Tài liệu Nghiên cứu chế tạo bộ kit rt pcr để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (lmlm) đại diện đang lưu hành ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ  KIỀU MẠNH HÙNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG (LMLM) ĐẠI DIỆN ĐANG LƯU HÀNH Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC HÀ NỘI - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ  KIỀU MẠNH HÙNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG (LMLM) ĐẠI DIỆN ĐANG LƯU HÀNH Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Nano sinh học Chuyên ngành đào tạo thí điểm LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỒNG VĂN QUYỀN HÀ NỘI - 2012 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC VIẾT TẮT MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................... 2 1.1 Tình hình bệnh lở mồm long móng trên thế giới và tại Việt Nam ............... 2 1.1.1 Tình hình bệnh LMLM trên thế giới ............................................................ 2 1.1.2 Tình hình phát triển bệnh LMLM ở Việt Nam ............................................ 3 1.1.2.1 Lịch sử bệnh............................................................................................ 3 1.1.2.2 Tình hình dịch bệnh trong những năm gần đây ...................................... 4 1.2 Bệnh Lở mồm long móng ............................................................................ 6 1.2.1 Sơ lược về bệnh Lở mồm long móng ........................................................... 6 1.2.2 Đặc tính sinh học của virus LMLM ............................................................. 7 1.2.2.1 Hình thái và cấu tạo ................................................................................ 7 1.2.2.2 Phân loại ................................................................................................. 8 1.2.3 Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên ........................... 9 1.2.4 Đặc tính gây bệnh ......................................................................................... 9 1.2.5 Đường xâm nhập và phương thức lây lan .................................................... 9 1.2.5.1 Đường lây lan ......................................................................................... 9 1.2.5.2 Nguồn bệnh ............................................................................................. 10 1.2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ............................................................... 10 1.2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng ................................................................................ 10 1.2.6.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm ........................................................ 10 1.2.6.3 Phương pháp chẩn đoán virus học .......................................................... 11 1.2.6.4 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học ............................................... 11 1.2.6.5 Phản ứng kết hợp bổ thể ......................................................................... 11 1.2.6.6 Phản ứng trung hòa virus ........................................................................ 11 1.2.6.7 Phản ứng ELISA ..................................................................................... 12 1.2.6.8 Phương pháp RT-PCR ............................................................................ 12 1.2.6.9 Phương pháp phân loại dựa trên cây phát sinh chủng loại (phylogentic trees)......................................................................... 13 1.3 Cấu trúc hệ gen của virus LMLM ................................................................ 13 1.3.1 Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM....................................................... 13 1.3.2 Gen mã hóa protein VP1 .............................................................................. 15 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................... 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 16 2.2 Vật liệu ......................................................................................................... 16 2.2.1 Sinh Phẩm .................................................................................................... 16 2.2.2 Hóa chất....................................................................................................... 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 2.3.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số .......................................................... 17 2.3.2 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu gen VP1 của virus LMLM .................. 17 2.3.3 Phương pháp khuếch đại gen VP1 bằng RT-PCR ...................................... 18 2.3.4 Phương pháp tạo dòng gen .......................................................................... 18 2.3.4.1 Phương pháp gắn sản phẩm RT- PCR vào vector tách dòng ................. 18 2.3.4.2 Phương pháp biến nạp ............................................................................ 19 2.3.4.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli .................... 20 2.3.4.4 Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn ........................................ 21 2.3.5 Tổng hợp chúng dương RNA ....................................................................... 