Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) và cây rau má (Centella asiatica) (TT)

  • Số trang: 24 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 33 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27670 tài liệu

Mô tả:

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN I.1. Ý nghĩa của luận án Cuộc sống ngày càng đối mặt với nhiều nguy cơ: thảm họa môi trường, các chứng bệnh nan y như ung thư, HIV/AIDS, bệnh tim mạch hay là những dịch bệnh phức tạp, nguy hiểm mới xuất hiện gần đây: dịch SARS, cúm H5N1, H1N1, v.v....một số loài động, thực vật bị đưa vào sách đỏ và tuyệt chủng. Điều đó thúc đẩy các nhà khoa học phải tìm ra thuốc chữa bệnh có tác dụng chọn lọc, hiệu quả cao và giá thành rẻ để trị bệnh cũng như nghiên cứu tìm cách bảo vệ, bảo tồn các loài động thực vật quý hiếm. Một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng, phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con người, gia súc và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính được sử dụng trực tiếp để làm thuốc hoặc dùng làm "Mô hình" cho các nghiên cứu tổng hợp và bán tổng hợp các loại thuốc mới. Họ Cau là họ thực vật lớn, có rất nhiều cây đã gắn liền với đời sống của nhân dân ta cũng như một số nơi trên thế giới như Trung Quốc, Australia, . . . tuy nhiên hầu như có rất ít công trình nghiên cứu về cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của các cây trong họ Cau của Việt Nam được công bố. Cây rau má, trong dân gian được sử dụng để làm rau ăn, nước giải khát và được sử dụng trong nhiều bài thuốc để trị một số các chứng bệnh thường gặp ở người và gia súc và rất quen thuộc với chúng ta. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]”. 1 I.2. Mục tiêu của luận án Nghiên cứu, phát hiện các chất có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú từ các loài thuộc chi Cọ (Livistona R.Br.), họ Cau (Arecaceae) và cây rau má ở Việt Nam, cụ thể là cây cọ hạ long và cây rau má tại Ba vì Hà Nội. I.3. Những đóng góp mới của luận án - Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của dịch chiết và các hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) được nghiên cứu. - Đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất từ cây cọ hạ long, trong đó có 3 hợp chất mới và 6 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Cọ. - Từ cây rau má thu hái tại Ba Vì - Hà nội đã phân lập được 2 hợp chất là 2 chất triterpen chính với hàm lượng khá cao và 1 hỗn hợp 2 chất stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid. - Công bố về hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng oxy hóa của các dịch chiết và một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) và cây rau má. (Centella asiatica) I.4. Bố cục của luận án Luận án gồm 195 trang với 3 chương, 18 bảng, 39 hình, 3 sơ đồ, 81 tài liệu tham khảo và 3 phụ lục. Luận án được bố cục như sau: Mở đầu: 3 trang; Tổng quan: 29 trang; Thực nghiệm: 25 trang; Kết quả và thảo luận: 55 trang, Kết luận và kiến nghị: 3 trang, Danh mục công trình liên quan đến luận án: 1 trang, Tài liệu tham khảo: 8 trang, phụ lục 71 trang. II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Mở đầu: Đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ của luận án. 2 Chương 1: Tổng quan Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu, chương tổng quan đề cập đến đặc điểm thực vật, ứng dụng trong y học cổ truyền và tình hình nghiên cứu về hóa học, hoạt tính sinh học của một số loài trong chi Cọ (Livistona R.Br.), và chi Rau má (Hydrocotyle; Centella). Chương 2: Thực nghiệm 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu Quy trình chiết: Mẫu thực vật được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 0 40 C, xay nhỏ và ngâm chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần hoặc chiết bằng hỗn hợp dung môi MeOH-H2O ở nhiệt độ phòng sau đó chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, diclometen, metanol. Cất loại dung môi thu được các cao chiết tương ứng. Phân lập các chất: Tinh chế các cao chiết thu được bằng các phương pháp sắc ký: sắc ký cột thường, sắc ký cột nhanh với các chất hấp phụ và các hệ dung môi thích hợp. Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…). Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính chống oxy hóa 2.3. Phân lập các hợp chất từ cây cọ hạ long: (Sơ đồ 2.1, Sơ đồ 2.2 ) 2.4. Phân lập các hợp chất từ cây rau má: (Sơ đồ 2.3) 3 Sơ đồ 2.1. Phân lập các chất từ vỏ cây cọ hạ long (L. halongensis) Vỏ thân cọ khô xay nhỏ (900g) Chiết lần lượt: n-hexan, diclometan, MeOH Cất loại dung môi Cao diclometan 3,1 g (LHV.d) Cao n-hexan 4,9 g (LHV.n) Cao MeOH 24,9 g (LHV.m) Sắc ký silicagen: n-hexan/ EtOAc Pđ 2 62 mg Pđ 1 100 mg Pđ 3 40 mg Pđ4 56 mg Sắc ký silicagen: n-hexan/ EtOAc LHVn6 30 mg 67 Kết tinh: n-hexan/ EtOAc(1:1) LHVn4 28 mg 69 LHVn5a 50 mg 68 Pđ6 1260 mg Pđ5 360 mg CT1 50 mg 71 LHVn7 36 mg 70 LHVH2 650 mg 72 Sơ đồ 2.2. Phân lập các chất từ rễ cây cọ hạ long (L. halongensis) Rễ cọ hạ long khô xay nhỏ (900g) Chiết lần lượt: n-hexan, diclometan, MeOH Cất loại dung môi Cao n-hexan 2,1 g (LHR.n) Cao diclomêtan 2,0 g (LHR.d) Cao MeOH 38 g (LHR.m) Sắc ký silicagen Sắc ký silicagen Pđ 4 150 mg F6 100 mg F4 660 mg Sắc ký silicagen Pđ 16-40 60 mg Sắc ký silicagen Acetyl hóa, SKC Acetyl hóa, SKC LHRn2 10 mg 73 F9 156 mg LHRn3 15 mg 74 LHRm4 32 mg 78 Sắc ký silicagen LHRm1 40 mg 75 LHRm2 30 mg 76 4 LHRm3 25 mg 77 LHRm6 40 mg 79 Sơ đồ 2.3. Phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban.] Rau má khô xay nhỏ (900g) Chiết MeOH 3 lần, t=800C, 2h, thêm H2O Dịch chiết MeOH Cất loại MeOH Chiết với n-hexan Dịch nước Dịch n- hexan Dịch CH2Cl2 Cất loại dung môi Cất loại dung môi Cao CH2Cl2 (25 g) Cao nước (120g) Cao n-hexan(20g) Chiết với CH2Cl2 Thủy phân NaOH 10%, 2h, t=800C Dung dịch muối Trung hòa bằng HCl 5%, lọc kết tủa Cặn tủa 12,5 g Sắc ký silicagen RM1 3,4 g 82 RM2 3,95 g 83 RM3 0,85 g 84 Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cọ hạ long (Livistona halongensis) 3.1.1. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ vỏ thân cây cọ hạ long *). Chất 67 (LHVn6): Cyclomusalenon. 5 Phổ hồng ngoại của chất 67 có đỉnh hấp thụ của nhóm = CH2 (3067 và 885 cm-1), vòng cyclopropyl (3030 cm-1) và nhóm carbonyl (1712 cm-1) bên cạnh các dao động của nhóm –CH2 và –CH3 (2920, 2867, 1457 và 1373 cm-1). Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) (xem hình 4.2) cho pic ion phân tử tại m/z = 425,38078 [M+H]+, theo tính toán cho C30H49O là 425,3783. Như vậy công thức phân tử của chất 67 sẽ là C30H48O. Theo số liệu phổ hồng ngoại và phổ khối thì chất 67 có thể là một triterpen xêtôn có chứa vòng cyclopropan và nhóm (=CH2). Dự đoán này đã được chứng minh qua phổ 1H- và 13C-NMR. Phổ 1HNMR có tín hiệu cộng hưởng của hai proton vòng cyclopropan tại  = 0,324 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-19A) và 0,553 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19B); 4,60 ( 2H, s, =CH2) và tín hiệu của 6 nhóm methyl, trong đó có 3 x d và 3 x s. Các số liệu trên cho phép dự đoán chất 67 là cyclomusalenon. Phổ 13 C-NMR và phổ DEPT của chất 67 cho thấy có tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 carbon bậc 4. Phổ H-H-COSY của chất 67 cho thấy có tương tác giữa H2-26 (4,60 ppm) và H3-27 (1,573 ppm) chứng minh sự có mặt của nhóm isopropenyl (-C(CH3) =CH2) trong phân tử chất 67. Vòng cyclopropan cũng được thấy rõ qua tương tác của H19A (0,324 ppm) và H19B (0,553 ppm). Những tín hiệu khác bị trùng lặp nhiều. Phổ HSQC cho phép chúng ta xác định được độ chuyển dịch hoá học của 13C và 1H của một số nhóm trong phân tử chất 67 cũng như nhóm CH2 đứng bên cạnh nhóm cacbonyl (C3). Ta thấy rõ tương tác của H2-2 (2,33 ppm) và C-2 (41,0 ppm), tương tác giữa C19 (27,0 ppm) và H19A (0,324 ppm) và H19B (0,553 ppm). Phổ HMBC cho thấy tương tác của C-3 (213,4 ppm) với H2-2 (2,33 ppm), điều này chứng minh cho nhóm carbonyl ở vị trí C3 là đúng. Ngoài ra còn thấy rõ tương tác giữa H3-27 (1,573 ppm) với C24 (41,6 ppm); C25 (150,2 ppm); C26 (109,4 ppm).Tổng hợp các dữ liệu trên và sau khi so sánh phổ 13C-NMR của chất 67 với phổ của 4-epicyclomusalenon ghi trong cùng điều kiện và của 6 cyclomusalenon đã kết luận được rằng chất 67 là cyclomusalenon [(24S)-24-methyl-29-norcycloart-25-en-3-on]. *). Chất 68 (LHVn5a): Cycloleucadenon. Phổ hồng ngoại của chất 68 cho các tín hiệu hấp thụ của nhóm cyclopropyl ở 3030cm-1, nhóm =CH2 ở 3072; 890 cm-1 và của nhóm carbonyl ở 1715 cm-- - Phù hợp với phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR của 68 cho các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho vòng cyclopropan tại  = 0,566 (1H, d, J= 3,9 Hz, H-19A), 0,791 (1H, br s, H-19B), 4,66 (2H, m, =CH2) và tín hiệu của 7 nhóm methyl trong đó có hai tín hiệu methyl doublet. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 68 cho thấy có tín hiệu của 31 nguyên tử carbon, trong đó có 7 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 5 nhóm CH và 7 carbon bậc 4. Từ các số liệu phổ thu được cho thấy 68 và 67 là hai chất có cùng một cấu trúc khung, tuy vậy 68 có nhiều hơn một nhóm CH3. Điều này cũng được khẳng định thêm qua phổ ESI-MS phân giải cao với pic ion giả phân tử tại m/z =439,39012 (C31H51O) [M+H]+. Như vậy chất 68 có công thức phân tử là C31H50O (M= 438). So sánh các dữ liệu của phổ 1H- và 13C-NMR của chất 68 với phổ của cycloleucadenone ghi cùng dung môi cho thấy chúng hoàn toàn giống nhau. Vậy kết luận, chất 68 chính là cycloleucadenon. *). Chất 69 (LHVn4): 3β- Cyclomusalenol . 