Tài liệu Nghiên cứu cố định tế bào và ứng dụng trong lên men etanol từ rỉ đường bằng phương pháp liên tục (tt)

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ethanol (rượu cồn) chiếm một vị trí khá quan trọng trong công nghiệp thực phẩm nói riêng và các ngành kinh tế nói chung. Một trong các chiến lược cải tiến quá trình lên men ethanol là áp dụng kỹ thuật cố định tế bào để thu được quá trình lên men có năng suất và hiệu suất cao. Trong số các chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men ethanol thì ca-alginate được sử dụng rộng rãi nhất. Việc kết hợp giữa cố định tế bào và quá trình lên men liên tục trong sản xuất cồn là hướng đi mới, có nhiều triển vọng và áp dụng vào thực tiễn sản xuất để giúp nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất cồn từ rỉ đường. Với những ý nghĩa đó chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu cố định tế bào và ứng dụng trong lên men etanol từ rỉ đường bằng phương pháp liên tục”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Xác định được công nghệ thích hợp tạo giá thể để cố định tế bào nấm men và các điều kiện thích hợp lên men dịch rỉ đường bằng nấm men cố định. 2.2. Xác định được các thông số công nghệ cơ bản của quá trình lên men liên tục, sử dụng nấm men cố định. 2.3. Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm cồn etylic bằng phương pháp lên men liên tục nhờ tế bào cố định trên mô hình thiết bị. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng phương pháp cố định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên men cao 3.2. Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào 3.3. Nghiên cứu công nghệ lên men ethanol nhờ tế bào cố định trên môi trường rỉ đường 3.4. Xây dựng quy trình lên men ethanol từ rỉ đường theo phương pháp lên men liên tục nhờ tế bào cố định 3.5. Nghiên cứu xử lý hạt tế bào nấm men để giữ hoạt lực lên men cho quá trình lên men liên tục 3.6. Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm cồn etylic ở qui mô pilot 4. Những đóng góp mới của luận án 1 Nội dung nghiên cứu của luận án là một phần thực hiện quan trọng trong Đề tài cấp Nhà nước: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất etanol từ rỉ đường bằng phương pháp cố định tế bào trong hệ thống lên men liên tục”. Chính vì vậy, nội dung của luận án có những đóng góp mới cho khoa học công nghiệp, thể hiện tính cấp thiết phục vụ cho sản xuất thời điểm hiện nay. Điểm mới cụ thể như sau: Hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men là rất tốt; Quá trình lên men liên tục trong sản xuất cồn từ rỉ đường mía sử dụng tế bào nấm men cố định hoạt động tốt nhất ở tốc độ pha loãng 0,154 l/l/giờ, với nồng độ đường 210 g/l và ổn định trong khoảng thời gian đến 40 ngày với nồng độ ethanol duy trì trung bình khoảng 10,8 %v/v. Đã xây dựng mô hình và tiến hành sản xuất thử nghiệm tạo được 13.250 lít sản phẩm, chất lượng cồn đạt tiêu chuẩn cồn thực phẩm. Dùng phương pháp lên men liên tục nhờ tế bào cố định đã lợi về mặt đầu tư thể tích thiết bị cũng như lượng nhân giống tế bào ít hơn so với lên men gián đoạn tế bào tự do. 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 133 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1. Tổng quan tài liệu (37 trang); Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp (09 trang); Chương 3. Kết quả và thảo luận (59 trang với 48 bảng và 17 hình); Kết luận và kiến nghị (03 trang); Danh mục các công trình công bố (01 trang); Tài liệu tham khảo (10 trang gồm 21 tài liệu tiếng Việt, 85 tài liệu tiếng Anh và 18 tài liệu từ mạng). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Một số nét chấm phá về cồn etylic: Định nghĩa; Sơ đồ quy trình sản xuất etylic từ rỉ đường; Yêu cầu chất lượng và các vấn đề về nấm men trong sản xuất cồn etylic; Rỉ đường dùng để sản xuất cồn etylic. 1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cồn trên thế giới và Việt Nam 1.3. Vấn đề cố định nấm men trên giá thể và các phương pháp cố định: Định nghĩa về cố định tế bào ; Các phương pháp cố định tế bào nấm men; Các kỹ thuật cố định tế bào ; Chất mang alginate; Một số chất mang khác 1.4. Các phương pháp lên men và một số yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên men: Phương pháp lên men gián đoạn; Phương pháp lên men bán liên tục; Phương pháp lên men liên tục 1.5. Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất cồn trên thế giới và ở việt nam 2 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Chủng vi sinh vật Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae kí hiệu CNTP 7022; CNTP 7028; CNTP 7043; CNTP 7077; CNTP 7079; CNTP 7081; CNTP 7083; CNTP 7189; NM3 và NM5 hiện đang lưu giữ trong sưu tập giống vi sinh vật của Viện Công nghiệp thực phẩm. 2.1.2.Rỉ đường - Rỉ đường mía của một số nhà máy đường đã được thu thập: Quảng Ngãi, Nông Cống, Lam Sơn, Tam Hiệp. 2.1.3. Hóa chất - Alginate: hãng Sigma (Mỹ) - Sigma – Aldrich. Nó có các thông số: CAS 9005-38-3 180947-500G; Aldrich Chemistry; Batch # : MKBB 8171. Màu hơi vàng, dạng bột. Độ nhớt : 20000-40000 cps - Các loại hóa chất nuôi cấy vi sinh vật, phân tích của Đức, Mỹ, Trung Quốc... 2.1.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trường nhân giống sinh khối: Glucoza 60g/l; (NH4)2SO4 3g/l; MgSO4.7H2O 1g/l; K2HPO4 0,6g/l; Cao nấm men 5g/l. - Môi trường lên men|: Rỉ đường được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1: 2, xử lý về axit về pH 4,5 và gia nhiệt bằng cách đun sôi trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng tách cặn.. Rỉ đường sau xử lý được đưa về 26oBx tương đương 210g/l đường, bổ sung dinh dưỡng (NH4)2SO4 3g/l, K2HPO4 0,6 g/l, MgSO4.7H2O 1g/l, chỉnh về pH 4,5. - Tế bào nấm nấm men cố định được rửa sạch cặn rỉ đường trong dung dịch NaHCO3 0,5%. Môi trường hoạt hóa: Glucoza 60 g/l, urê 0,5 g/l, KH2PO4 0,5 g/l. 2.2.Thiết bị và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị Thiết bị lên men dung tích 2l, máy bơm định lượng, thiết bị tạo hạt do viện Công nghiệp thực phẩm thiết kế và chế tạo. Chiết quang kế (Nhật Bản); Cân phân tích Shimadzu BW320D (Nhật Bản). Nồi hấp Tomy SS – 325 (Nhật Bản). Máy lắc Shel Lab (Nhật Bản), máy đo pH (Nhật Bản). Tủ sấy vô trùng Esco (Nhật Bản), tủ ấm nuôi cấy Sanyo (Nhật Bản), tủ sấy Sanyo (Nhật Bản), tủ cấy; Kính hiển vi Nikon (Nhật Bản). Bộ cất cồn phòng thí nghiệm Salleron Dujardin (Pháp). Máy đo mật độ quang UV- 1650PC Shimadzu(Nhật Bản) 3 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu * Cố định tế bào nấm men cố dịnh trọng hạt Ca- Alginate Sinh khối nấm men được trộn đều khuấy 30 phút với dung dịch Na Alginate (đã thanh trùng 110oC/30 phút) theo tỉ lệ nhất định để được nồng độ tế bào mong muốn từ 106 - 1010 tế bào/ml alginate gel; hỗn hợp được khuấy đều trên máy khuấy từ và sau đó đưa vào bình chứa và tiến hành tạo hạt gel nhờ bơm định lượng qua hệ thống tạo hạt gồm 24 lỗ kim. Ở đây dung dịch tế bào/ Na Alginate từ các kim tạo hạt chảy vào bình đựng CaCl2 có nồng độ đã định và gel hóa ngay lập tức. *Lên men liên tục Hệ thống gồm 6 bình tam giác (F1, F2, F3, F4, F5, F6) dung tích 1 lít được nối với nhau theo nguyên tắc chảy tràn, mỗi bình có thể tích 1 lít. pH ban đầu 4,5. Nhiệt độ lên men 30°C. Tốc độ pha loãng thay đổi dần từ 0,128 l/l/giờ. Tế bào nấm men chủng CNTP 7028 được cố định trong hạt gel Ca-alginat đạt khoảng 109CFU/g hạt. Tỉ lệ hạt tế bào nấm men cố định/thể tích bình lên men 30 %w/v. Bình thu sản phẩm được giữ lạnh 4°C. 2.2.3. Phân tích: dùng các phương pháp hóa, lý - Quan sát trạng thái nấm men; Xác định pH bằng máy WTW 720 của Đức - Xác định tế bào nấm men nhờ buồng đếm Thomas - Xác định lượng tế bào sống trên hộp thạch Petri; Xác định pH - Xác định hàm lượng chất khô: nhờ chiết quang kế cầm tay (refractometer – Đức). - Xác định nồng độ cồn . Hình 2.3. Bộ cất cồn phòng thí nghiệm Salleron Dujardin của Pháp - Xác định mật độ tế bào nấm men bằng máy so màu - Xác định lượng vi khuẩn hiếu khí có trong dịch lên men - Phân tích đường khử theo phương pháp Graxianop; NelsonSomogi ; Phương pháp xác định tổng lượng chất keo trong rỉ đường ; 4 Phương pháp xác định lực đệm của rỉ đường; Phương pháp xử lý rỉ đường - Tính hiệu suất lên men Tính theo lượng cồn thu được trong thực tế chia cho lượng cồn nhận được theo lý thuyết và biểu thị theo phần trăm. Lượng cồn tính được theo lý thuyết tính theo phương trình Gaylussac: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2CO2 180 92,1 88 Nếu tính cho 100 kg đường đôi thì nhân với hệ số 1,0526. Lượng cồn thu được từ 100 kg đường đôi tính theo lý thuyết là 68,2 lít hoặc 53,83 kg. a: Nồng độ rượu thu được của dịch lên men (%v/v) b: Thể tích dịch lên men (lít) c: lượng đường đem đi lên men (gam/lít) d: lượng đường sót (%) 0,79 : khối lượng riêng của cồn Hiệu suất chuyển hóa (HSCH) = (a x b x 0,79)/ [( c-d) x 92/180 )] Hiệu suất lên men (HSLM) = (a x b x 0,79)/ ( c x 92/180 ) - Tính tốc độ pha loãng và sản lượng cồn Tốc độ pha loãng Trong nuôi cấy liên tục thể tích bình nuôi cấy được giữ không đổi. Dòng môi trường đi vào được bù bởi dòng dịch nuôi cấy đi ra với cùng tốc độ. Ta gọi: Thể tích hữu dụng của 1 bình phản ứng là V (lít) Tốc độ dòng môi trường