21 2.3.6 Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích đặc điểm di truyền .......... 22 ́ ̉ ̉ CHƢƠNG 3. KÊT QUA VÀ THAO LUẬN ............................................ 23 3.1 Tách chiết được RNA tổng số của virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm .......... 23 3.2 Xây dựng quy trinh kỹ thuâ ̣t RT -PCR phát hiê ̣n virus LMLM ................... 24 ̀ 3.2.1 Kiểm tra tính đă ̣c hiê ̣u của că ̣p mồ i chung (universal) khuế ch đa ̣i gen V ... 24 P1 3.2.2 Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u và đô ̣ nha ̣y của phản ứng mRT -PCR......................... 25 3.2.3 Phát hiện virus LMLM trong mẫu bệnh phẩm ............................................. 26 3.3 Tách dòng xác định trình tự gen VP1 .......................................................... 26 3.3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen VP1................................................... 26 3.3.2 Giải trình tự gen mã hóa protein VP1 .......................................................... 28 3.4 Kế t quả phân tích cây phát sinh chủng loại.................................................. 29 ́ KÊT LUẬN ................................................................................................. 31 ́ KIÊN NGHI ................................................................................................ 31 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 32 PHỤ LỤC .................................................................................................... 38 DANH MỤC VIẾT TẮT Amp Ampicilin Bp (bp) Base pair Cre cis – acting replication element DNA Acide Deoxyribonucleic E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Dimine Tetra acetic Acid ER Endoplasmic Reticulum EtBr Ethidium Bromide IRES Internal Ribosome Entry Site IPTG Isopropyl – β – D – Thiogalactopyranoside LB Môi trường Lauria Betani LMLM Lở mồm long móng OIE Ofice International Epidemiology ORF Open Reading Frame PCR Polymezase Chain Reaction RGD Arginyl – Glycyl – Aspatic Acid RNA Acide Ribonucleic RT-PCR Reverse trancriptase – PCR Sol I, II, III Solution I, II, III TAE Tris – Acetae – EDTA v/p Vòng/phút WHO Who Health Orgnizations 1 MỞ ĐẦU Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính cực kỳ nguy hiểm do virus LMLM (Foot and Mouth Disease Virus) gây ra trên động vật móng guốc chẵn như lợn, bò, trâu, hươu, dê... Bệnh lây lan rất nhanh qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, qua con đường hô hấp, tiêu hóa, sinh dục... Chính vì vậy mà Tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong các bệnh truyền nhiễm ở động vật. Ở Việt Nam, từ nhiều năm qua dịch bệnh xuất hiện và tái xuất hiện thường xuyên gây ra thiệt hại kinh tế rất lớn đối với ngành chăn nuôi. Đặc biệt năm 2006, dịch bệnh LMLM xảy ra rất mạnh ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước với hàng chục nghìn gia súc bị nhiễm bệnh. Trong những tháng đầu năm 2011, dịch LMLM trên gia súc tại nhiều địa phương trên cả nước có biểu hiện bùng phát mạnh. Chỉ trong hơn 10 ngày đầu tháng 2, dịch đã diễn biến khó lường và xuất hiện đồng thời ở cả 3 miền. Chẩn đoán chính xác sự lây nhiễm và tiêm vaccine phòng dịch bệnh có ý nghĩa to lớn trong việc kiểm soát tới thanh toán được dịch bệnh nguy hiểm này. Việc phòng chống bệnh LMLM ở nhiều nước đã trở thành một chính sách rất quan trọng, nhất là trong nền kinh tế thị trường. Việc có hay không bệnh LMLM trong sản xuất, chăn nuôi là một tiêu chí trong quan hệ buôn bán quốc tế và mọi quốc gia đều sử dụng nó như là một thứ vũ khí thương mại. Trong thời gian gần đây, tình hình diễn biến của dịch bệnh LMLM xảy ra ở các nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng ngày càng trở nên phức tạp và khó kiểm soát. Ở Việt Nam, một trong những mục tiêu quan trọng nhất của ngành thú y phấn đấu thực hiện là : khống chế một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc, mà đặc biệt là bệnh LMLM. Do đó, nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, xác định các type virus đang lưu hành trong nước cũng như tìm hiểu nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền của các type virus này là rất cần thiết cho việc phòng chống bệnh cũng như định hướng cho việc nhập khẩu, sản xuất và triển khai vaccine một cách hiệu quả. Hiện nay việc chẩn đoán virus LMLM từ các bệnh phẩm thực địa đều phải dùng bộ kit mua của nước ngoài. Đây là một hạn chế trong việc chủ động và nhanh chóng phòng chống bệnh dịch trong nước, ngoài ra cũng rất tốn kém. Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại hiện đang lưu hành ở Việt Nam Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lở mồm long móng trên thế giới và tại Việt Nam 1.1.1 Tình hình bệnh LMLM trên thế giới Bệnh LMLM đã xuất hiện ở nhiều nước thuộc Châu Á, Châu Phi, Mỹ La tinh và Châu Âu. Điển hình là trong những năm 1981-1985, dịch xuất hiện ở 80 nước, gây nên tổn thất lớn cho nền kinh tế của những nước này[8,9,10,58,63]. Năm 1997, dịch xảy ra ở lợn trên toàn lãnh thổ Đài Loan, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và để lại hậu quả xấu cho ngành chăn nuôi lợn trong nhiều năm. Các nước Nhật Bản và Hàn Quốc là những nước từ lâu không có bệnh LMLM nhưng đến năm 2000 đã xuất hiện bệnh này [17]. Tại Châu Âu năm 2001 dịch đầu tiên xảy ra ở Anh, sau đó lan ra Pháp, Hà Lan, Ireland qua con đường vận chuyển gia súc. Từ khi ngừng việc sử dụng vaccine ở các nước thuộc Liên minh Châu Âu (EU) 1991, đã có những ổ dịch nhỏ xảy ra ở Italia 1993[20]; Hy Lạp 1994-1996; Nga 