Tài liệu Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở sapa, việt nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (tt)

MỞ ĐẦU Ở nước ta, tam thất được trồng và mọc tự nhiên ở: Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Kon Tum, Quảng Nam… Tuy nhiên việc khai thác và sử dụng tam thất trong nước còn hạn chế vì chưa có nhiều nghiên cứu khoa học so sánh về thành phần hoá học các hoạt chất và tác dụng sinh học của chúng với loài tam thất khác, đặc biệt là loài tam thất trồng của Trung quốc. Tam thất Việt Nam chủ yếu được khai thác để xuất khẩu tiểu ngạch sang Trung Quốc làm thuốc chữa bệnh. Nước ta chủ yếu nhập khẩu Tam thất trồng ở Trung Quốc (tên khoa học Panax notoginseng) về làm thuốc chữa bệnh, pha chế mỹ phẩm và làm thực phẩm bổ dưỡng cơ thể. Cho tới ngày nay, việc khai thác hoạt chất saponin và polyacetylen trong củ tam thất đã và đang được nghiên cứu theo các phương pháp chiết tách khác nhau, phương pháp nghiên cứu chiết tách với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm cho lượng chất tổng số lớn với đầy đủ các hoạt chất. Phương pháp sắc ký hiện đại tinh sạch được các chất có độ tinh sạch cao, từ đó nghiên cứu được những hoạt tính sinh học của chúng, mở ra khả năng ứng dụng công nghệ để sản xuất sản phẩm tốt hơn, với chất lượng cao hơn. Xuất phát từ thực tế và sự cấp thiết trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” đã được lựa chọn để nghiên cứu với mục tiêu và nội dung sau: * Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu, xác định các loài tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam. - Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ tam thất, thành phần dinh dưỡng, đồng thời đánh giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học của cao chiết từ tam thất trồng ở Sapa, Lào Cai. - Đánh giá khả năng ứng dụng củ tam thất trong một số sản phẩm công nghệ thực phẩm. * Nội dung nghiên cứu - Xác định tên khoa học ba loài tam thất trồng tại Sapa, Lào Cai, Việt Nam là: Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng. - Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loại củ tam thất trồng ở Sapa, Lào Cai, Việt Nam: protein, lipid, carbohydrate, amino axit, axit béo, các nguyên tố đa lượng và vi lượng, phenol tổng, flavonoid tổng và saponin. Từ đó đánh giá chất lượng cây tam thất hoang của Việt Nam (Panax stipuleanatus). 1 - Xác lập qui trình thu nhận cao tam thất từ củ tam thất hoang bằng phương pháp chiết tách với ethanol, xác định cấu trúc các hoạt chất và hoạt tính sinh học các chất trong cao tam thất hoang (Panax stipuleanatus). - Nghiên cứu ứng dụng tam thất hoang trong ngành công nghệ thực phẩm. * Tính mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dưỡng của ba cây tam thất ở Sapa, Lào Cai (Việt Nam). Từ đó đánh giá được chất lượng cây tam thất hoang (Panax stipuleanatus) so với hai loài tam thất khác (Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng). - Tối ưu hóa qui trình chiết tách cao chiết tổng trong củ tam thất hoang, lượng cao thu được là 15,00 ± 0,02%. Đồng thời tinh sạch và xác định cấu trúc của 6 hợp chất trong củ tam thất hoang là stigmasterol (T1), axit 5-dodecenoic (T2), stipudiol (T4) 5-hydroxymetylfurfural (T5), panaxytriol (T6) và đặc biệt có một chất mới là Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol (T3). Trong đó, T3, T4 và T6 có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB. - Từ bột, cao chiết tổng chiết tách từ củ tam thất hoang đã tạo ra được một số sản phẩm như: kẹo cứng tam thất, bánh cookie tam thất, nước tam thất mật ong và trà tam thất hoa cúc có tính chất cảm quan hấp dẫn người tiêu dùng. Bố cục của luận án Luận án gồm 145 trang, trong đó mở đầu: 3 trang, chương 1: 37 trang, chương 2: 21 trang, chương 3: 67 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, danh mục công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 13 trang. Luận án có 50 bảng, 44 hình, 160 tài liệu tham khảo. 1.TỔNG QUAN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu của luận án là 3 loài tam thất thu hái tại Sapa - Lào Cai. Mẫu tam thất được giám định tên khoa học bằng hình thái là Panax notoginseng F. H. Chen ex C. Y. Wu et K. M. Feng (tam thất Trung Quốc), Panax bipinnatifidus Seem. (sâm Vũ diệp) và Panax stipuleanatus H. Tsai et K. M. Feng (tam thất hoang), thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân Sâm) (Araliaceae). - Luận án sử dụng các phương pháp và thiết bị nghiên cứu sau: + Phân tích định lượng saponin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC; thành phần axit béo xác định bằng GC-MS; amino axit được xác định bằng HPLC với detector huỳnh quang; hàm lượng nguyên tố đa lượng 2 và vi lượng xác định bằng thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). Hàm lượng flanonoid, phenol tổng… được xác định bằng phương pháp quang phổ (UV-Vis). + Các chất được tinh sạch bằng sắc kí bản mỏng (TLC), sắc kí cột nhồi silica gel, sephadex LH-20, sắc kí lỏng điều chế (Prep. HPLC) với cột pha thường và pha đảo (RP-18). Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ HR-ESI-MS và 1D, 2D NMR. + Hoạt tính kháng vi sinh vật xác định theo hai phương pháp là phương pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên môi trường lỏng. Hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch (MTT). + Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tam thất trong ngành công nghệ thực phẩm bằng phương pháp phân tích cảm quan sản phẩm, phân tích phương sai (ANOVA). Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc tính của nguyên liệu tam thất 3.1.1. Hàm lƣợng protein Bằng phương pháp Kjeldahl, chúng tôi đã xác định được hàm lượng protein có trong mẫu bột khô của tam thất hoang P. stipuleanatus là 7,04 ± 0,29% khối lượng khô; sâm vũ diệp P. bipinnatifidus 8,02 ± 0,15%; tam thất Trung Quốc P. notoginseng 10,16 ± 0,24%. 3.1.2. Hàm lƣợng lipid Bằng phương pháp Soxhlet đã xác định được hàm lượng lipid có trong mẫu bột khô của tam thất tính theo khối lượng khô. Hàm lượng lipid có trong tam thất hoang là 10,35 ± 0,80%; sâm vũ diệp 9,12 ± 0,3% và tam thất Trung Quốc 6,72 ± 0,5%. 3.1.3. Hàm lƣợng carbohydrate Từ đồ thị đường chuẩn D-glucose, chúng tôi xác định được hàm lượng carbohydrate có trong mẫu bột khô tam thất hoang là 50,62 ± 3,74%; sâm vũ diệp 43,28 ± 0,23% và tam thất Trung Quốc 48,15 ± 0,42%. 