7 Phổ hồng ngoại của chất 69 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl (3341 cm-1), nhóm =CH2 (3076 và 887 cm-1), nhóm cyclopropyl (3030cm-1). Phổ 1H- và 13C-NMR của chất 69 gợi ý chất 69 có cùng khung carbon với chất 67. Sự có mặt của nhóm isopropenyl thể hiện qua các tín hiệu ở: H = 4,66 (2H, s) và C = 109,3 (t) và 150,2 ppm (s). So với phổ của chất 67 thì phổ của chất 69 không chứa nhóm carbonyl ở vị trí C-3 mà chứa nhóm hydroxyl [H: 3,20 (1H, dt, J=10,9, 4,8 Hz, H-3α, C: 77,0 (d), C-3]. Nhóm hydroxyl ở C-3 được xác định là ở vị trí β (3β-OH) dựa vào sự tách vạch của tín hiệu của H-3 là một dt. Trong trường hợp 3α-OH thì tín hiệu của H-3 sẽ là một singlet (s). Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 69 cho thấy có tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 7 nhóm CH và 5 carbon bậc 4. Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z = 427,36355 phù hợp với công thức phân tử là (C30H51O) [M+H]+. Như vậy công thức phân tử của chất 69 sẽ là C30H50O. Từ các số liệu phổ ở trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ 1HNMR của 3β- Cyclomusalenol phân lập được từ cây chuối hột (Musa balbisiana colla), có thể kết luận chất 69 là 3β-cyclomusalenol [(24S),14α, 24-dimethyl-9β,19-cyclo-5α-cholest-25-en- 3β-ol]. *). Chất 70 (LHVn7 = LHRn3): Stigmast-4-en-3-on. Phổ hồng ngoại của chất 70 cho đỉnh hấp thụ của nhóm carbonyl liên hợp (1678 cm-1). Phổ 1H-NMR (Hình 4.10, 4.11, 4.12) cho thấy có hai nhóm metyl với các tín hiệu singlet tại H = 0,71 (3H, s, CH3-18) và H = 1,18 (3H, s, CH3-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 8 Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) và nhóm metyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet tại : H = 0,92 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29). Sự có mặt của nhóm carbonyl liên hợp cũng được thấy rõ trong phổ 13C-NMR (Hình 4.13) với các tín hiệu C =199,598 (s, C-3), 171,653 (s, C-5) và 123,754 (d, C-4) cũng như tín hiệu H = 5,72 (1H, br s, H-4). Phổ 13CNMR và phổ DEPT của chất 70 có tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 8 nhóm CH và 4 nguyên tử carbon bậc 4. Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion phân tử tại m/z = 413,37162 [M+H]+. Như vậy công thức phân tử của chất 70 sẽ là C29H48O (M=412). Phổ 1H- và 13C-NMR của chất 70 hoàn toàn phù hợp với phổ của chất stigmast-4-en-3-on trong tài liệu. Như vậy chất 70 chính là stigmast-4-en-3-on. *). Chất 71 (CT1): Stigmasterol Chất 71: Được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 169-171oC. Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 29 cacbon, trong đó có 3 cacbon bậc bốn, 11 cacbon bậc ba, 9 cacbon bậc hai và 6 nhóm metyl. Phổ 13CNMR cũng cho tín hiệu cộng hưởng của hai liên kết đôi ở vị trí C5 = C6: ( = 140,8 và 121,7) và vị trí C22 = C23: ( = 138,3 và 129,3). Phổ 1H-NMR cho thấy có hai nhóm metyl với các tín hiệu singlet tại H = 0,70 (3H, s, H-18) và H = 1,01 (3H, s, H19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,798 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-26), 0,848 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-21) và một nhóm metyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet tại : H = 0,807 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29). Ở vùng trường thấp cho tín hiệu cộng hưởng của một olefin proton ( = 5,35 (1H, br s, H-6) và hai olefin proton ( = 5,02 (1H, dd, J = 8,7, 15.2 Hz, H-22) và 5,16 (1H, 9 dd, J = 8,6, 15,2Hz, H-23) ; một proton carbinol:  = 3,51 (1H, m, H3) chứng minh cho nhóm β-OH ở vị trí C3. Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z = 414,8 phù hợp với công thức phân tử là (C29H50O) [M+2H]+. Như vậy công thức phân tử của chất 71 sẽ là (C29H48O) với M = 412. Ngoài ra ta còn thấy pic ở m/z = 395,8 [M- H2O +1]. Pic này là pic cơ bản, hình thành do tạo thành dẫn xuất dien liên hợp (3,5-dien) sau khi phân tử 71 bị tách một phân tử nước. Kết hợp các dữ kiện phổ ESIMS, phổ 1HNMR, 13C-NMR và phổ DEPT cho phép xác định cấu trúc của chất 71 là stigmasterol. *). Chất 72 ( LHVH2): β-Sitosterol Chất 72 được xác định là β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1HNMR và 13C-NMR của chúng với số liệu trong tài liệu tham khảo. 3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ rễ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) *).Chất 73 (LHRn2): 6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence12)chroman Chất 73 thu được dưới dạng bột vô định hình, có pic ion phân tử trong phổ khối phân giải cao ESI-HRMS tại m/z = 457,36838 [M + H]+ (theo tính toán cho C30H49O3 là 457,36817). Phổ FT-IR của nó cho thấy các đỉnh hấp thụ ở 2936, 2857 (CH3, CH2), 1760 và 1209 cm-1 (phenyl axetat). Phổ 1H-NMR cho biết phân tử chất 73 có 7 nhóm metyl, trong đó có 3 nhóm thể hiện dưới dạng tín hiệu dublet ở H = 0,84 (J = 5,9 Hz); 0,85 (J = 5,9 Hz); 0,99 (J = 6,8 Hz). Một tín hiệu metyl singlet ở H 10 = 2,13 có thể được gán cho nhóm metyl đính vào vòng thơm; tín hiệu metyl của nhóm axetyl cộng hưởng ở 2,24 ppm và metyl của nhóm isopropenyl xuất hiện ở 1,64 ppm. Ngoài ra, các tín hiệu của hai proton thơm có tương tác meta ở 6,60 và 6,66 ppm (mỗi tín hiệu d, J = 2,6Hz), hai proton olefin (>C=CH2) ở 4,66 ppm cũng như các proton no trong vùng từ 0,80 – 2,80 ppm cũng được quan sát thấy trong phổ 1H-NMR. Chất 73 cho tín hiệu của 30 nguyên tử cacbon trong phổ 13C-NMR và DEPT, bao gồm 7 nhóm metyl, 8 cacbon thơm, 11 nhóm metylen, 2 nhóm metin và 2 cacbon bậc 4. Sự có mặt của phần 2-metylchroman axetat trong phân tử 73 được chứng minh qua 3 nhóm tín hiệu: vòng thơm, aliphatic metylen và metyl. Các tương tác trong phổ HMBC đã khẳng định cấu trúc của phần 2-metylchroman axetat trong phân tử chất 73. Các tương tác đó là tương tác giữa một cacbon trong cầu ete (C = 150,37, C-8a) với hai proton thơm ở H = 6,60; 6,66 (H-5, H-7), hai proton ở H = 2,72 (2H-4), proton của nhóm metyl gắn với vòng thơm H = 2,13 (8-CH3) và tương tác của cacbon thứ 2 trong cầu ete (C = 76,16, C-2) với bốn proton ở H = 2,72 (2H-4); 1,73; 1,79 (2H-3); 1,56 (2H-1'); nhóm metyl ở H = 1,25. Sự nối kết của nhóm axetyl ở C-6 và nhóm metyl ở C-2 được xác định bằng sự dịch chuyển về phía trường thấp của C-6 (142,51 ppm) và các tương tác quan sát được trong phổ HMBC giữa C-6 và H-5, H-7 (H = 6,60; 6,66); giữa C-2 (76,16 ppm) và 2-CH3 (1,25 ppm). Các dữ liệu phổ đã phân tích cho phép kết luận cấu trúc của đơn vị 2-metylchromanol-6-axetat trong chất 73. Cấu trúc