1995. Tính đến tháng 4 năm 2000 ở Nga đã phát hiện một ổ dịch tại một làng ở Viễn Đông, 625 trong số 965 con lợn của đàn bị mắc bệnh, 111 con bị chết do virus LMLM type O gây ra. Nga tiếp tục dùng vaccine xung quanh Moscow vì ở đây có sân bay quốc tế và gần các nhà máy sản xuất vaccine. Việc tiêm phòng cũng được tiến hành dọc theo biên giới phía Nam của Nga. Từ những bằng chứng vừa nêu, có thể khẳng định chưa bao giờ Châu Âu hoàn toàn không có dịch bệnh LMLM. Các ổ dịch nổ ra lặp đi lặp lại, một số đó được khẳng định và một số vẫn chưa có bằng chứng xác đáng. Nguyên nhân chính của việc tái phát các vụ dịch được cho là do sự di chuyển bất hợp pháp gia súc sống từ vùng Anatolia của Thổ Nhĩ Kỳ vào phần lãnh thổ của Thổ Nhĩ Kỳ ở Châu Âu. Tại Nam Mỹ, Chile, Guyana, Suriname không thấy bệnh LMLM trong thập kỷ 90 và trong khoảng 8 năm trở lại đây đã có những tiến bộ đáng kể về hiệu quả của các chương trình khống chế bệnh LMLM [18]. Mặc dù các bằng chứng đưa ra kém thuyết phục hơn nhưng một số nước khác như Argentina, Paraguay, Uruguay, Bolivia, Colombia, Brazil… [16] cũng rất cố gắng trong việc phòng chống bệnh LMLM với kết quả làm giảm thiểu số lượng ổ dịch được công bố. Tại Châu Á, virus LMLM thuộc type O và A có mặt ở hầu hết các nước vùng Trung Đông, cùng với sự thâm nhập của type Asia 1 vào Saudi Arabia. Ở Ấn Độ việc khống chế bệnh LMLM là rất khó bởi số lượng đầu gia súc là rất lớn, ước tính 164 triệu cừu, dê; 200 triệu bò; 80 triệu trâu…Virus type O, A, C, Asia 1 lưu hành khắp nơi và những cố gắng của người chăn nuôi bò sữa tìm cách khống chế bệnh một cách riêng rẽ đều không đem lại kết quả. Hơn nữa các nước láng giềng như Pakistan, Bhutan, Nepal, Bangladesh đã làm lây nhiễm nhiều chủng loại virus LMLM của họ cho Ấn Độ [31]. Trung Quốc là nước có đường biên giới rất dài với Việt Nam, là nước thường xuyên có bệnh LMLM, việc buôn bán trao đổi hàng hóa giữa Việt Nam và Trung Quốc, nhất là việc buôn bán vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật là 3 nguyên nhân lây lan dịch bệnh giữa hai nước [62]. Ở khu vực Đông Nam Á, một số nước có dịch như Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanmar, Philippines, Malaysia và Viêt Nam đã chịu những thiệt hại rất lớn do dịch gây ra [23]. Ở Thái Lan, khi bị dịch này, chính phủ đã chi mỗi năm hàng triệu USD để khống chế dịch. Ngoài ra, Liên Hợp Quốc còn hỗ trợ thêm 36 triệu USD để thành lập Trung tâm chẩn đoán LMLM để định chủng virus, nghiên cứu dịch tễ và sản xuất vaccine. Thái Lan đã có 7/9 vùng kinh tế đã sạch bệnh và ở 7 vùng này vẫn xuất khẩu động vật, sản phẩm động vật và nông sản đi nhiều nước với số lượng lớn. Indonesia đã thanh toán được bệnh này từ năm 1983, Phillippines đã được Tổ chức Thú ý Thế giới OIE công nhận an toàn ở vùng Mindanao, Visay và Luzon. Nhiều nước trên thế giới đã thanh toán được bệnh dịch LMLM như Australia, New Zealand, các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương, các nước thuộc EU, các nước thuộc vùng Bắc Trung Mỹ. Các nước trên đều phải thực hiện một chương trình quốc gia về tiêm phòng nhiều năm, kiểm dịch và các biện pháp khác theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới [58]. 1.1.2 Tình hình phát triển bệnh LMLM ở Việt Nam 1.1.2.1 Lịch sử bệnh Năm 1898, bệnh LMLM được phát hiện lần đầu tiên ở Nha Trang [1]. Sau đó bệnh lan rộng ra cả 3 miền Bắc, Trung, Nam [4]. Cùng thời gian này bệnh xuất hiện ở các nước lân cận như Lào, Campuchia, Thái Lan… Trong gần trọn một thế kỷ, bệnh này đã tồn tại và phát triển trên địa bàn 107 trong tổng số 229 huyện thuộc 26 tỉnh, gây nên hàng trăm ổ dịch, làm cho hàng chục vạn trâu, bò và lợn bị bệnh. Theo tài liệu đã theo dõi được, diễn biến của bệnh dịch ở các địa phương trong những năm qua như sau: Trong 2 năm 1921-1922, một số ổ dịch ở các tỉnh phía Bắc, gây ra 690 ổ dịch, làm 13.018 con trâu, bò và lợn bị bệnh, trong đó 446 con bị chết. Năm 1960, nhờ các biện pháp phòng chống dịch triệt để, bệnh này hầu như đã bị tiêu diệt ở các tỉnh phía Bắc. Năm 1969-1970, ở miền Nam, bệnh dịch lại xảy ra nghiêm trọng trên đàn trâu tại khu vực Sài Gòn-Chợ Lớn; từ đó lây lan trong các tỉnh lân cận và tấn công vào 5 trại lợn công nghiệp ở Nam Bộ. Năm 1975, bệnh dịch này xảy ra liên tiếp ở 17 tỉnh phía Nam từ Quảng Nam Đà Nẵng trở vào tới các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Từ năm 1976 đến 1983, theo số liệu thống kê được, đã có 98 ổ dịch ở các tỉnh phía Nam, làm 26.648 con trâu , bò và 2.919 con lợn bị bệnh. Riêng trong năm 1983, các ổ dịch từ trâu, bò đã lan sang một trại lợn công nghiệp ở Vũng Tàu làm 2.200 con lợn bị bệnh. Trong những năm cuối thập kỷ 80, một số tỉnh phía Nam như An Giang, Tây 4 Ninh, Sông bé, Đồng Tháp thường xuyên bị dịch LMLM do lây lan từ Campuchia sang. Năm 1989, riêng tỉnh Đồng Nai có 3 huyện là Long Đất, Long Thành và Xuyên Mộc bị dịch kéo dài từ đầu tháng 5 đến giữa tháng 10, làm 3.514 con trâu, bò và lợn bị bệnh. Năm 1990, dịch cũng xuất hiện ở 4 huyện thuộc tỉnh Thuận Hải, làm hơn 7.500 con trâu, bò bị bệnh. Dịch cũng xảy ra ở huyện Lộc Ninh, tỉnh Sông Bé làm 100 con trâu bò bị ốm không cày kéo được. Chỉ tính riêng năm 1993, dịch đã lan rộng ra trên địa bàn 107 huyện của 26 tỉnh, làm cho 236.000 trâu, bò và 11.000 con lợn bị bệnh. Điển hình như ở tỉnh Đồng Tháp, chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh dịch đã lan rộng ra 10 huyện trong tổng số 11 huyện của tỉnh, làm cho 5.135 trâu, bò và lợn bị bệnh, nhiều