3.1.4. Hàm lƣợng các amino axit Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng HPLC Alliance của hãng Water, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích, xác định amino axit thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Khoa Hóa Thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, đã phân tích được thành phần amino axit trong ba loại củ tam thất như sau: 3 Bảng 3.4. Thành phần các amino axit trong ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô). P. P. P. stipuleanatus notoginseng bipinnatifidus Aspartic 437,5 394,6 414,7 2 Serine 309,9 284,5 299,5 3 Glutamic 304,6 282,0 311,4 4 Glycine 67,9 60,1 63,6 5 Histidine 856,8 804,2 1132,3 6 Arginine 346,4 312,4 343,6 7 Alanine 142,3 132,5 139,4 8 Proline 31,4 27,9 30,2 9 Tyrosine 225,8 194,8 206,2 10 Valine 191,0 185,8 201,9 11 Methionine 46,2 41,0 35,9 12 Lysine 292,8 272,0 287,5 13 Isoleucine 128,3 132,4 131,9 14 Leucine 327,7 309,2 328,7 15 Phenylalanine 276,3 257,3 284,5 No Amino axit 1 3.1.5. Thành phần axit béo Từ kết quả phân tích trên GC-MS (7000B) của hãng Agilent, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích tại Phòng thí nghiệm của Khoa Hóa Thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, 14 loại axit béo được phát hiện từ ba loài tam thất. 4 Bảng 3.5. Thành phần các axit béo có trong ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô). No Axit béo P. P. P. stipuleanatus notoginseng bipinnatifidus 1 C12:0 (decanoic) 3,4 13,6 32,6 2 C14:0 (myristic) 11,7 30,5 30,3 3 C16:1 (palmitoleic) 31,5 29,9 20,7 4 C16:0 (palmitic) 236,5 407,0 621,4 5 C17:0 (margaric) 19,6 14,8 9,9 6 C18:2 (linoleic) 783,9 587,0 743,5 7 C18:1 (oleic) 251,3 350,2 354,3 8 C18:0 (stearic) 82,6 98,4 98,3 9 C20:1 (eicosenoic) 17,7 10,1 - 10 C20:0 (arachidic) 14,6 7,6 5,5 11 C21:0 (henecosanoic) 1,5 0,0 - 12 C22:0 (behenic) 8,3 4,6 - 13 C23:0 (tricosanoic) 0,9 - - 14 C24:0 (lignoceric) 2,2 2,2 - [(-) không xác định được] Từ bảng 3.5 cho thấy, trong thành phần axit béo của cả hai loài P. notoginseng và P. stipuleanatus đều thấy có axit linoleic, axit oleic, axit paltamic, là các axit béo phổ biến nhất trong thành phần axit béo của P. ginseng, P. notoginseng và P. quinqueflolius từ Trung Quốc 3.1.6. Nghiên cứu về thành phần các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng Bằng thiết bị Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS-6300), sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa trên lò Graphit phân tích, xác định một số nguyên tố đa lượng và vi lượng trong 3 loài tam thất. 5 Bảng 3.6. Thành phần các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong tam thất (mg/kg trọng lượng khô). STT Nguyên tố 1 2 3 4 5 6 7 8 Fe Cu Zn Pb Cr Ni Mn Cd P. bipinnatifidus 12,6933 1,3543 4,7186 6,2865 7,4905 1,0769 10,4556 0,0487 P. stipuleanatus 14,0271 1,2716 4,0570 7,0323 7,4484 0,5786 9,3159 0,0382 P. notoginseng 12,0173 1,1169 4,3572 7,1158 7,2480 0,7321 8,3516 0,0422 3.1.7. Hàm lƣợng phenol tổng Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy hàm lượng phenol tổng trong cao chiết củ tam thất hoang là 12,04 ± 0,08 mg/g cao hơn so với các loài tam thất khác trong sâm vũ diệp 11,00 ± 0,17 mg/g