Tài liệu Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc việt nam. (tt)

6 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2013 Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh 2. GS. TS. Phạm Quốc Long Phản biện 1:................................................. ............................................................... Phản biện 2: ................................................. ................................................. Phản biện 3: .................................................. ........................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại: ........................ Vào hồi: ............giờ, ngày ......tháng .............năm....... Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: 1. Thư viện Đại học Bách khoa Hà Nội. 2. Thư viện Khoa học Kỹ thuật Quốc Gia. 0 MỞ ĐẦU Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố sinh học cực mạnh được chiết xuất chủ yếu từ cá nóc độc, động vật biển và một số chủng vi sinh vật. Trong những năm gần đây, TTX đã được nghiên cứu sử dụng làm thuốc gây tê, gây mê,... ở nhiều nước như Canada, Mỹ, Trung Quốc.... Ở nước ta, Dư Đình Động và cộng sự nghiên cứu thành công việc sử dụng TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổ truyền để làm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành thử nghiệm trên các bệnh nhân cho kết quả khả quan [9]. Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học. Tuy nhiên, giá thành của sản phẩm TTX tổng hợp hóa học cao, độ tinh sạch thấp, không kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc độc. Vì vậy, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc độc hoặc động vật biển. Do hàm lượng TTX từ cá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới tách chiết được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao. Hơn nữa, trữ lượng của các loài cá nóc độc ngày càng giảm, trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng [93]. Gần đây, các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật đã mở ra một triển vọng mới trong công nghệ sinh học. Hướng nghiên cứu cho phép chủ động sản xuất TTX trong phòng thí nghiệm hoặc ở quy mô công nghiệp, độ tinh sạch cao, giảm được giá thành,... Xuất phát từ ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam”. * Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng được quy trình công nghệ từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết và xác định tính chất, độc tính TTX của vi khuẩn. 1 * Nội dung nghiên cứu: - Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam. - Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy vi khuẩn sinh TTX. - Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. - Xác định tính chất và độc tính của TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. * Những đóng góp mới của Luận án: Lần đầu tiên ở Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống về TTX từ vi khuẩn (từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từ vi khuẩn). CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TETRODOTOXIN Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao, có bản chất phi protein, khó bị phá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơ dị vòng, có cấu trúc lưỡng cực, có liên kết nội phân tử với hemilactal và được phân loại như là một hợp chất aminohydroquinazoline [23]. 