con bị chết. Ở tỉnh Kiên Giang dịch cũng xảy ra trên địa bàn của 10 huyện, làm gần 2.000 trâu, bò và lợn bị dịch. 1.1.2.2 Tình hình dịch bệnh trong những năm gần đây Năm 1999, trong lúc vẫn tồn tại một số ổ dịch cũ ở cá tỉnh miền Trung và miền Nam thì đợt dịch mới lây lan từ Trung Quốc đã tấn công các tỉnh giáp biên. Cao Bằng là tỉnh đầu tiên bị dịch (tháng 6/199) và sau đó dịch lây lan ra nhiều tỉnh khác ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam. Tính đến nay ngày 10/3/2000, đã có 58 tỉnh có dịch, làm 297.808 trâu, bò và 36.530 lợn bị bệnh. Trong đợt dịch lớn năm 1999-2000, kết quả chẩn đoán các ổ dịch đều là virus type O có quan hệ cấu trúc gen rất gần với virus type O gây bệnh ở Hồng Kông năm 1997. Đặc biệt lần này dịch phảt ra ở các tỉnh Đồng bằng Sông Hồng sau gần 40 năm an toàn dịch bệnh, gây ảnh hưởng lớn cho vùng nguyên liệu xuất khẩu. Năm 2001 bệnh LMLM chỉ xảy ra ở 16 tỉnh, thành phố với 3.976 trâu, bò mắc bệnh. Năm 2002 bệnh LMLM xảy ra ở 26 tỉnh, thành với 10.287 trâu bò, mắc bệnh. Năm 2003 bệnh LMLM xảy ra ở 38 tỉnh, thành phố, trong đó 28 tỉnh có dịch LMLM trâu bò, 28 tỉnh có dịch ở lợn (có 18 tỉnh dịch xảy ra ở cả trâu bò và lợn), với tổng số 20.303 trâu bò, 1.178 dê và 3.533 lợn mắc bệnh. Các tỉnh có số trâu bò mắc bệnh nhiều như: Quảng Trị, Phú Yên, Đắc Lắc, Khánh Hòa, Gia Lai, Hà Giang. Năm 2004 (đến tháng 8/2004) dịch xảy ra ở 577 xã phường, 169 huyện, thị của 45 tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương, (trong đó 32 tỉnh có dịch LMLM trâu bỏ, 22 tỉnh có dịch ở lợn, 16 tỉnh dịch xảy ra ở cả trâu bò và lợn), với tổng số 25.658 trâu bò, 1.555 lợn và 127 dê mắc bệnh, tăng hơn nhiều so với cùng kỳ năm 2003 cả về diện dịch xảy ra ở các tỉnh có ngành chăn nuôi phát triển, ở các vùng chăn nuôi trọng điểm, ảnh hưởng đến chương trình xuất khẩu và phát triển chăn nuôi bò sữa của nhiều tỉnh thành. Nguyên nhân xảy ra dịch là do tái phát các ổ dịch cũ, các địa phương chưa có kế hoạch, chương trình và tổ chức phòng chống một cách chủ động, có hiệu quả, chưa tổ chức tiêm phòng, giám sát các ổ dịch một cách chặt chẽ. Năm 2005, dịch LMLM xảy ra ở 408 xã, phường của 160 quận, huyện thuộc 37 5 tỉnh, thành phố gồm : Bình Phước, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Long An, Bà Rịa Vũng Tàu, Bến Tre, TP.Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Đồng Tháp, Trà Vinh, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Kiên Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Tiền Giang, Bạc Liêu, Cà Mau, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Đắc Lắc, Đắc Nông, Gia Lai, Kon Tum, Khánh Hòa, Quảng Nam, Nghệ An, Quảng Bình, Thanh Hóa, Ninh Bình, Yên Bái, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lào Cai, Hải Phòng và Hải Dương với 28.241 trâu, bò 3.976 lợn và 81 dê mắc bệnh. Năm 2006, dịch LMLM xảy ra ở nhiều nơi trong cả nước, hầu hết các tỉnh thành thông báo có dịch LMLM nguyên nhân chính là do type O [24]. Các nghiên cứu dịch tễ học kết hợp với chẩn đoán lâm sàng cũng cho thấy, có type LMLM đang lưu hành ở Việt Nam gồm type O, A và Asia 1 và là nguyên nhân gây ra các đợt dịch trong những năm gần đây trong đó type O được cho là type virus phổ biến nhất [22,35,60]. Type Asia 1 là nguyên nhân chính của đợt dịch 2007 [24,38]. Năm 2008, dịch LMLM đã xảy ra tại 122 xã, phường của 43 huyện, quận của 14 tỉnh thành làm 2.408 con trâu, bò và 67 con lợn mắc bệnh. Tổng số gia súc chết và tiêu hủy là 218 trâu, bò và 39 con lợn. Nguyên nhân là do virus type O, A. Chủng vius gây bệnh: hầu hết các ổ dịch LMLM năm 2008 xảy ra là do chủng O. Tháng 12/2008 virus chủng A đã xuất hiện tại Nghệ An. Năm 2009, dịch đã xảy ra ở 229 xã, phường thuộc 87 huyện, quận của 27 tỉnh, thành phố với tổng số 7.861 con trâu, bò mắc bệnh 432 con phải tiêu hủy; trên lợn dịch xả ra ở 35 xã, phường thuộc 23 huyện, quận của 16 tỉnh, thành phố làm 499 con lợn mắc bệnh LMLM, 429 con phải tiêu hủy. Tháng 9/2009, dịch xảy ra trên quy mô rộng, trong tháng xuất hiện trên 90 ổ dịch, sau đó số ở dịch giảm dần. Về chủng virus gây bệnh hầu hết các ổ dịch LMLM xảy ra trong năm 2009 là do chủng O; chủng A xuất hiện ở các tỉnh Hà Giang, Sơn La, Bắc Giang, Kon Tum và Long An. Năm 2010, dịch đã xảy ra ở 297 xã thuộc 103 huyện của 28 tỉnh, thành phố là Bắc Ninh, Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Lào Cai, Yên Bái, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Điện Biên, Lai Châu, Sơn La, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Ngãi, Phý Yên, Khánh Hòa, Gia Lai, Đắc Lắc, Bình Phước, Bà Rịa Vũng Tàu, Long An, Tiền Giang, Sóc Trăng, Phú Thọ và Thái Nguyên với tổng số 16.333 con trâu, bò mắc bệnh, 419 con trâu bò tiêu hủy, trong đó có 16 tỉnh thành phố có lợn bị mắc bệnh LMLM, với tổng số 1.675 con lợn mắc bệnh 848 con phải tiêu hủy. Dịch xảy ra trên quỹ mô rộng vào tháng 12/2010 với trên 98 ổ dịch và 11/2010 là 56 ổ dịch xuất hiện trong tháng, các tháng khác dịch xảy ra ít hơn và rải rác tại nhiều địa phương. Từ năm 1996-2011, bệnh LMLM đã xảy ra tại 2.873 (26% trong tổng số 11.020) xã, làm tổng số là 5.630 lượt xã có dịch thuộc 463 (66,7% trong tổng số 694) 6 huyện thị, thành phố của tất cả 63 tỉnh, thành phố. Tổng số có 238.669 trâu, bò và lợn bị bệnh trong giai đoạn này [64]. 