của mạch nhánh được chứng minh qua các tương tác giữa C-12' (C = 149,82) và nhóm metyl bậc 3 ở H = 1,64 (s, 3H-13'), nhóm metyl bậc hai ở H = 1,00 (d, 3H-11') trong phổ HMBC. Vị trí nối kết của mạch nhánh được xác định ở C-2 là do tương tác của 2H-1' (H = 1,56) với C2 (C = 76,16). Cấu hình tuyệt đối tại các vị trí C-2, 4’ và 8’ được xác định dựa vào so sánh với tài liệu tham khảo công bố bởi Browstein và Brem. Theo các tài liệu này, các đồng phân quang học khác nhau của α và δ- tocopherol cho độ chuyển dịch khác nhau nhiều nhất ở vị trí CH3- 11 4’. Do đó, có thể xác định được cấu hình tuyệt đối của chất 73 dựa vào việc so sánh độ chuyển dịch hóa học tại vị trí CH3-4’ với một loạt các đồng phân quang học của δ- tocopherol đã được nghiên cứu và thống kê trong tài liệu. Qua đối chiếu với tài liệu tham khảo, độ chuyển dịch hóa học của CH3-4’ (δC 19,65) hoàn toàn phù hợp với cấu hình tuyệt đối R, R, R của chất 3,4-dehydrotocopherol. Do đó cấu trúc của chất 73 được xác định là 6-O-acetyl-2R,8-dimethyl-2-(4R,8R,11-trimethyltridecence12)chroman. *). Chất 75 (LHRm1): 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben: Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz) của chất 75 cho các tín hiệu của một nhóm methoxy ở δH 3,83 (3H, s) cùng với năm proton thơm và hai proton olefin ở vị trí trans tại δH 6,80 (1H, d, J = 16,2 Hz) và 6,85 (1H, d, J = 16,2 Hz). Các tín hiệu proton thơm thuộc hai vòng benzen, trong đó ba proton thuộc một vòng thơm bị thế ở vị trí C3’ và C-5’ tại δH 6,20 (1H, t, J = 2,1, H-4’); 6,46 (2H, d, J = 2,1, H-2’, H-6’) và hai proton còn lại nằm ở vị trí meta đối với nhau trên vòng A δH 6,55 (2H, s, H-2, H-6). Phân tử của chất 75 có tính đối xứng cao. Phổ 13 C NMR của chất 75 cho tín hiệu của 15 cacbon trong đó có 7 x CH, 1 x OCH3 và 5 x Cq. Hai cacbon olefin xuất hiện ở δC 129,49 và 128,94 ppm. Các số liệu phổ cho thấy chất 75 có chứa khung stilben với 5 nhóm thế trong đó có 4 nhóm OH và một nhóm methoxy. Qua so sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo chứng tỏ chất 75 có công thức cấu tạo là 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben. Từ các số liệu ESI-MS, phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, so sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định được cấu trúc của chất 75 như trên. *). Chất 76 (LHRm2): 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan 12 Công thức phân tử của 76 là C16H16O6 được xác định qua pic ion ở m/z 303 [M-H]- (ion âm) và 327 [M+Na]+ (ion dương) trong phổ ESIMS. Để khẳng định cấu trúc của chất 76, chúng tôi đã axetyl hóa chất 76 tạo dẫn xuất tetraaxetyl 80 của nó. Phổ HR-ESI MS của chất 80 có pic ion ở m/z 494,93860 ( tính toán cho C24H24NaO10 là 495,12972). Từ đó khẳng định chắc chắn công thức phân tử của chất 76 là C16H16O6. Phổ 1 H-NMR của 76 có singlet ở H 3,87 (C 56,5) chứng tỏ chất 76 có một nhóm methoxy. Phía trường thấp có các tín hiệu singlet ở H 6,93 (2H, H-2’ , H-6’) và 7,02 (1H, H-4’) đặc trưng cho sự có mặt của nhân phenyl có nhóm thế ở C-1, C-3, C-5 [74]. Tương tác HMBC của C-1’ (C 133,7) với H-2’/ H-6’ và H-2 khẳng định được 2 nhóm thế ở C-3’ và C-5’. Cặp doublet có hằng số tương tác meta (J = 