brown và các đồng nghiệp đã có thể phát hiện việc xóa một phần gen thụ thể androgen (AR) ở người trong một đối tượng có hội chứng không nhạy cảm androgen (Androgen insensitivity syndrome - AIS) [8]. Năm 1989, sau khi giải trình tự dựa trên PCR, các nhà 9 nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) để phát hiện đột biến gen CFTR trong nhiễm sắc thể số 7 [31], sau đó tiếp tục xác định mối liên hệ và sự phân bố đột biến ở bệnh nhân bị tắc nghẽn tinh trùng do tinh trùng không thể đi vào tinh dịch hoặc nam giới có vấn đề về xuất tinh (vô sinh bế tắc) [2]. Năm 1995, sử dụng PCR và các vị trí được gắn thẻ trình tự (Sequence-Tagged Site - STSs), các nhà nghiên cứu đã xác định các gen ứng cử viên mạnh nhất liên quan đến vô sinh ở nam giới đối với bệnh nhân azoospermic với microdeletions Y, được đặt tên là Deleted in Azoospermia (DAZ) [34]. Việc sử dụng thêm kỹ thuật PCR đã phát hiện ra 3 locus trong Yq11, hoặc trước đây được gọi là vùng AZF, liên quan đến quá trình hình thành tinh trùng, được đặt tên là AZFa, AZFb và AZFc [65]. Kể từ khi giới thiệu microarray vào năm 1995 - một kỹ thuật xác định bất thường nhiễm sắc thể, các phương pháp tiếp cận với những phát hiện về di truyền của vô sinh nam đã phát triển mạnh. Để xác định nguyên nhân vô căn của vô sinh nam, ngoài gen di truyền liên quan đến quá trình sinh tinh, các gen có chức năng tế bào phổ biến như sửa chữa DNA, chuyển hóa xenobiotic, phân chia tế bào và điều hòa nội tiết đã được nghiên cứu. Khoảng 70% SNP được báo cáo nằm trong các gen có chức năng chung của tế bào nhưng được dự đoán có liên quan đến các tế bào mầm, như tế bào chết theo chương trình, hay còn gọi là "tế bào tự sát", quá trình sửa chữa DNA, giải độc các phân tử môi trường,...[36] Lúc đầu, một nhóm lớn các điểm đánh dấu đa hình đã được phát triển và áp dụng để sàng lọc bộ gen của những người đàn ông vô sinh từ gia đình để xác định các gen vô sinh như AURCK [14], SPATA16 [13] và DNAH1 [7]. Sau đó, sử dụng phép lai bộ gen so sánh dựa trên microarray (Array CGH) và các mảng đa hình đơn nucleotide (SNP), việc mất đoạn và lặp đoạn gen ngày càng được phát hiện. Một số gen bị mất đoạn đã được phát