1.2 Bệnh Lở mồm long móng 1.2.1 Sơ lƣợc về bệnh Lở mồm long móng Bệnh Lở mồm long móng (viết tắt là LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật móng guốc chẵn như : trâu, bò, lợn, dê, hươi, nai…[7,17]. Sự nguy hiểm của bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh. Sự lây lan không chỉ do tiếp xúc giữa động vật khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều con đường kể cả qua không khí. Vì vậy bệnh thường phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội nhiều nước thuộc nhiều châu lục trên thế giới. Do bệnh không lây lan sang người nên đôi khi công tác phòng chống dịch bệnh không nhận được sự hưởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng. Bệnh thường gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản như bò sữa, bò thịt, lợn hướng nạc. Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảm sản lượng sữa và là động vật mang trùng, vì vậy các nước có nền chăn nuôi, kinh tế phát triển rất quan tâm. Mặc dù xuất hiện như một loại bệnh nhẹ, có tỷ lệ tử vong thấp ngoại trừ những con vật non, từ 2-5% đối với gia súc trưởng thành và 20-50% ở đàn gia súc như bê, nghé, lợn con. Ở gia súc sinh sản, bệnh LMLM làm sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, sản lượng sữa giảm 50% do viêm vú và lượng sữa thu được phải trải qua nhiều khâu khử trùng phức tạp mới sử dụng được. Điều này cho thấy sự thiệt hại về kinh tế do bệnh LMLM gây ra là rất trầm trọng [32]. Khi dịch bệnh xảy ra gây hậu quả nghiêm trọng cho nền kinh tế, xã hội cũng như các vấn đề về môi trường ở khu vực có dịch vì thế bệnh LMLM được đặt ở vị trí số 2 bảng A trong danh mục các bệnh truyền nhiễm ở gia súc. Bệnh LMLM được xếp vào danh mục các bệnh bắt buộc phải khai báo và Luật thú y thế giới quy định nước hoặc vùng có bệnh LMLM không được xuất khẩu động vật, sản phẩm động vật và hạn chế xuất khẩu các loại nông sản khác. Mọi quốc gia trên thế giới đều phải quan tâm và có chương trình phòng chống bệnh LMLM. Bệnh thường gây nên những hậu quả nghiêm trọng về các mặt kinh tế, xã hội và bảo vệ môi trường nên được xếp là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc, đồng thời cũng được ghi trong hiệp định buôn bán, vận chuyển động vật và sản phẩm động vật giữa các nước. 7 1.2.2 Đặc tính sinh học của virus LMLM 1.2.2.1 Hình thái và cấu tạo Virus gây bệnh LMLM là loại virus nhỏ nhất thuộc họ Picornavirideae nhóm Aphthovirus,có kích thước 20-30 nm, có cấu trúc đa diện 30 mặt đều, hạt virus chứa 30% acid nucleic, là một đoạn RNA. Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chính tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM. Hình 1.1 Cấu trúc lớp vỏ capsid của virus LMLM và vị trí của các kháng nguyên (3 protein bề mặt VP1, VP2, và VP3 trong cấu trúc icosahadrel các mặtđối xứng, thể hiện Pseudo T=3 sắp xếp của 60 bản sao của mỗi protein cấu trúc virus VP1-4). Mỗi tiểu đơn vị ( các protomer sinh học bắt nguồn từ các polyprotein không tách biệt) có các màu tiêu chuẩn : VP1xanh dương, VP2 xanh lá, VP3 đỏ, ( VP4 không được thể hiện vì nó ở bên trong). Dư lượng đoạn Arg-Gly-Asp thể hiện màu cam (RGD) Virus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của chúng được cấu tạo bởi một màng lipid. Do vậy chúng có sức đề kháng cao đối với các loại dung môi hữu cơ (như cồn, ete…). Tuy nhiên, virus LMLM lại rất mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol… 8 Hình 1.2 Cấu trúc của virus LMLM (a) Chiều sâu bề mặt phân tử của bệnh LMLM type O. Màu đỏ cho biết khu vực gần trung tâm nhất của các virion và màu vàng là xa đi. Các tiểu đơn vị 12S pentameric được chỉ định. (b) Sơ đồ Ribbon hiển thị các polypeptide bên ngoài lớp vỏ capsid, VP1 màu xanh lam, VP2 màu đỏ và VP3 màu xanh lá. Các dư lượng liên quan đến 5 vị trí gắn kháng nguyên của type O là các vị trí màu vàng.Các trục đối xứng 2, 3, và 5. 1.2.2.2 Phân loại Virus LMLM được hai nhà khoa học Đức là Loefler và Frosch phân lập lầu đầu tiên vào năm 1987. Cho đến năm 1902, hai nhà khoa học Pháp Vallée và Carée lần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò được gọi là type O (phân lập được tại vùng Oisée – Pháp) và type A (phân lập được tại vùng Ardène – Pháp) có trong đàn bò nhập từ Đức. Năm 1926 hai nhà khoa học Đức là Waldmann và Trautwein đã phân lập được 3 type virus LMLM và đặt tên là A, B, C. Nhưng sau đó các nhà khoa học thấy rằng hai type A và B có đặc tính giống với 2 type O và A mà hai nhà khoa học Pháp đã phân lập được trước đó. Cho đến năm 1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất gọi các type là O, A, C [3]. Type Asia 1 do Brooksby và Rogere (1957) tìm thấy ở Pakistan, đây là type hay gây bệnh phổ biến ở lục địa Châu Á. (cận Đông, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông…) [34]. Type SAT1, SAT2, SAT3 (Southern African Teritoties) tìm thấy ở Nam Phi và được giám định tại viện Pirbright (Anh) trên các bệnh phẩm bò ở miền Nam và Bắc Rhodesia. Các type này chủ yếu có trên lục địa Châu Phi (Nam, Trung và Đông Phi, Saudan, Ai cập…) phổ biến nhất là các type SAT1, mới đây cũng thấy type SAT1 tại vùng Trung Cận Đông. Bệnh gây ra bởi chủng virus thuộc họ Picornaviridae nhóm Aphthovirus. Virus có 7 type là type A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1 [11], các type khác nhau có độc lực khác nhau. Những virus này thường biến hóa không ngừng thành những chủng phụ mới có khác biệt về tính kháng nguyên, tồn tại bền vững, đã có hơn 70 phân type được xác định [57], vì vậy phải thường xuyên chẩn đoán định chủng virus 9 chính xác qua xét nghiệm tại phòng thí nghiệm thì mới chọn được loại vaccine thích hợp để phòng cho từng vùng và từng thời kỳ. Các type virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhưng không có miễn dịch bảo hộ chéo với nhau. Đây chính là một khó khăn về kỹ thuật và gây tốn phí lớn về kinh tế trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh thích hợp cho từng khu vực dịch. Phương pháp phân loại virus chủ yếu dựa trên kháng nguyên. Cho đến nay chưa phát hiện thêm type nào mới nhưng các chủng virus LMLM do có genome là RNA nên liên tục có sự biến đổi tạo ra các subtype mới. Trước đây các subtype thường được ký hiệu bằng số mũ như O1, A32…thì nay người ta thống nhất ký hiệu là O1, A32… 1.2.3 Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên Visus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của virus là một lớp lipid do vậy virus có tính đề kháng cao với các dung môi hữu cơ (cồn, ete…). Tuy nhiên virus LMLM lại khá mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, formol, acid, kiềm. Như với dung dịch NaOH 0,5-1% tiêu diệt virus một cách nhanh chóng 5 phút. Ở phân, nước tiểu, máu, những chỗ loét hay với nước bọt trâu, bò, virus có thể tồn tại từ 5-10 ngày sau khi nhiễm ở 180C. Nhiệt độ lạnh là một nhân tố bảo tồn virus LMLM một cách khá tốt. Trong tủ lạnh, virus cũng hoạt lực sau 425 ngày. Thịt ướp đông lạnh xong sấy khô có thể giữ virus tồn tại trong 52 tháng . Gia súc khỏi bệnh trở thành vật mang trùng lâu dài, đặc biệt là trâu, bò. Chính những con mang trùng này là nguyên nhân tái phát ổ dịch cũ và phát sinh ổ dịch mới ở nơi chúng được đưa đến. Theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới gia súc tại các ổ dịch cũ, trong khi thực hiện công tác giám sát dịch tễ, nếu phát hiện có dương tính với bệnh LMLM phải giết hủy hoặc đánh dấu không cho vận chuyển. 1.2.4 Đặc tính gây bệnh Bệnh LMLM là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, có khả năng lây lan nhanh, mạnh với phạm vi rất rộng đối với các loài động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu. Loài động vật một móng như ngựa, lừa, la, gia cầm, chim không bị mắc bệnh, nhưng vịt có thể bị mắc. Trong phòng thí nghiệm, chuột lang, chuột nhắt trắng, chuột đồng, chuột Hamster dễ cảm nhiễm. Khía da bàn chân của chuột lang rồi chà xát bệnh phẩm có virus lên thì sau 12-24 giờ quan sát thấy có nổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thủy nhũng, đau chỗ khía, sau 48-72 giờ thấy nổi mụn nước đặc trưng, nhiễm trùng toàn thân, xuất hiện nhiều mụn ở miệng, lưỡi, lợi và có tình trạng thần kinh với triệu chứng tê liệt, co giật [1,2]. 1.2.5 Đƣờng xâm nhập và phƣơng thức lây lan 1.2.5.1 Đƣờng lây lan Lây lan trực tiếp: mầm bệnh có xâm nhập do tiếp xúc trực tiếp giữa gia súc có mang mầm bệnh và gia súc cảm nhiễm qua tổn thương ở da Lây lan gián tiếp: mầm bệnh theo thức ăn nước uống xâm nhập vào cơ thể gia súc qua đường tiêu hóa, qua không khí vào đường hô hấp. 10 Trong ổ dịch, mầm bệnh chủ yếu lây truyền qua không khí vào đường hô hấp, tiếp theo là qua thức ăn nước uống, chất thải, dụng cụ chăn nuôi, người chăn nuôi và cán bộ thú y mang mầm bệnh truyền đi. Bệnh lây lan từ vùng này sang vùng khác qua con đường tiêu thụ, vận chuyển súc vật sống và sản phẩm động vật không được kiểm dịch chặt chẽ. Từ các ổ dịch cũ không được khử trùng triệt để, mầm bệnh còn tồn tại trong môi trường sẽ gây bệnh cho gia súc. 1.2.5.2 Nguồn bệnh Nguồn bệnh từ các nước láng giềng có thể xâm nhập vào do vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật có mang mầm bệnh. Do sự tiếp xúc của gia súc nước ta và gia súc các nước có dịch trên đồng cỏ chăn thả tự nhiên ở vùng biên giới Do việc vận chuyển động vật và sản phẩm động vật từ vùng có dịch đến vùng khác. Do mầm bệnh LMLM tồn tại ở địa phương và tái phát ở các ổ dịch cũ. Do động vật hoang dã mang mầm bệnh truyền cho gia súc. 1.2.6 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 1.2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng Việc chẩn đoán lâm sàng bệnh sốt LMLM có thể thực hiện trong các trường hợp bệnh xảy ra tại khu vực đó được xác định là có dịch sốt LMLM. Các triệu chứng chính của bệnh là sự xuất hiện các mụn nước trong khoang miệng (lưỡi, lợi), quanh mũi, vành tiếp giáp da với móng chân, kẽ chân và các đầu vú (đối với bò sữa, lợn nòi). Kèm theo các triệu chứng trên là các hiện tượng con vật bị què do chân nhiễm trùng, đi lại gặp nhiều khó khăn. Thông thường lợn mắc bệnh dễ bị tụt móng hơn trâu, bò. Các mụn nước sau này tiến triển thành những vết loét tạo điều kiện cho sự bội nhiễm thứ phát. Tuy nhiên, việc chẩn đoán lâm sàng thông thường rất dễ bị nhầm lẫn với các bệnh khác như bệnh viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước ở lợn, bệnh ngoại bang, bệnh tả trâu, bệnh đậu gia súc, bệnh nhiệt thán. Mặt khác, không phải tất cả số gia súc mắc bệnh đều có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng một cách rõ rệt. Do vậy, cần kết hợp với các số liệu dịch tễ khác để có thể chẩn đoán chính xác. 1.2.6.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Tại các nơi chưa bao giờ xảy ra dịch LMLM, các triệu chứng lâm sàng chỉ có tính chất định hướng nhất định trong việc chẩn đoán, vì thế nên ta nhất thiết phải dùng các biện pháp chẩn đoán bằng xét nghiệm trong phòng thí nghiệm để khẳng định bệnh. Nhất là đối với bệnh LMLM, do tính chất phức tạp về chủng loại của virus. Các chủng này gây nên những triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng lại không tạo miễn dịch chéo cho nhau, cho nên phải có phòng thí nghiệm chuyên biệt để xác định chính xác chủng và type virus, từ đó mới có quyết định dùng vaccine phù hợp, giúp cho việc phòng chống dịch bệnh có hiệu quả. Loại trừ 3 chủng SAT1, SAT2, SAT3 chỉ có ở các nước Châu Phi còn các nước khác trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng chỉ có 4 type mà hiện nay cần phải xác định và phân biệt đó là O, A, C, Asia 1. 