dinh dưỡng đi vào là F (l/giờ) Tốc độ pha loãng là D (l/l/giờ) Khi đó: D = F/V Tính toán sản lượng cồn thu được Sản lượng cồn thu được được tính theo công thức: P = (F x C)/V Trong đó: P : Là sản lượng cồn thu được (g/l/giờ hoặc độ/l/giờ) F: Tốc độ dòng chảy (l/l/giờ) C: Nồng độ cồn ở trạng thái ổn định (g/l hoặc độ/l) V : Thể tích bình lên men (lít) 5 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng phương pháp cố định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên men cao 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu rỉ đường Rỉ đường lấy từ 4 nhà máy sản xuất đường là: Nhà máy đường Nông Cống, Tam Hiệp, Lam Sơn, Quảng Ngãi được xác định các chỉ tiêu về cảm quan, thành phần hóa học và mức độ nhiễm tạp. Bảng 3. 1. Thành phần hóa học và mức độ nhiễm tạp vi sinh vật của 4 loại rỉ đường Chỉ tiêu Nồng độ chất khô (oBx) pH Hàm lượng đường tổng (%) Hàm lượng đường khử (%) Nitơ tổng số (%) Chất keo (%) Lực đệm Vi sinh vật tổng số (CFU/g) Nông Cống 80,0 Rỉ đường từ các nhà máy Tam Hiệp Lam Sơn Quảng Ngãi 75,0 79,3 78,5 4,5 56,9 4,75 49,0 4,70 55,6 4,5 52,3 27,0 23,2 25,4 24,3 0,73 0,65 0,68 0,68 2,9 Cao 3,8 x 105 3,5 Cao 7x 105 3,0 Cao 5,2x105 3,2 Cao 6,5x105 Kết quả cho thấy thành phần hóa học của rỉ đường Nông Cống có chất lượng tốt nhất trong số các mẫu nghiên cứu. Hàm lượng chất khô, hàm lượng đường tổng, đường khử và nitơ tổng số cao nhất, đặc biệt hàm lượng chất keo thấp nhất và là loại rỉ đường rất phù hợp với tiêu chuẩn rỉ đường sử dụng cho lên men cồn, là một lợi thế giúp tăng hiệu suất lên men bằng tế bào cố định. Hệ số thuần khiết của rỉ đường Nông Cống là 71,12 % trong khi đó của rỉ đường Tam Hiệp, Lam Sơn, Quảng Ngãi lần lượt là 65,33%; 70,11%; 66,62%. Chúng tôi lựa chọn rỉ đường của nhà máy đường Nông Cống làm nguồn nguyên liệu cho quá trình lên men cồn bằng tế bào nấm men cố định. 3.1.2. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên men cao. 6 3.1.2.1 Sơ tuyển các chủng nấm men có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trong môi trường chứa 200 g đường/l có trong rỉ đường. Để lựa chọn chủng có khả năng lên men tốt ở nồng độ đường cao, 10 chủng nấm men S. cerevisiae trong sưu tập giống vi sinh vật của viện Công nghiệp thực phẩm được lên men trong bình engol có chứa 200 g/l đường có trong dịch rỉ đường, bổ sung dinh dưỡng (NH4)2SO4 3g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4 0,5 g/l, cao nấm men 5 g/l. Nhiệt độ lên men 300C. Kết quả cho thấy, 8 chủng nấm men kí hiệu CNTP 7022; CNTP 7028; CNTP 7043; CNTP 7077; CNTP 7079; CNTP 7081; CNTP 7083 và CNTP 7189 đều có khả năng lên men rất tốt trong môi trường có nồng độ đường 200g/l. Riêng 2 chủng nấm men ký hiệu NM 3 và NM 5 lên men yếu hơn hẳn, sau 24 giờ lên men, cột dịch trong bình engol vẫn không bị đẩy hết. 3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men trong điều kiện nấm men bị nhốt trong lớp chất mang 4 chủng nấm men CNTP 7043, CNTP 7028, CNTP 7081 và CNTP 7022 đã được chọn trong nghiên cứu trên được cố định tế bào và tiến hành lên men trên môi trường rỉ đường có nồng độ đường 200 g/ll. Bảng 3.3. Năng lực lên men của các chủng nấm men trong điều kiện cố định tế bào CNTP 7028 Chỉ tiêu Đường dư (%) Nồng độ ethanol (%V) Hiệu suất chuyển hóa (%) Hiệu suất lên men (%) Nồng độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) 1,2 11,0 CNTP 7043 Các chủng nấm men CNTP 7081 CNTP 7022 Dịch sau lên men 8 ngày 1,9 1,8 9,4 10,1 2,2 9,2 90,45 80,28 85,79 79,89 85,02 72,66 78,05 71,11 5,7 6,7 6,0 6,6 Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy chủng CNTP 7028 có tốc độ lên men lớn nhất so với các chủng nấm men khác ngay từ những ngày đầu lên men và đạt hiệu suất chuyển hóa cao (90,45%), hiệu suất lên men 7 cao nhất 85,02%, tương ứng nồng độ ethanol tương đương là 11%v. Dựa vào kết quả thực nghiệm và qua so sánh chỉ tiêu giữa các chủng, chúng tôi chọn chủng nấm men CNTP 7028 cho việc thực hiện lên men cồn nhờ tế bào cố định trên môi trường rỉ đường. 3.1.3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu sinh khối nấm men cho việc cố định tế bào 3.1.