1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX Tên tiếng Anh: Tetrodotoxin. Công thức phân tử : C11H17N3O8. Khối lượng phân tử: 319,28 g.mol−1 Các dẫn xuất tạo ra từ TTX: anhydrotetrodotoxin, 4-epitetrodotoxin, 6epitetrodotoxin, nor-tetrodotoxin, quinazolin, acid tetrodoic, .... 1.1.2. Đặc tính của TTX 2 1.1.2.1. Tính chất hóa lý của TTX a) Dạng tồn tại: TTX tồn tại ở dạng tinh thể hoặc dạng bột màu trắng, có khối lượng phân tử M=319,28 Da [2, 82]. b) Nhiệt độ nóng chảy: Tetrodotoxin có bản chất phi protein, không bị nhiệt phá huỷ, nấu chín hay phơi khô, sấy, độc chất vẫn tồn tại, không bị nóng chảy ở nhiệt độ 2000C [35; 82]. c) Độ hòa tan: TTX không tan trong dung môi hữu cơ, tan trong acid loãng, tan nhẹ trong nước. Không bền trong môi trường kiềm và môi trường acid mạnh [82]. d) Hấp thụ ánh sáng: TTX không hấp thụ ánh sáng hồng ngoại với λ=1690-2000 cm-1, không hấp thụ cực đại ở bước sóng trên 220nm trong vùng tử ngoại. TTX có cấu trúc lưỡng cực phù hợp với mọi tính chất hóa học của TTX [82]. 1.1.3. Cơ chế gây độc của Tetrodotoxin Sự vận chuyển những ion natri vào tế bào thần kinh là yếu tố cần thiết cho tính dẫn truyền xung trong sợi thần kinh, dễ bị kích thích và dẫn truyền dọc theo sợi trục. Thông thường tế bào sợi trục có nồng độ ion K+ cao, nồng độ Na+ thấp và có điện thế âm. Sự kích thích có hiệu quả dẫn đến luồng ion Na+ từ ngoài màng tế bào đi vào trong làm phát sinh điện thế hoạt động dương ở màng tế bào. Sự khử cực lan truyền dọc theo dây thần kinh, dòng ion Na+ qua màng tế bào chiếm kênh ion Na+ (một kênh chọn lọc những ion natri hơn là những ion kali theo thứ tự cường độ) [37]. 1.1.4. Ứng dụng của Tetrodotoxin 1.1.4.1. Một số ứng dụng của TTX Thứ nhất, Tetrodotoxin (TTX) có tác dụng kích thích hoạt động của hệ tuần hoàn, làm thay đổi nhịp tim, thay đổi trương lực của 3 thành mạch, dẫn đến sự thay đổi huyết áp [19]; Thứ hai, TTX làm giảm tính thấm của màng tế bào đối với việc vận chuyển ion Na+ mà không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển ion K+ [28]; Thứ ba, TTX được dùng để điều chế thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật [33]; Thứ tư, TTX còn được dùng như thuốc giảm đau, khi sử dụng TTX với liều lượng rất nhỏ có khả năng cắt cơn đau của những bệnh nhân ung thư gan ở giai đoạn cuối [71]; Thứ năm, nghiên cứu của Lesort cho thấy TTX có khả năng liên kết với protein của HIV, đặc biệt là gp-120, gp120 là thụ thể hay móc bám của HIV gắn được vào thụ thể tế bào người, đặc biệt là những tế bào Lympho T có thụ thể CD4, từ đó hệ gen của HIV không được chuyển vào trong tế bào... dẫn đến hệ gen của HIV không thể gắn được vào hệ gen của người và không làm tan tế bào người. Vì vậy, người bị nhiễm HIV không thể phát triển thành AIDS được. Đây chính là tín hiệu đáng mừng cho quá trình đi tìm thuốc điều trị căn bệnh thế kỷ HIV-AIDS [34]. 1.1.4.2. Một số tác dụng có hại của TTX TTX không chỉ có tác dụng có lợi, nó cũng như nhiều biệt dược khác, nếu sử dụng không đúng cách, đúng liều lượng hoặc đúng mục đích thì sẽ trở thành độc dược, tác hại khôn lường đến sức khoẻ con người. 