và tam thất Trung Quốc 11,29 ± 0,11 mg/g. 3.1.8. Hàm lƣợng flavonoid tổng Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng trong 1g mẫu cao ethanol của 3 loài tam thất so với chất chuẩn mg Quercetin (QE), tam thất hoang có hàm lượng flavonoid thấp nhất là 1,03 ± 0,12 mg/g. Trong đó, flavonoid trong củ tam thất Trung Quốc 1,29 ± 0,10 mg/g và flavonoid trong sâm vũ diệp 1,19 ± 0,07 mg/g. 3.1.9. Phát hiện saponin bằng các phản ứng định tính đặc trƣng Kết quả tiến hành phân tích định tính bằng phản ứng đặc trưng trong ống nghiệm, phản ứng giọt và sắc kí cho thấy sự có mặt của nhóm chất saponin trong bột củ tam thất. Các saponin trong phép thử thuộc cả 2 nhóm saponin triterpen và steroid. Phép thử định tính cho thấy trong củ chứa chủ yếu nhóm saponin triterpen. 3.1.10. Xác định saponin trong tam thất bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) áp dụng quy trình phân tích dược điển của Trung Quốc, thực hiện tại Phòng thí nghiệm Dược, 6 Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, kết quả ở bảng sau: Bảng 3.10. Định lượng saponin trong bột củ ba loài tam thất. Mẫu Bột TTH Bột SVD Bột NOTO Khối lượng (g) 0,6 0,6 0,6 Thể tích (ml) 50 50 50 R1 (%) Rb1 (%) Rg1 (%) 0,015 0,008 1,140 0,062 0,034 4,230 0,057 0,038 4,750 R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Saponin tổng (%) 0,080 0,134 10,12 Rg1: Ginsenosid Rg1 Nhận xét: Qua việc nghiên cứu khảo sát đặc tính nguyên liệu của 3 loài tam thất phổ biến ở Sapa, Lào Cai. Chúng tôi thấy cây tam thất hoang là loài cây dược liệu quí, vùng phân bố rộng, là cây tam thất đặc thù của Việt Nam. Do vậy để làm rõ hơn các hoạt chất có hoạt tính sinh học của loài cây này. Chúng tôi tập trung nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất trong củ để làm cơ sở khoa học cho việc ứng dụng tam thất vào sản phẩm thực phẩm. 3.2. Xây dựng quy trình chiết tách cao tổng từ củ tam thất hoang 3.2.1. Nghiên cứu khảo sát các phƣơng pháp chiết tách thu cao tổng . Nghiên cứu chọn ethanol làm dung môi chiết vì ethanol dễ hòa tan hầu hết các hợp chất thiên nhiên, không độc hại đến sản phẩm, có thể cất và thu hồi lại dung môi. Các thí nghiệm được tiến hành như sau: cho khoảng 2 gam bột mẫu tam thất và lượng dung môi theo tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1(thể tích/khối lượng; v/m). Các phương pháp chiết sau: Bảng 3.11. Kết quả khảo sát các phương pháp chiết tách và nồng độ dung môi chiết Phƣơng pháp tách Chiết Soxhlet Trong 3 giờ Nồng độ ethanol (% V) 99,6 95 90 85 80 75 70 65 60 Khối lƣợng mẫu (g) Cao chiết tổng (% chất khô) 2,0685 2,0674 2,0787 2,0769 2,0776 2,0916 2,0702 2,0794 2,0694 9,78 12,51 12,08 12,99 11,80 8,49 8,91 8,91 8,91 7 (DPPH) IC50 (mg/ml) 25,82 26,41 26,21 26,30 25,86 25,75 25,91 25,78 25,95 Ngâm ở nhiệt độ thường Trong 48 giờ Siêu âm 30 phút Siêu âm 1 giờ 99,6 90 80 70 60 50 40 30 90 80 70 60 50 40 90 80 70 60 50 40 2,0069 2,0214 2,0409 2,0219 2,0066 2,0703 2,0591 2,0675 2,0311 2,0465 2,0286 2,0436 2,0632 2,0568 2,078 2,0413 2,0638 2,0048 2,0532 2,0732 6,93 9,15 10,608 11,49 14,04 13,59 13,08 13,07 7,60 9,25 10,36 10,34 10,01 10,13 9,06 11,07 14,17 13,19 12,36 12,32 25,92 26,02 26,61 26,28 26,65 