11 Trong thời kỳ ủ bệnh, phải lấy mụn nước trong niêm mặc hầu của bệnh vật. Khi đó có mụn nước, dùng kim hút dịch trong mụn. Còn ở những con vật đã lành bệnh thì lấy máu hoặc huyết thanh để làm các phản ứng huyết thanh học xác định hiệu giá kháng thể. 1.2.6.3 Phƣơng pháp chẩn đoán virus học Dùng bệnh phẩm tiêm vào nội bì lưỡi bò, bò này không nằm trong phạm vi ổ dịch, chưa hề mắc bệnh bao giờ, và chưa được tiêm vaccine LMLM. Sau khi tiêm 2448 giờ. Nếu mẫu bệnh phẩm mang virus LMLM sẽ xuất hiện mụn nước ở chỗ tiêm, sau đó sẽ hình thành vết loét. Ngoài ra có thể dùng chuột lang để gây bệnh bằng cách khía da chân rồi bôi bệnh phẩm lên,sau 12-24 giờ các chỗ khía nổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thủy thông, hình thành vết loét rồi nhiễm trùng toàn thân mà chết. 1.2.6.4 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học Người ta thường dùng các phản ứng huyết thanh học để chẩn đoán và giám định virus LMLM, phát hiện kháng nguyên virus và để phân biệt các chủng virus mới với nhau hoặc giữa các chủng phân lập được và chủng dùng trong vaccine. Sự phân biệt giữa chủng thường được tiến hành bằng cách định lượng kháng nguyên có phản ứng chéo nhờ các kháng huyết thanh đồng nhất và dị loại. Tuy nhiên, các phản ứng chéo lúc nào cũng cho một hình ảnh chính xác về tình hình thực tế về thực địa ổ dịch. Kết quả của các phản ứng huyết thanh học thường rất khó được lý giải và chúng không cho phép nghiên cứu thêm về sự tiến hóa của virus hay nghiên cứu tìm kiếm nguồn gốc của ổ dịch. Thêm vào đó, các phương pháp này nhìn chung có độ nhạy không cao, chưa đáp ứng được như cầu của một nghiên cứu dịch tễ học hiện đại. Một số phương pháp thông dụng được sử dụng gồm : 1.2.6.5 Phản ứng kết hợp bổ thể Phản ứng kết hợp bổ thể được thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung khuẩn và hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể. Huyết thanh miễn dịch của từng serotype trên chuột lang: bằng phương pháp gây tối miễn dịch, tiên vaccin LMLM của type khác nhau vào trong da dưới gang bàn chân chuột lang (mỗi type một chuột ) hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt huyết thanh có chứa kháng thể. Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào mổi trường tế bào tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc cừu non hoặc các dòng tế bào có độ nhạy tương đương, khi tế bào nuôi xuất hiện các biến đổi tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể. Phản ứng kết hợp bổ thể cũng đã được hoàn thiện rất kỹ và khi sử dụng thành thục sẽ là một phương tiện hữu hiệu để chẩn đoán phân biệt giữa virus LMLM và các virus gây bệnh viêm mụn nước khác. 1.2.6.6 Phản ứng trung hòa virus Virus LMLM có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể đặc hiệu, sự kết hợp giữa virus với kháng thể đó làm cho virus không còn khả năng gây bệnh được nữa. 12 Phản ứng trung hòa rất có giá trị trong các trường hợp bệnh diễn ra ở thể nhẹ, không có điều kiện lấy mẫu bệnh phẩm là mụn nước, mà phải lấy máu để tìm kháng thể. Phản ứng trung hòa virus thường được thực hiện trên môi trường tế bào tổ chức nhận thận lợn hoặc thận cừu, hoặc tế bào mẫu cảm BHK-21 được nuôi trong các đĩa nhựa lỗ nhỏ. Kháng thể nghi là huyết thanh của gia súc bệnh được xử lý ở nhiệt độ 560C trong 30 phút. Để xác định type gây bệnh trên thực địa, cần có 7 type virus LMLM đã biết được nuôi trong phòng thí nghiệm. Ủ 100TCID50 (50% Tissue Culture Infectiou Dose) của virus trong thể tích tương đương với lượng huyết thanh nghi ở 370C trong 20-60 phút. Sau đó dùng hỗn hợp dịch cấy vào các dãy lỗ nhựa đã nuôi cấy tế bào để đánh giá khả năng trung hòa của huyết thanh. Sau khi đã xác định được type virus gây bệnh, tiếp tục pha loãng huyết thanh nghi và làm phản ứng tương tự để xác định hiệu giá kháng thể có khả năng trung hòa virus. Phản ứng trung hòa virus vừa có tính chất định tính vừa có tính chất định lượng nhưng có nhược điểm là có thể có hiện tượng dương tính giả. 1.2.6.7 Phản ứng ELISA Dùng kháng thể hoặc kháng nguyên đã biết gắn vào đĩa nhựa 96 lỗ sau đó ủ đĩa với kháng nguyên nghi (bệnh phẩm biểu mô) hoặc kháng thể nghi (từ con vật nghi bị bệnh LMLM) Phản ứng ELISA trực tiếp dùng để phát hiện kháng nguyên. Dùng kháng thể đặc hiệu type đã được gắn với enzyme để phát hiện kháng nguyên. Sau khi cho cơ chất vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzyme đã gắn tạo nên màu. Và khi so màu trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng. Phản ứng ELISA gián tiếp dùng để phát hiện kháng thể. Dùng kháng thể thứ 2 đã được gắn với enzyme để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh nghi. Đánh giá con vật mắc virus LMLM type gì dựa vào kháng nguyên đã được gắn vào đĩa cho kết quả phản ứng ELISA dương tính. Hiện nay ELISA là một phản ứng chẩn đoán nhanh bệnh LMLM cũng như trong giám định serotype của virus. Phản ứng này có thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thông thường khác. Đây là một phản ứng có tính đặc hiệu cao và khi dùng với một kháng thể đơn dòng có thể là một kỹ thuật nhạy nhất với mục đích chẩn đoán và định type. 1.2.6.8 Phƣơng pháp RT-PCR Thông thường chẩn đoán LMLM thường là dựa trên các dấu hiệu lâm sàng, sau đó khẳng định lại bằng các phương pháp khác như phân lập virus trong tế bào, ELISA, RT – PCR… Trong đó phương pháp phân lập virus được gọi là chuẩn vàng “gold standard”, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thời gian lâu từ 1 đến 4 ngày để cho kết quả, làm chậm quá trình phát hiện và ngăn chặn dịch bệnh. Phương pháp ELISA nhanh hơn nhưng độ nhạy lại kém hơn và có hạn chế là không thế áp dụng cho tất cả cá loại mẫu bệnh phẩm [7,25,51]. Phương pháp RT-PCR hiện đang đựoc 13 coi là phương pháp nhanh, nhậy và chính xác, có thể áp dụng cho các loại mẫu khác nhau[21,25,51,53]. Nguyên lý của phương pháp này là phát hiện vật liệu di truyền của virus dựa trên phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. 