1.1.4.3. Triển vọng ứng dụng TTX ở Việt Nam TTX là thành phần quan trọng trong các liệu pháp cai nghiện, chữa ung thư, HIV hoặc sử dụng làm thuốc giảm đau. Theo thống kê 6 tháng đầu năm 2012 của Bộ Lao động – Thương binh và Xã hội Việt Nam, có 171.400 người nghiện ma tuý đã được quản lý hồ sơ trong cả nước, con số thực tế khoảng hai lần số liệu thống kê, nghĩa là có khoảng gần 350.000 người nghiện ma túy trong cả nước [1]. Giả sử để 4 cai nghiện cho số người nghiện này; mỗi người sử dụng 02 viên thuốc biệt dược Thiên Thanh Hoàn trong một ngày và quá trình điều trị kéo dài trong 10 ngày thì nhà sản xuất phải sử dụng ít nhất 650 gam TTX để phối trộn cùng một số vị thuốc Đông y. Để sản xuất một lượng TTX như vậy, cần có ít nhất 65 tấn trứng cá nóc độc, hay khoảng 6.500 tấn cá nóc độc (trứng chiếm khoảng 5-10% trọng lượng cá nóc) [6, 9]. 1.2. NGUỒN THU NHẬN TETRODOTOXIN 1.2.1. Tetrodotoxin từ động vật biển Trên thực tế, TTX có ở nhiều động vật khác nhau như: bạch tuộc đốm xanh, ếch, cua Xanthid, ốc biển, cá bống vân mây, cá nóc, nhuyễn thể,.... TTX được phát hiện đầu tiên vào năm 1950 từ trứng của loài cá nóc ở Nhật Bản và được gọi là spheroidine [91]. Sau đó độc tố spheroidine được đổi lại tên là tetrodotoxin và được các nhà độc tố học dùng làm tên chung cho đến ngày nay. 1.2.2. TTX từ vi sinh vật biển Xu hướng sử dụng TTX cho y dược đang ngày càng phổ biến (chủ yếu cho sản xuất thuốc). Những năm trước đây, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc hoặc động vật biển. Do hàm lượng TTX từ cá nóc không cao (1kg trứng cá nóc độc có thể tách chiết được 0,01 g TTX) nên giá thành của TTX rất cao. Hơn nữa, trữ lượng của cá nóc cũng ngày càng giảm trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng. Để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học, nhưng phương pháp này rất phức tạp, khó kiểm soát chất trung gian do phải tổng hợp qua 15 bước [32]. Vì thế TTX tổng hợp hóa học có giá thành cao, không 5 kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc [61]. Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định có thể thu nhận TTX từ dịch nuôi cấy vi sinh vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau, trên các loại môi trường khác nhau. Các nghiên cứu trên là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm cũng như quy mô công nghiệp. 1.2.2.1. Đặc điểm của một số chủng vi khuẩn sinh TTX a) Chi Vibrio: Một số loài Vibrio sinh tetrodotoxin [51, 53, 55, 56, 96]. b) Chi Pseudomonas: Pseudomonas có khả năng sinh độc tố tetrodotoxin và những chất đồng phân với tetrodotoxin [27, 89]. c) Chi Pseudoalteromonas: Một vài loài có khả năng sản sinh ra độc tố, trong đó có P. haloplanktis, P. tetraodonis được phân lập từ nhím biển, có khả năng sinh tetrodotoxin [30]. d) Chi Micrococcus: Một số loài trong chi Micrococcus sinh tetrodotoxin [18]. e) Chi Shewanella: Chi Shewanella là vi khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, có khả năng di động, sống hiếu khí hay kỵ khí không bắt buộc, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy không cần bổ sung NaCl hay các tiền tố hữu cơ kích thích sự sinh trưởng [13, 43, 69]. 