2,2 Hz) ở H 5,97 và 5,95 cho thấy vòng A có 2 nhóm thế ở C-5 và C-7. Tín hiệu của 2 nhóm oxymethin ở H 4,88 (H-2), 4,21 (H-3) và cặp doublet kép ở H 2,89 và 2,77 đặc trưng cho khung 3 hydroxyflavan. Tương tác của proton của nhóm metoxy với C-5’ (C 148,5) cho biết nhóm này gắn với C-5’. Phân tích đầy đủ tương tác trực tiếp trong phổ HSQC và tương tác qua 2 hoặc 3 liên kết trong phổ HMBC cho phép kết luận cấu trúc của chất 76 là 3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan. Hằng số tương tác bé của H-2 và H-3 cho biết 2 proton này ở vị trí cis với nhau, như vậy chất 76 sẽ có cấu hình tương đối là (2R, 3R) hoặc (2S, 3S). Chất 76 có năng suất quay cực [α]D25 = +2,7 ( c = 2,84, MeOH) so sánh với tài liệu tham khảo gợi ý cho biết cấu hình của chất 76 là 2S, 3S. Bằng kết hợp số liệu phổ phân tích ở trên đã xác định được cấu trúc của 76 là: 2S,3S-3,5,7,3’tetrahydroxy- 5’- metoxyflavan. Đây là một chất mới, lần đầu tiên tìm thấy trong thiên nhiên. 13 *). Chất 77 (LHRm3): β-sitosterol-3-O-β–D-glucopyranosid (βsitosterol glucosid) Số liệu phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của chất 77 xuất hiện các tín hiệu singlet tại δH 0,65 (3H, s), 1,23 (3H, s) 0,96 (3H, s) cùng với các metyl dublet tại δH 0,80 (3H, d, J = 6,9), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz), 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz) và 1,00 (3H, d, J = 6,7Hz). Ngoài ra, trên phổ 1 H-NMR còn có thể quan sát thấy tín hiệu của một proton vinylic tại δH 5,32 (1H, br s) và tín hiệu của một nhóm metin mang oxi tại 3,42 (1H, m). Các tín hiệu của các proton còn lại bị trùng lấp lên nhau trong khoảng δH 1,0-2,3 ppm. Chất 77 có gắn với một đường glucose được thấy rõ qua cụm tín hiệu của 4 metin proton tại δH 3,05-3,08 (1H, m); 3,10-3,14 (3H, m) và tín hiệu của nhóm metilen mang oxi tại δH 3,64 (1H, dd, J = 5,5; 10,1, H-6A-Glc) và 3,46 (1H, m, H-6B-Glc). Phổ 1HNMR của chất 77 còn cho tín hiệu của một proton anome tại δH 4,22 (1H, d, J =7,8 Hz) và tín hiệu của các nhóm OH của đường tại δH 4,39 (1H, t, J = 5,7 Hz; 6’-OH) và 4,83 (3H, m; 2’,3’,4’-OH). Trên phổ 13CNMR của hợp chất 77 cho thấy sự xuất hiện của 35 cacbon trong đó có 29 cacbon của aglycon và 6 cacbon của một nhánh đường. Tín hiệu của liên kết olefin tại δC 121,13 và 140,42, tín hiệu của 6 nhóm metyl tại δC 11,62; 11,73; 18,56; 18,90; 19,04 và 19,65, tín hiệu của một nhóm metin mang oxi của aglycon tại δC 70,09 (C-3). Ngoài ra còn có tín hiệu của một cacbon anome tại δC 100,75 (C-1’) cùng với 4 metin mang oxi tại δC 73,43; 76,69; 76,74 và 76,90. Kết hợp các dữ liệu phổ cho thấy chất 77 là một tritecpen khung prostan có gắn thêm một nhánh đường βglucopyranose. Qua so sánh với tài liệu tham khảo ta xác định chất 77 là daucosterol. 