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy tạo sinh khối cao nhất a. Ảnh hưởng của nồng độ glucoza: Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ glucoza 20, 40, 60 và 80 g/l. Sinh khối 24 giờ tuổi của chủng . Căn cứ vào thực nghiệm thì nồng độ glucoza 60g/l được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ: Môi trưởng nhân sinh khối chứa glucoza 60g/l, cao nấm men 5g/l và một trong hai nguồn nitơ với nồng độ 0,3% là (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4. Mẫu đối chứng không bổ sung nitơ. Tiến hành lên men ở 300C, chế độ lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sự có mặt của nitơ trong môi trường nuôi cấy hết sức cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Trong hai nguồn nitơ được sử dụng, (NH4)2SO4 cho sinh khối cao hơn (NH4)2HPO4. Vì vậy, chúng tôi chọn nguồn nitơ (NH4)2SO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Tiếp tục nghiên cứu chọn nồng độ (NH4)2SO4 được bổ sung trong khoảng từ 1-5g/l. Mẫu đối chứng không bổ sung (NH4)2SO4. Ở nồng độ (NH4)2SO4 3g/l, lượng sinh khối thu được là lớn nhất (OD = 0,220). c. Ảnh hưởng của cao nấm men: Dựa vào kết quả thực nghiệm thì nồng độ cao nấm men 5g/l được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. d Ảnh hưởng của photpho: Mẫu đối chứng là môi trường không bổ sung photpho. Bổ sung nguồn photpho bổ sung là K2HPO4 ở các nồng độ thay đổi từ 0,2 đến 1g/l. Kết quả thực nghiệm cho thấy, sinh khối tạo thành đạt cao nhất và lượng đường dư đạt mức thấp nhất với nồng độ K2HPO4 0,6 g/l. Vì vậy, nồng độ này được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận được lượng sinh khối cao a. Ảnh hưởng của tốc độ lắc : Tốc độ lắc được thay đổi từ 150 vòng /phút; 200 vòng /phút và 250 vòng/phút; mẫu đối chứng để tĩnh. Thực nghiệm cho thấy lượng sinh khối phụ thuộc đáng kể vào 8 tốc độ lắc. Lượng sinh khối thu được tăng lên khi tăng tốc độ lắc và đạt cao nhất là 0,32 với tốc độ lắc 250 vòng/phút. Với tốc độ lắc 250 vòng/phút lượng đường dư là thấp nhất. Điều này chứng tỏ tăng tốc độ lắc tạo điều kiện cho oxy hòa tan nhiều hơn giúp cho sinh trưởng và phát triển của nấm men tốt hơn. b. Động học của quá trình sinh trưởng Trong khoảng thời gian nuôi từ 0 đến 24 giờ, lượng sinh khối thu được tăng lên còn lượng đường trong môi trường thì giảm xuống. Trong 16 giờ đầu nấm men sinh trưởng và phát triển mạnh và sinh khối gần như đạt mức cực đại, lượng đường trong môi trường cũng gần cực tiểu, sau đó lượng sinh khối tăng chậm 3.1.3.3.Nghiên cứu phương pháp thu hồi, làm sạch sinh khối thích hợp cho cố định tế bào a. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới lượng sinh khối nấm men thu được: Tiến hành ly tâm 200 ml dịch lên men ở các tốc độ thay đổi lần lượt là 4000; 6000; 8000; 10.000 vòng/ phút trong 5 phút. Sau khi gạn bỏ phần dịch trong, lượng sinh khối được xác định bằng phương pháp cân trọng lượng tươi. Thực nghiệm cho thấy, lượng sinh khối nấm men thu được cao nhất khi tiến hành ly tâm ở tốc độ 8000 - 10000 vòng/phút (lượng sinh khối đạt 68,20 - 68,24 g/l). Ở tốc độ ly tâm 4000 vòng/phút, lượng sinh khối thu được chỉ đạt 65,42 g/l. b.Ảnh hưởng của tỉ lệ nước rửa/ sinh khối nấm men đến độ sạch của sinh khối thu được Sinh khối thu hồi được hòa lại trong nước cất vô trùng để rửa sạch với tỉ lệ nước rửa: sinh khối là 2:1. Tiến hành rửa 1 - 4 lần để xác định mức độ sạch của sinh khối thu được. Sau 3 lần rửa sinh khối bằng nước cất, nước rửa có giá trị OD thấp nhất và hầu như không giảm nữa ở lần rửa thứ 4 (OD của dịch rửa 0,150 - 0,146). 3.2. Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào 3.2.1. Nghiên cứu lựa chọn loại chất mang Chúng tôi khảo sát một số loại chất mang như alginate, alginate kết hợp với xanthan gum (bổ sung xanthan gum với tỷ lệ 0,5%) và kcarrageenan, nồng độ chất mang là 3%. Kết quả nhận được trong bảng 3.6 cho thấy lên men bằng phương pháp cố định tế bào trên chất mang alginate là tốt nhất, lượng CO2 thoát ra lớn hơn các chất mang khác ngay từ những ngày đầu lên men 9 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chất mang đến khả năng lên men Chỉ tiêu Alginate Alginate Xanthan gum k-Carrageenan Đường dư (%) 1,8 1,5 2,2 Nồng độ ethanol (%v/v) 10,9 10,8 10,3 Hiệu suất chuyển hóa (%) 87,75 85,61 84,69 Hiệu suất lên men (%) 80,23 79,49 75,81 5,6 5,9 175 Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) Nồng độ ethanol nhận được sau 8 ngày lên men cao hơn (10,9%v) và hiệu suất chuyển hoá trong quá trình lên men cũng cao hơn (87,75%). Đặc biệt lượng tế bào thoát ra ngoài hạt ít hơn, chứng tỏ khả năng nhốt giữ hạt tốt. Chọn alginate cho các nghiên cứu tiếp. 3.2.2. Nghiên cứu thông số công nghệ cố định tế bào 3.2.2.1. Lựa chọn nồng độ chất mang Na - Alginate Tiến hành làm thí nghiệm với các mẫu có nồng độ Na - Alginate khác nhau thay đổi từ 2% đến 4%. Từ thực nghiệm kết quả nhận thấy rằng, với nồng độ chất mang là 3% sẽ thu được nồng độ ethanol cao (11,0% v/v), lượng đường sót thấp (0,8%), hiệu suất chuyển hóa cao (84,18%). Gilson C.D& cộng sự (1995) cho rằng khi nồng độ alginate trong hạt gel dao động trong khoảng 1-5%(w/v) thì sẽ ít ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men cố định . 