26,08 26,41 26,51 26,56 25,89 26,35 26,13 26,46 26,53 26,24 26,60 26,67 26,48 26,18 26,24 Nồng độ ethanol (%V) Hình 3.1: Khảo sát các phương pháp chiết tách cao chiết tổng 8 Kết quả bảng 3.11 cho thấy khi thay đổi các phương pháp chiết và thay đổi nồng độ % ethanol, kiểm tra hoạt tính quét gốc tự do của cao chiết thu được (% chất khô), kết quả quét DPPH không thay đổi nhiều (ở nồng độ IC50 chất đối chứng axit ascorbic IC50 = 0,030 mg/ml; DPPH thấp nhất của cao chiết Soxhlet IC50 = 25,75 và cao nhất ở cao chiết có hỗ trợ siêu âm 1 giờ là IC50 = 26,67 mg/ml). Từ kết quả này cho ta cơ sở để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2. Kết quả khảo sát điều kiện tối ƣu hoá phƣơng pháp chiết siêu âm Từ nghiên cứu khảo sát ở trên, nhận thấy các phương pháp chiết đều cho cao chiết tổng có hoạt tính chống oxy hóa (IC50) hầu như không thay đổi, đối với phương pháp chiết sử dụng siêu âm sẽ thu được lượng cao chiết tổng lớn. Do đó, chỉ tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng như: tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ cồn, thời gian chiết siêu âm và nhiệt độ chiết đến lượng cao chiết tổng thu được. Hình 3.2: Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m). 9 Hình 3.3: Khảo sát nồng độ dung môi ethanol (%) c, Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết (hỗ trợ rung siêu âm) Ngâm khoảng 2 gam mẫu trong 100 ml dung môi ethanol có nồng độ cồn 65% rồi rung siêu âm duy trì nhiệt độ trong khoảng từ 350C đến 400C. Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết hỗ trợ siêu âm trên máy Powersonic 405 - Hàn Quốc (tần số 33 - 40 kHz) ở các mức thời gian từ 30 phút đến 90 phút. Kết quả thu được tại hình 3.4 như sau: Hình 3.4: Khảo sát thời gian chiết (thời gian rung siêu âm) 10 Kết quả: nồng độ dung môi 65%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 55/1 (v/m) và thời gian siêu âm 75 phút. Với điều kiện tối ưu này thì mục tiêu về lượng cao chiết tổng đạt được cao nhất là: 15,00 ± 0,02%. Đạt tỷ lệ lượng cao chiết lớn nhất cho mục đích chiết tách cao tam thất. Mẫu tam thất 2,0419g (qui khô) - Nghiền thành bột ø 0,2-1mm - Nồng độ dung môi 65% - Tỷ lệ dm/bột (55/1) - Chiết siêu âm t0≤ 450C bằng EtOH Dịch EtOH - Lọc lấy dịch chiết - Cô chân không đến cặn, t0≤ 500C - Pck = 550 mmHg Sấy chân không loại EtOH (Pck =550 mmHg, 500C, 5 giờ) Lượng cao chiết tổng 0,3065g Hình 3.9: Qui trình công nghệ chiết tách cao chiết tổng từ tam thất Từ sản phẩm cao chiết tổng thu được chúng tôi đi phân tích xác định hàm lượng saponin thành phần bằng phương pháp phân tích trên (HPLC) của hãng Hitachi (Nhật Bản) thu được kết quả bảng 3.20 dưới đây: 11 Bảng 3.20. Định lượng saponin thu được trong cao chiết ethanol của tam thất hoang. Mẫu Cao TTH Khối lượng (g) Thể tích (ml) R1 (%) Rb1 (%) Rg1 (%) Saponin tổng (%) 0,6 50 0,046 0,190 0,187 0,423 R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Rg1: Ginsenosid Rg1 3.3. Hoạt tính sinh học của các phân đoạn chiết xuất từ củ tam thất hoang 3.1.1. Hoạt tính chống oxy hóa – quét gốc tự do DPPH Bảng 3.21: Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang Mẫu n-hexane Ethyl acetat n-butanol Axit