1.2.6.9 Phƣơng pháp phân loại dựa trên cây phát sinh chủng loại (phylogentic trees) Phân loại virus LMLM dựa trên phương pháp cây phát sinh chủng loại (phylogentic method) đang dần thay thế các phương pháp truyền thống dựa trên tiêu chuẩn huyết thanh học (Dmingo, 2002). Các cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên cơ sở trình tự nucleotide được khuếch đại bằng RT-PCR từ RNA của các chủng virus LMLM phân lập. Thông thường người ta sử dụng các gen mã hóa cho capsid protein, đặc biệt là gen VP1[42,57]. Ví dụ, nhờ phương pháp này mà người ta xác định được quan hệ di truyền giữa các chủng virus phân lập type O có nguồn gốc từ Châu Á, di chuyển dang phương tây và phương đông, gây lên đợt dịch LMLM ở Châu Âu 2001/2002. Đợt dịch đã cho thấy sự lây lan nhanh chóng của virus LMLM từ Châu Á sang Châu Âu, và làm tăng thêm mối lo ngại về đại dịch LMLM mang tính toàn cầu [55,57]. 1.3 Cấu trúc hệ gen của virus LMLM 1.3.1 Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM FMDV là một virus nhỏ không có vỏ bảo bọc với giả lớp vỏ capsid T=3 icosahedral tạo thành 60 bản sao chép của 1 trong 4 protein cấu trúc 1A (VP4), 1B (VP2), 1C (VP3) và 1D (VP1) [50]. Lớp vỏ capsid bao quanh 8.4kb, cảm ứng dương, hệ gen RNA sợi đơn liên kết công hóa trị tại đầu 5’ của nó liên kết với lượng nhỏ protein virus 3B (hoặc VPg) và đầu 3’ với polyadenylated. Khi virus xâm nhập vào 1 tế bào, hệ gen của nó nhanh chóng được dịch sang một polyprotein một cách đồng thời và sau khi dịch được phân cắt bởi proteinases virus thành nhiều phần phân cắt, chức năng tương tự, trung gian và cuối cùng thành 12 protein hoàn thiện. Tổ chức hệ gen của FMDV là tương tự với các virus picornaviruse khác, bao gồm một khung đọc mở lớn duy nhất (ORF) giữa hai bên bởi vùng không dịch 5’ và 3’ được cấu trúc cao (5’ UTR và 3’ UTR, tương ứng) (Hình1.4). Vùng 5’ UTR bao gồm, một đầu cuối 5’, một đoạn ngắn “S” (Short fragment) từ 350 nt đến 380 nt (nucleotide), một đường liên kết có độ dài từ 100 nt-420 nt poly ( C ) (90% C), và một đoạn gen kết thúc “L” (Long fragment) độ dài xấp xỉ 700nt, nó bao gồm 3 hoặc 4 cấu trúc pseudoknots song song lặp đi lặp lạ, một vòng gốc cis- họat động nhân rộng thành phần (cre), và một type II internal ribosome entry site (IRES) [43]. Vùng 5’ UTR của FMDV thực hiện các chức năng quan trọng trong việc khởi tạo sự dịch độc lập của polyprotein virus và sao chép hệ gen của virus [39]. Vùng 3’ UTR có độ dài khoảng 90 nt và được cho là chứa thành phần hoạt động cis- cần thiết cho việc nhân rộng hệ gen một cách hiệu quả [6]. 14 Hình1.4 Các đoạn gen S và L thể hiện vị trí và việc dự đoán cấu trúc bậc 2 của UTRs. Đầu 5’ UTR bao gồm đoạn S-fragment, poly C, đoạn pseudoknot, cấu trúc cre và IRES (Internal Ribosome Entry Site) và đầu 3’ UTR với một đoạn poly A. Bốn protein capsid, 1A, 1B, 1C, và 1D ( cũng được biết như là VP4, VP2, VP3, và VP1, tương ứng), là được mã hóa bởi nửa mang mang đầu N của ORF, và ngoại trừ 1A, đã được loại trừ khỏi bề mặt virion, được tham gia vào kháng nguyên và liên kết với một tập con của RGD phụ thuộc vào họ các protein xuyên màng integrins và các thự thể heparan sulfate trên bề mặt tế bào. Các protein không cấu trúc chiếm khoảng 2 phần 3 của protein mã hóa ORF bao gồm L pro, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C pro, và 3D pro[49]. Qúa trình polyprotein FMDV được thực hiện trung gian bởi Lpro, 3C pro , và 2A. Lpro là một enzyme thuỷ phân protein giống như protease, ngoài việc cắt bỏ chính nó từ các polyprotein, việc tách các yếu đố khởi dịch tế bào eIF4G, kết quả trong việc dừng quá trình dịch trên vật chủ [40]. 3Cpro, một thành viên của họ trypsin của enzyme serine protein là enzyme phân hủy các liênkết peptide trong protein, thực hiện tất cả nhưng ba trong số các các tách ra dẫn đến các protein virus hoàn thiện và cũng tách protein tế bào chủ [59]. Trung gian 2A tự động chia tách ở đầu C của nó, rõ ràng bao gồm một cơ chế thay thế ribosomal skip trong quá trình tổng hợp polyprotein. Mặc dù các chức năng của các protein 2B và 2C là không được biết đến, sơ bộ công việc cho thấy rằng, tương tự các picornaviruses khác, chúng cục bộ hóa mạng lưới nội chất (ER)-nguồn gốc của các túi nội chất, các vị trí sao chép hệ gen của virus. 3A được cho là một protein màng tế bào đa chức năng nó tăng cường tổng hợ RNA của virus bởi 3Dpol và kích thích ự phân cắt của tiền thân 3CD. Virus LMLM mã hóa 3 bản không đồng nhất của bộ gene được liên kết bởi 3B, 3B một protein cần thiết để nhân rộng RNA virus. Gene 3D mã hóa RNA virus phụ thuộc vào enzyme RNA polymerase, cùng với gene 3A xuất hiện với màng ER nhân rộng phức hợp liên quan [59,60].