3.2.2.2. Lựa chọn nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2 Nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2 được thay đổi từ 1% đến 5%. Các điều kiện khác của thí nghiệm được giữ nguyên như các thí nghiệm trước. Với nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2 2% quá trình lên men diễn ra mãnh liệt hơn, lượng CO2 thoát ra luôn lớn hơn so với các mẫu khác trong một quá trình lên men, thu được nồng độ ethanol cao (11,2% v/v), lượng đường sót thấp (1,0%), hiệu suất chuyển hóa cao (86,57%). Các tác giả như Jonhanses (1986), Najafpour (2004) cũng đã công bố dung dịch CaCl2 2% là phù hợp để cố định nấm men trong gel alginate ứng dụng trong lên men sản xuất ethanol 10 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch tạo gel đến các chỉ tiêu của dịch sau lên men Chỉ tiêu Đường dư (%) Nồng độ ethanol % (v/v) Hiệu suất chuyển hóa (%) Hiệu suất lên men (%) Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) Nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2 (%) 1 1,5 2 1,0 3 2,3 4 2,9 5 3,2 10,5 11,2 10,2 9,4 9,0 83,24 86,57 84,31 80,28 78,15 77,28 82,44 75,08 69,19 66,24 12 5,6 5,5 5,1 4,6 3.2.2.3. Lựa chọn tỷ lệ giống nấm men thích hợp bổ sung vào dung dịch chất mang: Thí nghiệm với các mẫu có mật độ tế bào khác nhau, thay đổi từ 106 đến 1010 tế bào/ml dịch Na-alginate. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của mật độ giống nấm men đưa vào dung dịch chất mang đến chỉ tiêu của dịch sau lên men Chỉ tiêu Mật độ tế bào đưa vào dung dịch chất mang (tế bào/ml) 106 107 108 109 1010 Đường dư (%) 4,1 2,1 1,3 0,9 0,9 Nồng độ ethanol % (v/v) Hiệu suất chuyển hóa (%) Hiệu suất lên men (%) Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) 8,7 9,5 10,5 11,0 11,0 79,57 77,69 82,39 84,59 84,59 64,03 69,92 77,28 80,96 80,96 0,52 0,78 2,1 5,3 35 Số liệu bảng 3.12 cho thấy, mật độ tế bào trong gel ảnh hưởng tới hầu như mọi chỉ tiêu dịch sau lên men. Mẫu có nồng độ 1010 tế bào/ml dịch Na -alginate có nồng độ tế bào thoát ra nhiều hơn khoảng 7 lần so với 11 mẫu có nồng độ 109 tế bào/ml dịch Na –alginate, điều này không thuận lợi cho việc phải sử dụng hạt tế bào cố định và nhận thấy rằng nếu tăng mật độ nấm men cao hơn nữa thì hiệu suất cố định có xu hướng giảm. Trong khi đó tại nồng độ 109 tế bào/ml dịch Na – alginate thì thu được nồng độ ethanol cao nhất (11%) bên cạnh đó hiệu suất lên men cũng đạt hiệu quả cao (80,96%). 3.2.2.4. Lựa chọn tốc độ dòng chảy khi tạo hạt tế bào cố định Thí nghiệm với các mẫu có tốc độ dòng chảy dịch chất mang có chứa sinh khối nấm men vào dịch CaCl2 thay đổi từ 150 ml/phút - 250 ml/phút qua hệ thống tạo hạt 24 lỗ kim, trong các điều kiện tối ưu đã chọn được ở trên. Kết quả được nêu ở bảng 3.14. Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy đến chỉ tiêu của dịch sau lên men Tốc độ dòng chảy (ml/ phút) Chỉ tiêu 150 180 200 220 250 Đường dư (%) Nồng độ ethanol % (v/v) Hiệu suất chuyển hóa (%) Hiệu suất lên men (%) 2,4 9,8 81,59 2,0 10,1 82,17 1,8 10,8 86,95 2,3 10,3 85,13 2,6 10,0 84,02 72,13 74,34 79,49 75,81 73,60 Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) 6,2 6,4 6,5 6,9 7,0 Qua bảng số liệu ta thấy, tất cả các chỉ tiêu của các mẫu đều không quá chênh lệch, nhưng với mẫu có tốc độ dòng chảy là 200 ml/phút cho các kết quả tối ưu hơn: nồng độ ethanol cao nhất (10,8%v/v), lượng đường dư thấp (1,8%), hiệu suất chuyển hóa đường ra rượu cao nhất (86,95%). 3.2.2.5. Lựa chọn kích thước hạt tế bào cố định thích hợp cho quá trình lên men: Tiến hành làm thí nghiệm cố định tế bào với các kích thước lỗ kim khác nhau để tạo được kích thước hạt khác nhau trong cùng điều kiện lên men. Kết quả được ghi ở bảng sau: Bảng 3.16. Ảnh hưởng của kích thước hạt đến thành phần dịch sau lên men Đường kính hạt tế bào nấm men (mm) Chỉ tiêu 7 9 5 Đường dư (%) 2,5 2,9 2,1 Nồng độ ethanol (%v/v) 10,9 12 10,1 9,9 Hiệu suất chuyển hóa (%) 89,14 84,38 84,55 Hiệu suất lên men (%) 80,23 74,34 72,87 4,6 5,0 5,2 Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) Khi lên men với kích thước hạt nhỏ thì nồng độ ethanol tạo ra và hiệu suất lên men là cao hơn so với kích thước hạt lớn, mẫu hạt có đường kính 5 mm cho kết quả lên men tốt nhất với nồng độ ethanol đạt 10,9 % v/v và lượng đường còn lại sau lên men là thấp nhất với 2,1%. 