1.2.2.2. Một số phương pháp phân loại vi khuẩn hiện nay Trước đây, phân loại vi khuẩn được thực hiện chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa theo khóa phân loại Bergey, đòi hỏi thời gian dài, phân loại gặp rất nhiều khó khăn và thiếu chính xác. Gần đây, với kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, có thể xác định 6 trình tự các đoạn gen đặc hiệu trên phân tử ARN ribosom, ADN,... giúp phân loại và xác định nguồn gốc các loài vi khuẩn chính xác. Tuy nhiên, mỗi phương pháp truyền thống hay hiện đại đều có ưu nhược điểm khác nhau. Để khắc phục các nhược điểm của mỗi phương pháp phân loại, ngày nay, các nhà khoa học đã dùng kết hợp cả phương pháp phân loại truyền thống bằng cách sử dụng các bộ kit thử sinh hóa API và cải tiến các phương pháp phân tích sinh học phân tử như sử dụng kỹ thuật lai phân tử với các mẫu đầu dò đặc hiệu, kỹ thuật ADN microarray, ... để phân loại vi khuẩn một cách chính xác và thuận tiện cho mục đích sử dụng [8, 12, 22, 62, 75]. 1.3. CÔNG NGHỆ TÁCH TETRODOTOXIN TỪ CÁ NÓC CHIẾT VÀ TINH SẠCH 1.3.1. Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học Năm 1972, Kishi và cộng sự đã tổng hợp thành công TTX theo phương pháp hóa học. Quá trình tổng hợp này được bắt đầu từ dẫn xuất của benzoquinone và kết thúc bằng việc guanidyl hóa dihydrofuranamine phức tạp và sau đó là quá trình oxy hóa cắt liên kết đôi dihydrofuran, gắn nitrogen tự do vào vòng hemiaminal và khử acetyl. Kết quả là thu được TTX nhưng hoạt tính của TTX tổng hợp hóa học lại rất thấp, nó phụ thuộc vào góc quay cực trong quá trình tổng hợp [52]. 1.3.2. Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy thu nhận và tinh sạch TTX từ cá nóc độc còn gặp nhiều khó khăn do chưa chủ động được nguồn nguyên liệu (sản lượng khai thác cá nóc độc ngày càng giảm, hàm lượng TTX có trong các mô cá nóc phụ thuộc theo giai đoạn sinh trưởng, mùa vụ, vùng địa lý và theo loài). Vì vậy, hướng nghiên cứu 7 sinh tổng hợp TTX từ vi sinh vật là hướng đi triển vọng và bền vững, hứa hẹn đáp ứng được nhu cầu sử dụng TTX ngày càng tăng trong thực tiễn. 1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT Nhìn chung, hầu hết các nghiên cứu ở trên mới chỉ dừng ở công đoạn tách chiết, tinh sạch TTX phục vụ cho quá trình phân tích, xác định để nhận dạng TTX ở vi sinh vật [13, 14, 51, 93, 96]. Còn nghiên cứu của Deng Y và cộng sự (2008), của Yu Chung Him (2007) lại chỉ chú ý tìm điều kiện nuôi cấy vi khuẩn sinh TTX hàm lượng cao nhất mà không nêu hàm lượng TTX thu được từ các công đoạn tách chiết, tinh sạch [16, 94]. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng 2.1.1.1. Cá nóc độc: Ba loài cá nóc độc Việt Nam thuộc nhóm có độc tính mạnh, sản lượng lớn: Cá nóc vằn Takifugu oblongus; Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus; Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris. 2.1.1.2. Vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật được phân lập từ 4 mô (trứng/tinh sào, gan, ruột, da và thịt) của ba loài cá nóc độc Việt Nam: cá nóc vằn, cá nóc xanh chấm cam và cá nóc đầu thỏ mắt to. 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Hải sản, Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường ĐHBK Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Việt Nam, Đại học Kitasato - Nhật Bản. 8 2.1.3. Hóa chất và môi trường nghiên cứu 2.1.3.1. Hóa chất: Các hoá chất có nguồn gốc từ các hãng như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Wako (Nhật), Bio-rad (Mỹ). 2.1.3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường Marine dịch thể, môi trường TYP dịch thể, môi trường ORI dịch thể, môi trường Zobell dịch thể, môi trường TCBS dịch thể, môi trường MT1, môi trường MT2. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp xác định độc tố của 3 loài cá nóc độc bằng HPLC: Phân tích độc tố TTX bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Kodama và Shigeru SATO (2005) [41]. 2.2.2. Phương pháp phân tích, xác định tính chất của TTX từ cá nóc Việt Nam làm tiền đề kiểm chứng TTX từ vi sinh vật 2.2.2.1. Phương pháp tách chiết 2.2.2.2. Phương pháp phân tích trên LC-MS: Dung dịch thu được sau khi giải hấp khỏi than hoạt tính được định mức thể tích, sau đó lấy một lượng nhỏ đem chiết pha rắn với SPE C18 và đưa vào máy LC-MS [80]. Detector MSD Ion trap với chế độ quét tự động và bẫy mảnh ở Positive, mảnh bẫy được chọn là 320. 2.2.2.3. Phương pháp xác định tính chất của TTX: TTX kết tinh được đem hòa tan trong dung môi 4%CD3COOD/D2O. Đo phổ cộng hưởng từ nhân trên máy Bruker, tần số 500MHz, các phổ đo được là 1H, 13C, COSY, NOESY, HMBC, ... 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật trên 4 bộ phận của 3 loài cá nóc đã lựa chọn 2.2.3.1. Thu thập mẫu: Ba loài cá nóc độc biển Việt Nam thường bắt gặp là Lagocephalus lunaris, Torquigener pallimaculatus, Takifugu oblongus được thu thập tại Cát Bà- Hải Phòng, Nha 9 Trang-Khánh Hòa. 2.2.3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ mô cá nóc: Theo phương pháp pha loãng tới hạn (nồng độ pha loãng 10-1, 10-2,). 2.2.4. Phương pháp phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX 2.2.5. Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy vi khuẩn sản sinh TTX 2.2.6. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh TTX: Thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch trực giao cấp 2, tối ưu hóa khả năng sinh độc tố của chủng được lựa chọn theo phương pháp lên dốc của Box-Wilson [10]. 2.2.7. Các phương pháp thực hiện nội dung nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi vi khuẩn 2.2.7.1. Tách chiết độc tố TTX từ ngoại bào của dịch nuôi vi khuẩn: Trên cơ sở phương pháp của Yu Chun-Fai và cộng sự có cải tiến [93]. 2.2.7.2. Phương pháp tách tạp chất khỏi dịch độc tố thô bằng than hoạt tính 2.2.7.3. Nghiên cứu tinh sạch độc tố TTX bằng sắc ký lọc gel: Tiến hành tinh sạch độc tố bằng sắc ký lọc gel Bio-gel P2. 2.2.7.4. Nghiên cứu tinh sạch độc tố TTX bằng sắc ký lọc ái lực BioRex 70: Các thí nghiệm đã được tiến hành bằng sắc ký ái lực Bio- Rex 70. 2.2.7.5. Phương pháp phân tích định tính TTX bằng sắc ký bản mỏng (TLC): Phân tích TTX bằng TLC theo phương pháp của Chun-Fai Yu và cộng sự (2004). 2.2.8. Phương pháp phân tích xác định độc tính của TTX từ vi sinh vật 2.2.8.1. Phương pháp phân tích xác định tính chất TTX: Sử dụng 10 phương pháp sắc ký lỏng cao áp nối ghép khối phổ và detector tử ngoại để xác định thành phần các chất trong mẫu [82]. 2.2.8.2. Phương pháp kiểm tra độc tính cấp của TTX Xác định LD50 của chế phẩm TTX trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfiel – Wilcoxon được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Y Hà Nội [36]. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐ TTX CỦA CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 3.1.1. Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá nóc độc Số liệu bảng 3.1 và 3.2 cho thấy: - Trong mùa sinh sản, tổng hàm lượng độc tố TTX ở cá thể cái của cả ba loài đều cao hơn ở cá thể đực. Tuy nhiên, hàm lượng độc tố TTX ở mỗi loài khác nhau thì khác nhau. Loài nóc vằn, tổng hàm lượng TTX ở cá thể cái cao gấp 3,8 lần ở cá thể đực. Loài nóc xanh chấm cam có hàm lượng TTX ở cá thể cái cao gấp 1,4 lần ở cá thể đực. Loài nóc đầu thỏ mắt to có hàm lượng TTX ở cá thể cái cao gấp 2 lần ở cá thể đực. - Tổng hàm lượng độc tố TTX ở loài nóc xanh chấm cam là cao nhất và thấp nhất là nóc thỏ mắt to. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Văn Lệ khi phân tích được độc tính của 46 loài cá nóc Việt Nam và sắp xếp loài nóc xanh chấm cam đứng thứ nhất trong nhóm 10 loài cá nóc độc rất mạnh, sau đó đến loài nóc vằn, rồi mới đến loài nóc đầu thỏ mắt to [6]. 11 - Ở cá nóc độc, hàm lượng độc tố TTX của các mô khác nhau có sự khác biệt, phụ thuộc vào loài, giới tính theo một quy luật chung như sau: Ở cá thể cái: Trứng có hàm lượng TTX cao nhất, sau đến gan, ruột, da và thấp nhất là ở mô thịt. Ở cá thể đực: Gan có hàm lượng TTX cao nhất, sau đến ruột, da, tinh sào và thấp nhất là mô thịt. Từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.1, các cá thể cá nóc cái được lựa chọn để thu nhận các mô làm vật liệu phân lập vi sinh vật có khả năng sinh TTX. 3.1.2. Nghiên cứu xác định tính chất TTX từ mẫu cá nóc độc Việt Nam 3.1.2.1. Phân tích TTX từ mẫu cá nóc Việt Nam trên HPLC Trên phương pháp phân tích đã xây dựng được, tiến hành phân tích mẫu cá nóc trên hệ máy sắc kí lỏng HPLC-MS với mỗi phân đoạn thu được trước và sau khi giải hấp khỏi cột Amberlite IRC-50 và than hoạt tính nhằm định hướng quá trình tách. Để so sánh, sử dụng mẫu TTX chuẩn (Wako) làm mẫu đối chứng. Sắc kí đồ thu được của dịch chiết mẫu cá nóc và TTX chuẩn có đỉnh ở thời gian lưu 4,6 phút trùng giữa TTX chuẩn và TTX tách ra được từ cá nóc. 3.1.2.2. Xác định tính chất TTX từ mẫu cá nóc Việt nam Chất tách ra được từ quy trình chiết tách là tinh thể màu trắng, hóa đen ở nhiệt độ lớn hơn 220oC. C11H17N3O8, M = 319. Kết hợp các dữ kiện phổ thu được cùng với các tài liệu đã công bố trước cho phép kết luận chất tách được từ cá nóc Việt Nam là tetrodotoxin ở dạng hemilactal [82, 84]. 12 3.2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM Bảng 1 (Bảng 3.4. Luận án). Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại môi trường từ 3 loài cá nóc Loài cá nóc Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên các môi trường khác nhau ORI TCBS MT1 MT2 L.lunaris 28 18 8 16 T.pallicumatus 22 4 0 0 T.oblongus 13 10 8 3 Tổng số Tổng số chủng sinh TTX Tỷ lệ % chủng sinh TTX 63 32 16 19 13 5 3 3 54,2 20,8 12,5 12,5 Kết quả phân tích định lượng 24 chủng vi sinh vật sinh TTX, có đến 10 chủng sinh hàm lượng TTX cao nhất, nhưng chủng M60 không phải là vi khuẩn nên chỉ lựa chọn 9 chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh TTX hàm lượng cao nhất để tiến hành nghiên cứu phân loại bằng hình thái và sinh học phân tử. 13 Bảng 2 (bảng 3.8. Luận án). Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao Stt Kí Mô Kết quả phân loại hiệu phân Phân loại theo hình Phân loại sinh học phân chủng lập thái tử 1 M3 Trứng Chi Vibrio Vibrio rumoiensis 2 M6 Trứng Chi Psychrobacter Psychrobacter nivimaris 3 M8 Ruột Chi Micrococcus Micrococcus alkanovora 4 M10 Gan Chi Pseudomonas Pseudomonas fragi 5 M19 Trứng Chi Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas issachenkonii 6 M28 Trứng Chi Vibrio Vibrio rumoiensis 7 M30 Ruột Chi Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas antartica 8 M37 Trứng Chi Shewanella Shewanella baltica 9 M43 Gan Chi Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas gracilis Trong số 9 loài vi khuẩn sinh TTX hàm lượng cao có 4 loài phân lập được từ mô trứng (có hai chủng trùng lặp là M3 và M28), 2 loài từ mô gan, 2 loài từ mô ruột. Kết quả này cho thấy tỷ lệ loài vi khuẩn sinh TTX ở mô cá nóc độc, nhiều nhất là mô trứng, sau đến mô gan, mô ruột. Ở các mô thịt, mô da cũng phân lập được khá nhiều chủng vi sinh nhưng chủng sinh hàm lượng TTX cao lại chưa được phát hiện trong nghiên cứu này. 14 3.3. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VI KHUẨN SẢN SINH TTX 3.4. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX Sơ đồ quy trình nuôi cấy chủng M37 sau tối ưu hóa Chủng giống được bảo quản lạnh sâu -800C Chủng Shewanella baltica M37 Hoạt hóa giống - Môi trường thạch ORI - T0: 25 0C - Thời gian: 24 giờ Giống cấp 1 - Môi trường lỏng ORI - T0: 25 0C - Thời gian: 36 giờ - Lắc 200 vòng/phút - Môi trường lỏng ORI - T0: 24,6 ± 0,5 0C - Thời gian: 3,7 ngày (89-90 giờ) - Tốc độ khuấy 200 vòng/phút - Tỷ lệ giống: 2% - pH ổn định 6,3 - Bổ sung 7,3% mô trứng cá nóc độc Lên men Dịch nuôi chứa TTX Các bước thảo luận quy trình: - Bước 1: Sau khi phân lập chủng M37 thuần chủng từ cá nóc độc Việt Nam, theo kết quả phân loại, chủng M37 được định danh đến loài là Shewanella baltica. Chủng này được nuôi sinh khối, bảo quản giống trong 30% glixerol ở -80 0C. 15 - Bước 2: Chủng giống M37 được đưa ra hoạt hóa trên đĩa thạch ORI, nuôi ủ trong 24 giờ ở 25 0C. - Bước 3: Lấy khuẩn lạc sạch trên đĩa thạch ORI, nuôi cấy lượng giống trong môi trường ORI lỏng, thời gian ủ là 36 giờ, ở nhiệt độ 25 0C, chế độ nuôi lắc. - Bước 4: Sử dụng sinh khối giống hoạt hóa lần 2 cho quá trình lên men 5 lít/mẻ trong môi trường lỏng ORI, nhiệt độ 24,6± 0,5 0C, thời gian lên men là 3,7 ngày (89-90 giờ), với tốc độ khuấy 200 vòng/phút, tỷ lệ cấp giống là 2%, pH ổn định tại 6,3 bằng đệm phosphat, có bổ sung 7,3% mô trứng cá nóc độc. - Bước 5: Dịch nuôi vi khuẩn được sử dụng cho các quá trình tách chiết, tinh sạch TTX. 16 3.5. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ DỊCH NUÔI VI KHUẨN M37 Quy trình tách chiết TTX từ dịch nuôi vi khuẩn Dịch nuôi vi khuẩn Shewanella baltica M37 chứa TTX Ly tâm 5.000 v/phút trong 15 phút Sinh khối tế bào Dịch nổi Đun cách thủy Ly tâm Cô chân không Dịch cô đặc chứa TTX 17 1% Axit axetic 10 phút 10.000 v/phút trong 15 phút Các bước thực hiện quy trình tách chiết TTX từ dịch nuôi vi khuẩn: Bước 1: Dịch nuôi của chủng Shewanella baltica M37 thu nhận sau 89 giờ nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp. Bước 2: Ly tâm tách dịch ngoại bào và sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi, bỏ cặn tế bào. Bước 3: Phần dịch nổi sau ly tâm được bổ sung 1% axit axetic. Bước 4: Đun cách thủy 10 phút. Làm mát đến nhiệt độ phòng. Bước 5: Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi, bỏ cặn protein Bước 6: Cô chân không giảm thể tích còn 1/10 lần thể tích ban đầu. Bước 7: Thu nhận dịch độc tố TTX thô. 18