ascorbic Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH ở các nồng độ khác nhau của mẫu (%) 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 0 0,99 2,48 4,09 1,4 4,45 5,17 7,11 0,65 4,09 7,65 11,53 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 0,32 1,61 37,07 80,92 88,15 Từ kết quả bảng 3.21 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn của củ tam thất hoang là rất thấp. Hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở phân đoạn n-butanol là 11,53% với 2 mg/ml mẫu thử. Trong khi đó ở chất đối chứng axit ascorbic ở 0,05 mg/ml đã đạt 37,07%. 3.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn củ tam thất hoang theo hai phương pháp là phương pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên môi trường lỏng. 12 Bảng 3.22: Hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang trên môi trường thạch. Kích thƣớc vòng kháng khuẩn (mm) Tên vi khuẩn n-hexane Nƣớc n-butanol (10mg/ml) (20mg/ml) (20mg/ml) - 10,7 ± 1,2 - 10,4 ± 1,1 24,6 ± 0,5 - - - 11,4 ± 1,2 S. typhimurium 22,8 ± 1,6 - - - 14,4 ± 0,5 E. coli 23,4 ± 1,6 - 16,3 ± 4,0 - 12,0 ± 2,2 P. aeruginosa 21,4 ± 1,6 - 19,0 ± 1,4 2,5 ± 0,58 9,2 ± 1,3 S. enterica 18,7 ± 1,5 - - - - ĐC (+) ĐC (-) B. subtilis 21,8 ± 1,7 S. aureus ĐC (+) : kanamycine, ĐC (-) : methanol, "-" : không xác định (Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3) Bảng 3.23: Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các cao phân đoạn củ tam thất hoang trên môi trường lỏng. Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật IC50 (g/ml) Mẫu Gram (+) Gram (-) Nấm S. B. L. S. E. P. C. aureus subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albican n-hexane 5,03 5,00 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 n-butanol 8,00 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 3.3.3. Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin Tyrosinase là enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp melanin. Tyrosinase là enzyme đầu tiên xúc tác cho quá trình phân giải tyrosine và dopaquinon tạo ra melanin. 13 Bảng 3.25: Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang. Mẫu và chất chuẩn IC50 (mg/ml) n- hexane 0,4312 ± 0,0332 n-butanol 0,3231 ± 0,0787 Nước 0,4151 ± 0,0919 Axit kojic 0,0044 ± 0,0005 (Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3) Từ kết quả ở hai bảng 3.25 trên, chúng ta thấy hoạt tính ức chế tyrosinase tăng tuyến tính theo dãy nồng độ của các cao phân đoạn. Và cả ba cao phân đoạn đều thể hiện khả năng ức chế tyrosinase thấp hơn so với chất đối chứng là axit kojic. 3.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ Bảng 3.26: Hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư của các cao phân đoạn từ củ tam thất hoang (IC50, µg/ml). Hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư - IC50 (µg/ml) Cao LU HepG2 1 n-hexane 0,26 0,26 2 n-butanol 39,34 Ellipticin 0,45 Đối chứng SK- MCF-7 KB 0,21 0,51 0,86 54,03 67,79 48,24 63,37 0,35 0,56 0,53 0,31 MEL 2 Theo kết quả từ bảng 3.26, ta thấy các cao phân đoạn n-butanol và nhexane của củ tam thất hoang đều có hoạt tính gây độc tế bào trên cả năm dòng tế bào thử nghiệm. 3.4. Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính của một số thành phần hóa học trong cao chiết tam thất hoang 3.4.1. Chiết các phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang 14 * Quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cao chiết TTH được trình bày như sau Cao chiết tổng (200,0g) 1.Hòa nước 2.Chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau 3.Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm 5 - 10 mbar n- hexane (15,0g) n-butanol (48,98g) Nước (135,01g) Hình 3.10: Quy trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang 3.4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch từ cao phân đoạn 3.4.2.1. Hợp chất H3C2 (T1) Cấu trúc của T1 được xác định bằng phổ 1H NMR và so sánh với tài liệu, chúng tôi kết luận T1 là stigmasterol (Hình 3.15). Hình 3.15: Cấu trúc của hợp chất T1 (stigmasterol) 3.4.2.2. Hợp chất H5A1 (T2) Hợp chất T2 được xác định bằng phổ 1H NMR và GC-MS. Kết quả T2 là axit 5-dodecenoic. O HO 5 Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất T2 (axit 5-dodecenoic) 15 3.4.2.3. Hợp chất H6A1 (T3) Hợp chất T3 (4 mg) dạng dầu, màu vàng, được chiết tách từ phân đoạn H6A qua hệ thống sắc kí lỏng điều chế (prep. HPLC) với hệ dung môi H:E=3:1, detector UV 254 nm. Phổ ESI-FTICR-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 263,2006 [M+H]+ từ đó xác định công thức phân tử của T3 là C17H26O2. Phổ 1H NMR trên hình 3.18 cho thấy: - Ở vùng trường thấp có 2 olefinic ptoron tại 5,76 ppm (d, J = 16 Hz) và 6,32 ppm (dd, J = 5,5, 16,0 Hz). Chúng có J lớn là 16 Hz chứng tỏ chúng gắn với cacbon mang liên kết đôi với cấu hình trans. - Có hai vân ở 4,19 ppm và 4,42 ppm đặc trưng cho cộng hưởng của proton thuộc nhóm carbinol CH-OH. - Ở vùng trường mạnh, δ từ 0,68 đến 2,31 ppm là cộng hưởng của CH3, CH2, trong đó hai tín hiệu ở 0,88 ppm và 1,03 ppm được gán cho proton nhóm metyl (-CH3); ba tín hiệu ở 1,29 ppm; 1,57 ppm và 1,75 ppm được gán cho proton các nhóm metylen (-CH2-). Hình 3.18: Phổ 1H NMR của hợp chất T3. 16 Hình 3.19: Phổ 13C NMR của hợp chất T3. Phổ 13C NMR của hợp chất T3 có tín hiệu của 18 cacbon, trong đó có 16 pic ở vùng trường mạnh (0 - 100 ppm) và 2 pic ở vùng trường trung bình (100 - 160 ppm). Kết hợp với phổ HSQC chúng tôi quy kết được 18 cacbon này bao gồm: - 2 nguyên tử cacbon bậc 1 (-CH3 ) cộng hưởng ở 9,33 ppm và 14,1 ppm. - 8 nguyên tử cacbon bậc 2 (-CH2 ) cộng hưởng ở 22,6 ppm; 25,2 ppm. 29,2 ppm; 29,4 ppm; 29,8 ppm; 30,7 ppm; 31,8 ppm và 36,9 ppm (nằm trong vùng từ 22 - 45 ppm). - 4 nguyên tử cacbon của nối ba (-C≡C-) cộng hưởng ở 71,0 ppm; 73,7 ppm; 77,3 ppm và 83,0 ppm (nằm trong vùng từ 70 - 100 ppm). - 2 nguyên tử cabon của nối đôi (-CH=CH-) cộng hưởng ở 108,2 ppm; 149,7 ppm (nằm trong vùng từ 110 - 150 ppm). - 2 nguyên tử cacbon đính với nhóm OH cộng hưởng ở 64,3 ppm và 72,1 ppm. → có 2 nhóm CH3, 8 nhóm CH2, 4 nhóm CH và 4 nguyên tử C. 17 Hình 3.20: Phổ HMBC của hợp chất T3. Phổ HMBC trên hình 3.20 cho thấy các tương tác xa C-H trong phân tử: Proton của 1 nhóm metyl (-CH3) (0,88 ppm) có tương tác với 2C của 2 nhóm metylen (-CH2-) (22,6 ppm và 31,8 ppm). Proton của nhóm metyl (CH3) còn lại (1,03 ppm) có tương tác với C của nhóm metylen (-CH2-) (30,72 ppm) và tương tác với C của nhóm CH-OH (64,3 ppm). Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,29 ppm) có tương tác với C của nhóm metyl (-CH3) (14,1 ppm), C nhóm metylen (-CH2-) (31,8 ppm). Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,57 ppm) có tương tác với C của nhóm metylen (-CH2-) (29,4 ppm) và C nhóm CH-OH (72,1 ppm). Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,75 ppm) có tương tác với C của nhóm metyl (-CH3) (9,33 ppm), C nhóm CH-OH (64,3 ppm) và 2 nhóm -C≡C- (77,3 ppm và 83,0 ppm). Proton của 1 nhóm CH-OH (4,19 ppm) có tương tác với C của nhóm olefin –CH=CH- (108,2 ppm). Proton của nhóm –CH=CH- có tương tác với C của nhóm CH-OH và -C≡C-. Từ sự phân tích trên đây, chúng tôi xác định cấu tạo của T3 là Heptadeca8-en-4,6-diyne-3,10-diol, đây là một chất mới và tiến hành quy kết các giá trị phổ bảng 3.30. Chúng tôi chưa xác định được cấu hình của hai trung tâm bất đối ở C-3 và C-10. Mặc dù đã cố gắng sử dụng phương pháp Mosher cải tiến nhưng không thể tinh sạch được sản phẩm este mong muốn. 18 OH 4 5 6 7 3 8 1 9 12 10 16 13 17 OH Hình 3.21: Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol Bảng 3.30: Các giá trị phổ của hợp chất T3. 1 13 H NMR (H, J in Hz) 1,05, t, 6,0 1,57, m; 1,74, m 4,42, t, 6,5 5,76, d, 16,0 6,32, dd, 5,5, 16,0 4,19, d, 6,5 1,57, m 1,29, m 1,29, m 1,29, m 1,29, m 1,29, m 0,88, t, 7,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 C NMR (C) 9,33 30,7 64,3 82,9 71,0 73,7 77,3 108,2 149,7 72,1 37,0 25,2 29,4 29,8 31,8 22,6 14,1 3.4.2.4. Hợp chất H6A2 (T4) Hợp chất T4 được xác định là 1,8-octadecadiene-4,6-diyn-3,10-diol (stipudiol) bằng phổ 1D và 2D NMR với cấu trúc sau. OH Ha 1 2 Hb 3 12 4 5 6 7 8 10 9 11 13 14 15 16 18 17 OH Hình 3.25: Cấu trúc của stipudiol (T4) 3.4.2.5. Hợp chất HAB2A3 (T5) Từ kết quả phân tích phổ và kết hợp so sánh với tài liệu chúng tôi kết luận hợp chất T5 là 5-hydroxymetylfurfural có công thức hình 3.30 như sau: 19 Hình 3.30: Cấu trúc 5-hydroxymetylfurfural 3.4.2.6. Hợp chất HAB2C3 (T6) Từ kết quả phân tích phổ 1D và 2D NMR và kết hợp với tài liệu tham khảo, chúng tôi kết luận hợp chất T6 là hợp chất Panaxytriol có công thức trên hình 3.35 như sau: OH 4 2 1 5 6 7 8 14 12 3 9 OH OH 16 10 11 13 15 17 Hình 3.35: Cấu trúc hợp chất Panaxytriol Kết luận: Đã xác định được cấu trúc 6 hợp chất tinh sạch từ cao phân đoạn trong củ tam thất hoang (Panax stipuleanatus). 3.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn và độc tính tế bào của chất tinh sạch Bảng 3.34. Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của chất tinh sạch trong các cao phân đoạn củ tam thất hoang trên môi trường lỏng Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật - IC50 ( g/ml) Gram (+) Gram (-) Nấm S. B. L. S. E. P. C. aureus subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albican T3 25,6 128 >128 >128 >128 >128 >128 T4 128 128 >128 >128 >128 >128 >128 T5 25,6 >128 >128 >128 >128 >128 >128 T6 >128 128 >128 >128 >128 >128 >128 Bảng 3.35. Kết quả kháng dòng tế bào KB của các chất tinh sạch trong củ tam thất hoang Mẫu STT 1 2 3 4 5 Tên mẫu T3 T4 T5 T6 Ellipticin Giá trị IC50 (µg/ml); KB 10,05 8,11 101,97 14,57 0,31 20