3.3. Nghiên cứu công nghệ lên men ethanol nhờ tế bào cố định trên môi trường rỉ đường 3.3.1.Lựa chọn nồng độ cơ chất ban đầu Xác định nồng độ đường tổng rỉ đường của nhà máy đường Nông Cống (Thanh Hóa) sau khi đã được xử lý làm cơ sở cho việc pha loãng để có được 5 nồng độ đường khác nhau: 170g/l, 190g/l, 210g/l, 230g/l đường có trong dịch rỉ đường để tiến hành lên men ethanol. Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến chỉ tiêu của dịch lên men Nồng độ đường (g/l) Chỉ tiêu 170 190 210 230 Đường dư (%) 1,9 2,2 2,7 3,3 Nồng độ ethanol % (v/v) 9,1 10,3 11,0 10,9 Hiệu suất chuyển hóa (%) 93,15 94,75 92,91 85,52 Hiệu suất lên men (%) 82,75 83,77 80,96 73,24 6,3 6,1 6,4 7,2 Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) Hiệu suất chuyển hóa cao hơn một chút nhận được ở nồng độ cơ chất quá thấp nhưng sẽ tốn thể tích chứa rỉ đường, giảm hiệu quả cho giai đoạn chưng cất cồn sau này, không kinh tế. Với mẫu có nồng độ rỉ đường 210g/l cho nồng độ ethanol cao (11,0%v/v), lượng đường dư thấp hơn (2,7 %). 3.3.2. Lựa chọn tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định và cơ chất thích hợp cho quá trình lên men 13 Tỷ lệ hạt thay đổi từ 10 - 50% và qua kết quả thực nghiệm thấy tỷ lệ hạt sử dụng cũng có ảnh hưởng đến mật độ tế bào thoát vào trong dịch rỉ đường, xu hướng hạt thoát vào dịch giảm dần khi tăng tỷ lệ hạt ( tại tỷ lệ giữa hạt và thể tích dịch lên men là 10% thì mật độ tế bào thoát ra ngoài là cao nhất 9,0.104 tế bào/ml trong khi đó tại 30% thì mật độ thoát ra chỉ là 5,1.104 tế bào/ml). Nếu giảm tỷ lệ hạt xuống 10%, thì mật độ tế bào trong dịch tăng lên gấp 1,5 lần (9 ×104 tế bào/ml). Sử dụng tỷ lệ hạt so với dịch lên men quá lớn hơn 30% không cải thiện được tốc độ lên men và hiệu suất chuyển hóa, như vậy không có tác dụng có lợi mà gây lãng phí nguyên liệu và không gian thiết bị dành để chứa hạt. 3.3.3. Xác định các điều kiện lên men nhờ tế bào cố định 3.3.3.1. Ảnh hưởng của pH môi trường Thí nghiệm dược giữ nguyên và pH môi trường được thay đổi từ 3-5. Bảng 3.22. Ảnh hưởng của pH đến chỉ tiêu của dịch sau lên men Chỉ tiêu pH 3,0 1,7 3,5 1,6 4,0 1,3 4,5 1,2 5,0 1,3 Nồng độ ethanol % (v/v) Hiệu suất chuyển hóa đường ra rượu (%) Hiệu suất lên men (%) 9,6 10,5 11,0 11,1 11,0 76,89 83,66 86,31 86,65 86,31 70,66 77,28 80,96 81,70 80,96 Mật độ tế bào thoát ra ngoài × 104 (tế bào/ml) 6,7 6,5 6,0 5,9 5,9 Đường dư (%) Số liệu cho thấy, trong môi trường pH 4,0 - 5,0, nấm men cố định hoạt động tốt hơn so với khi ở trong môi trường pH 3,0 và 3,5; nhận xét này cũng nhận được khi lên men bằng nấm men tự do. Tại pH=4.5 đạt nồng độ ethanol cao nhất (11,1%v/v) và hiệu suất chuyển hoá cao (86,65%). 3.3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men Giữ nguyên chế độ lên men và chế độ cố định tế bào như khi thí nghiệm khảo sát pH môi trường, giữ pH= 4,5; nhưng thay đổi nhiệt độ lên men trong khoảng 20, 25, 30, 35oC. Dựa vào kết quả thực nghiệm, chọn nhiệt độ lên men trong khoảng 25-300C. 14 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chỉ tiêu của dịch sau lên men Chỉ tiêu Nhiệt độ lên men (oC) 20 25 30 35 Thời gian lên men (ngày) 9 6 5 4 Đường dư (%) 1,9 1,2 1,8 2,2 Nồng độ ethanol % (v/v) 11,1 11,1 10,9 9,2 Hiệu suất chuyển hóa (%) 89,84 86,65 87,75 75,64 Hiệu suất lên men (%) 81,70 81,72 80,23 67,71 Mật độ tế bào thoát ra 6,7 5,7 6,0 6,6 ngoài × 104 (tế bào/ml) 3.3.4. Đánh giá hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men Tiến hành bốn đợt lên men gián đoạn liên tiếp bằng hạt gel cố định tái sử dụng. Kết quả là mặc dù đã sử dụng tới 4 lần nhưng hoạt lực lên men của tế bào nấm men trong các hạt gel cố định vẫn không bị thay đổi đáng kể. Nồng độ ethanol trong dịch lên men và hiệu suất chuyển hóa đường/cồn có xu hướng giảm, nhưng không nhiều lắm từ 11,0 %v/v ethanol và 84,59% hiệu suất chuyển hóa lần đầu xuống 10,5 %v/v ethanol và 83,24% hiệu suất chuyển hóa ở lần thứ 4. Mật độ tế bào thoát ra ngoài có xu hướng tăng lên sau mỗi lần lên men. Bảng 3.26. Các chỉ tiêu dịch sau lên men theo các lần tái sử dụng tế bào cố định Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Đường dư (%) 0.9 1,1 1,2 1,5 Nồng độ ethanol % (v/v) 11,0 10,8 10,7 10,5 Hiệu suất chuyển hóa (%) 84,59 83,89 83,52 83,24 Hiệu suất lên men (%) 80,96 79,49 78,76 77,28 Mật độ tế bào thoát ra 5,9 6,2 6,5 6,8 ngoài × 104 (tế bào/ml) Mật độ tế bào trong hạt × 1,9 1,87 1,8 1,72 109 (tế bào/ ml gel) Điều này được giải thích là có thể vì sau mỗi lần tái sử dụng thì cấu trúc gel của hạt cố định tế bào có sự biến đổi và lỗ của các hạt gel này ngày một to ra, dẫn đến tế bào nấm men có thể thoát ra ngoài nhiều 15 hơn, tuy nhiên tỷ lệ thoát so với lượng còn lưu giữ được trong hạt là không nhiều. Hạt gel vẫn có cấu trúc khá chắc và vẫn đàn hồi, chưa có hiện tượng bị bở, vỡ, điều này cho thấy khả năng tái sử dụng tiếp tục vẫn là rất tốt. 3.4. Xây dựng quy trình lên men ethanol từ rỉ đường theo phương pháp lên men liên tục nhờ tế bào cố định 3.4.1. Lựa chọn phương pháp lên men liên tục thích hợp 3.4.1.1. Lựa chọn tỷ lệ hạt tế bào cố định so với thể tích dịch lên men Thí nghiệm được tiến hành trong hệ thống lên men liên tục gồm 7 bình lên men kế tiếp nhau, mỗi bình có thể tích 1 lít. Tỉ lệ hạt tế bào nấm men cố định/ thể tích dịch lên men thay đổi lần lượt là 30 %w/v, 40 %w/v và 50 %w/v. Bảng 3.27. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục (ứng với tỷ lệ hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 30 % w/v) Bình lên men Nồng độ ethanol (%v/v) 6,8 8,0 8,7 9,1 9,9 10,9 10,9 Đường dư (g/l) pH Lượng tế bào sống (CFU/g) 1,90 × 109 1,32 × 109 1,06 × 109 9,19 × 108 8,45 × 108 7,75 × 108 7,55 × 108 Hiệu suất lên men (%) F1 88,46 4,4 50,06 F2 75,41 4,4 58,90 F3 69,70 4,3 64,03 F4 43,40 4,3 66,98 F5 39,66 4,2 72,86 F6 23,00 4,2 80,22 F7 16,43 4,2 80,22 .Bảng 3.28. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục (ứng với tỷ lệ hạt tế bào cố định : thể tích dịch lên men là 40 %w/v) Bình lên men Nồng độ Đường ethanol dư (g/l) (%v/v) pH F1 F2 F3 F4 F5 F6 6,5 8,5 9,1 9,6 10,0 10,0 4,7 4,7 4,7 4,6 4,6 4,6 73,02 53,49 41,07 35,38 21,70 16,10 16 Hiệu Lượng tế bào suất sống lên men (CFU/g) (%) 1,80 × 109 47,84 1,35 × 109 62,56 9 1,33 × 10 66,90 9,02 × 108 70,66 8,22 × 108 73,60 8 7,02 × 10 73,60 Như vậy có thể thấy rằng tăng tỷ lệ tế bào nấm men cố định trong hệ thống lên men liên tục thì chỉ có thể rút được số lượng thiết bị sử dụng do tốc độ lên men được đẩy nhanh hơn chút nhưng hiệu suất lên men thấp do tiêu hao nguyên liệu cho việc duy trì sự sống và phát triển của tế bào Bảng 3.29. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục (ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 50 %w/v) Hiệu Lượng tế bào Bình suất pH sống lên men lên men (CFU/g) (%) F1 6,4 62,16 4,5 1,80 × 109 47,10 F2 8,7 50,33 4,5 1,47 × 109 64,03 9 F3 9,3 41,33 4,5 1,39 × 10 68,45 F4 9,6 32,38 4,5 9,47 × 108 70,66 F5 9,8 23,18 4,4 8,79 × 108 72,13 8 F6 9,8 15,84 4,4 7,26 × 10 72,13 Kết quả bảng 3.29 cho thấy, tiếp tục tăng lượng hạt lên 50 %w/v thời gian lên men đạt lượng cồn cao nhất đạt được ở bình số 5 (F5) là 9,8 %v/v không cải thiện gì so với tỷ lệ 40%w/v, trong khi đó hàm lượng ethanol giảm, hiệu suất lên men giảm. 3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hàm lượng ethanol thu được : Môi trường rỉ đường được thay đổi nồng độ lần lượt là 22°Bx, 24°Bx, 26°Bx và 28°Bx (tương ứng có 170 g/l, 190 g/l, 210 g/l và 230 g/l đường trong dịch rỉ đường đã xử lý). Theo dõi quá trình lên men (trong 7 ngày sau khi dòng dịch nuôi cấy đi ra. Mặc dù với nồng độ đường 190 g/l cho hiệu suất lên men đạt cao nhất, nhưng xét về hiệu quả sử dụng thiết bị và tổn thất nhiệt trong quá trình chưng cất sau này, chúng tôi chọn nồng độ đường 210g/l (tương ứng 26°Bx) cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.4.2. Xác định tốc độ pha loãng của quá trình lên mên liên tục Tốc độ pha loãng được thay đổi lần lượt là 0,102; 0,128; 0,154; 0,171 l/l/giờ (tương ứng với tốc độ dòng chảy là 1,2; 1,5; 1,8; 2,0 ml/phút trong hệ thống phòng thí nghiệm). Theo dõi quá trình lên men (trong 7 ngày sau khi dòng dịch nuôi cấy đi ra). Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục ở tất cả các bình cho thấy giá trị pH ở tất cả các bình đều ổn định 4,3-4,4. Lượng tế bào nấm men cũng Nồng độ Đường ethanol dư (g/l) (%v/v) 17 tương đối ổn định, dao động từ :7 × 108 - 8,02 × 108 (CFU/g ). Sản lượng cồn cao nhất đạt được với tốc độ pha loãng 0,154g/l/giờ và được chọn cho những thí nghiệm tiếp theo.. 3.4.3. Nghiên cứu độ ổn định các thông số động học của quá trình lên men liên tục Theo dõi sự ổn định của độ cồn đạt được tại bình thu F5 theo thời gian. Kết quả được trình bày trong hình 3.12. Kết quả cho thấy trong 40 ngày lên men các chỉ tiêu lên men của dòng dịch ra khỏi hệ thống thiết bị lên men liên tục tương đối ổn định . Cụ thể hàm lượng cồn 10,7-10,8%v/v; pH=4,3-4,4; hàm lượng đường sót 15,50-18,19g/l. Hình 3.12. Nồng độ cồn thu được trong hệ thống lên men liên tục theo thời gian lên men 3.5. Nghiên cứu xử lý hạt tế bào nấm men để giữ hoạt lực lên men cho quá trình lên men liên tục. 3.5.1. Xác định thời điểm cần hoạt hóa Kết quả thực nghiệm cho thấy, hạt tế bào cố định được hoạt hóa sau 40 ngày lên men cho kết quả lên men tốt nhất (hiệu suất lên men đạt 78,77%), khi kéo dài thời điểm hoạt hóa sau 40 ngày thì dù hoạt tính của hạt có được cải thiện so với trước khi hoạt hóa nhưng vẫn thấp hơn so với khi được hoạt hóa sớm ở thời điểm 40 ngày, nồng độ ethanol đạt được 10,7 (%v/v), lượng tế bào sống và nảy chồi cũng cao hơn các mẫu khác. 3.5.2. Nghiên cứu dung dịch rửa hạt tế bào nấm men Nghiên cứu rửa hạt tế bào nấm men bằng các dung dịch NaHCO3, EDTA. Sau khi rửa hạt, các hạt tế bào nấm men được đem đi lên men. Kết quả cho thấy, nồng độ ethanol sau lên men của tất cả các 18 mẫu dùng dung dịch rửa hạt đều cao hơn so không rửa hạt. Rửa hạt bằng nước cất và NaCl 0,9% cải thiện không đáng kể khả năng lên men, trong khi đó các dung dịch NaHCO3 và dung dịch EDTA cho kết quả khả quan hơn. Vì vậy chọn dung dịch rửa là NaHCO3. 3.5.3. Nghiên cứu bổ sung một số chất dinh dưỡng vào dịch hoạt hoá nấm men 3.5.3.1. Nghiên cứu bổ sung nguồn nitơ Tiến hành hoạt hóa hạt tế bào nấm men cố định trên môi trường glucoza 10% với các nguồn nitơ khác nhau (nguồn vô cơ và hữu cơ). Dựa vào kết quả thực nghiệm cho thấy tác dụng của 02 nguồn nitơ nghiên cứu tới sinh trưởng và lên men rượu không khác nhau nhiều. Chúng tôi chọn urê làm nguồn ni tơ bổ sung và tiếp tục nghiên cứu lựa chọn nồng độ thích hợp của nó. Tiếp tục nghiên cứu nồng độ urê thay đổi 0,03%; 0,05%; 0,1%; 0,15%. Từ thực nghiệm thì môi trường có chứa 0,05% urê cho hạt tế bào cố định có kết quả lên men tốt nhất, nồng độ ethanol đạt 10,7%v/v, hàm lượng đường sót thấp, số lượng tế bào nấm men tổng số, số lượng tế bào sống và tế bào nảy chồi đều cao nhất, hiệu suất lên men đạt 78,77%. 3.5.3.2. Nghiên cứu nguồn photpho Thí nghiệm dùng nguồn photpho là KH2PO4 và K2HPO4 thì nhận thấy là KH2PO4 được lựa chọn để bổ sung vào môi trường hoạt hóa là tốt hơn và tiếp tục nghiên cứu lựa chọn nồng độ tối ưu của KH2PO4 theo các nồng độ khác nhau: 0,05%; 0,1%; 0,15% sau đó theo dõi quá trình lên men của nấm men. Kết quả nhận được nồng độ KH2PO4 0,05% cho kết quả lên men ethanol tốt nhất. Hàm lượng ethanol trong môi trường lên men đạt 10,8 %v/v, hàm lượng đường sót thấp, hiệu suất lên men cao (79,51%), tổng số tế bào nấm men, số lượng tế bào sống, tế bào nảy chồi đều cao hơn các mẫu còn lại. 3.5.4. Nghiên cứu phương pháp hoạt hoá hạt tế bào Hai phương pháp nuôi tĩnh và nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 30°C trong 24 giờ. Đối chứng là hạt không hoạt hóa.. Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu hoạt hóa và không hoạt hóa, giữa hoạt hóa có lắc và tĩnh. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men bằng hạt đã hoạt hóa cao hơn hẳn mẫu đối chứng (mẫu nuôi cấy lắc hàm lượng ethanol 10,9 %v/v; mẫu nuôi tĩnh hàm lượng ethanol đạt 19 10,1 %v/v; trong khi mẫu đối chứng không hoạt hóa hàm lượng cồn chỉ đạt 8,4 %v/v, hiệu suất lên men là 74,36%). 3.6. Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm cồn etylic ở quy mô pilot - Theo dõi động học các chu kỳ lên men liên tục để tạo dịch lên men cho quá trình chưng cất tạo 5000 lít cồn: kiểm tra tốc độ pha loãng, các thông số quá trình, xác định hiệu suất lên men. Sau khi lên men tĩnh trong thời gian 4 ngày, kiểm tra nồng độ ethanol trong dịch dấm chín tại 06 thùng lên men thì nồng độ ethanol đạt trung bình là 10,5%v/v, khi đó bắt đầu điều chỉnh bơm định lượng cho dòng dịch môi trường rỉ đường liên tục chảy vào thiết bị lên men đầu dây và liên tục chảy ra khỏi thiết bị lên men cuối dây với tốc độ dòng chảy là 109 lít/ giờ, tương đương với tốc độ pha loãng là 0,154 lít/lít/giờ. Dịch lên men được lấy mẫu tại đầu ra mỗi ngày một lần trong 10 ngày liên tục, kết quả được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.45. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trên hệ thống thiết bị 1200 lít (mẻ số 1) Ngày lên men Nồng độ ethanol (%v/v) Đường dư (g/l) pH 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 10,5 10,6 10,5 11,0 11,0 10,9 10,8 10,8 10,8 10,9 20,72 19,32 21,60 14,15 13,90 15,11 14,74 14,62 16,70 15,10 4,2 4,1 4,1 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 Lượng tế bào nấm men còn sống (CFU/g) 9,1 × 108 9,12 × 108 8,8 × 108 8,9 × 108 8,82x108 8,68 x 108 8,52 x 108 8,66 x 108 8,47 x 108 8,54 x 108 Hiệu suất lên men (%) 77,30 78,04 77,30 80,98 80,98 80,25 79,51 79,51 79,51 80,25 . Sau khi chạy thử mẻ 1 thì đã khắc phục một số vấn đề trong hệ thống như việc điều chỉnh tốc độ dòng chảy, van chảy tràn giữa các thiết bị lên men liên tục, chúng tôi đã tái sử dụng hạt tế bào cố định cho lên men mẻ 2. Trước khi tiến hành lên men, hạt tế bào cố 20