14 *). Chất 78 (LHRm4): 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O-D-glucopyranosid Kết hợp dữ liệu phổ 1H, 13C-DEPT NMR và pic ion m/z 489,14618 [M+Na]+ (tính toán cho C22H26NaO11 là 489,13728), xác định được công thức phân tử của 78 là C22H26O11. Dữ kiện phổ MS, 1H-, 13CNMR cho thấy chất 78 có cùng cấu trúc khung và nhóm thế giống chất 76 nhưng có thêm một đường hexose. Tín hiệu của 5 nhóm oxymethin (H 3,4 – 4,9 và C 62-103) cùng với tín hiệu của 1 nhóm oxymethylen (H 3,91; 3,73 và C 62,6) đặc trung cho sự hiện diện của đường glucose. Proton anomeric ở H 4,85(d, J = 7,5 Hz) cho thấy đây là đường β-Dglucopyranose. Tương tác của H-1” (H 4,85) với C-5 (C 158,4) trong phổ HMBC cho biết đường này gắn với C-5. Tín hiệu ở C 158,4 được quy kết cho C-5 mà không phải là C-7 vì nếu là C7 thì phải có tương tác với cả 2 proton liền kề (C-7/H-6, H-8). Cấu hình cis của H-2 và H-3 được xác định qua tín hiệu của 2 proton này là singlet ở H 4,87 và 4,21 (br.s). Chất 78 có năng suất quay cực [α]25 D: – 2.90 (c = 1.22, MeOH) và ngược dấu so với chất 76, cho thấy chất này cấu hình tuyệt đối là 2R, 3R. Từ việc phân tích số liệu phổ 1 chiều, 2 chiều và kết hợp với công thức phân tử đã xác định được cấu trúc của 78 là 2R,3R-3,7,3’trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O--D-glucopyranosid, đây là một chất mới. *). Chất 79 (LHRm6): Sacharose octaacetat 15 - Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của chất 79 cho thấy tín hiệu của hai đường monosacarit đã bị acetyl hóa hoàn toàn với tín hiệu của 8 nhóm acetoxy cho thấy trên phổ 1H-NMR tại δH 1,99 (s, 3H, CH3CO); 2,00 (s, 3H, CH3CO), 2,10 (br s, 15H, 5 x CH3CO), 2,17 (s, 3H, CH3CO) và trên phổ 13C-NMR các nhóm CH3CO tại δC 169,51; 169,66; 169,89; 170,03; 170,11; 170,48 và 170,70. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của cacbon anome tại C-1 (δC 89,87), một cacbon bậc 4 tại δC 103,95 (C-2’), 7 tín hiệu CH thuộc vùng đường cùng với sự có mặt của metilen gắn với oxi (3xCH2OH). Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 7 proton ở vùng đường tại δH 4,12-4,17 (m, 3H), 4,20-4,22 (m, 1H), 4,25-4,31 (m, 3H) cùng với các tín hiệu của các proton ở nhóm CH2OH tại δH 4,34 (1H, dd, J = 4,3; 11,9 Hz); 4,88 (1H, dd, J = 3,7; 10,4 Hz); 5,08 (1H, t, J = 9,8 Hz); 5,37 (1H, t, J = 5,9 Hz); 5,40 (d, 1H, J = 5,9 Hz); 5,45 (1H, t, J = 10,4 Hz). Phân tích số liệu phổ, so sánh với tài liệu tham khảo cho thấy chất 79 có công thức cấu tạo của một đường disacarit với thành phần là α-D-glucopyranosyl (1→2)-β-Dfructopyranosid, còn gọi là saccharose octaacetat. 3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban.) *). Chất 82 (RM1): Axit asiatic Chất 82 (RM1: 3,4 g, 0,37% tính theo trọng lượng mẫu rau má thô), được phân lập từ phân đoạn F2 của cặn chiết MeOH dưới dạng tinh thể màu trắng (CHCl3/MeOH), điểm nóng chảy 324-326°C. Phổ hồng ngoại: cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl (3411 cm-1), 16 nhóm CH2, CH3 (2930 và 2866 cm-1). Phổ 1H-NMR cho thấy có 6 nhóm metyl trong đó có 4 nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,717, 0,871; 0,992; 1,067; 1,158 và hai nhóm metyl gắn với CH với tín hiệu doublet tại H = 0,919 (J = 6,5 Hz) và H = 0,929 (J = 6,5 Hz). Ngoài ra, trên phổ có tín hiệu một nhóm CH2 gắn với OH ở H = 3,297 (d, J = 11,0 Hz; H-23a); H = 3,535 (d; J = 11,0 Hz; H-23b), 2 nhóm hydroxy gắn với CH ở  = 3,387 (J = 9,5 Hz; H-3) và 3,718 (m, H-2) và 1 tín hiệu của nối đôi ở  = 5,260 (br s, H-12). Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 82 có mặt của 30 cacbon trong đó có 6 nhóm metyl; 9 nhóm cacbon bậc 2; 8 nhóm cacbon bậc 3 và 7 nhóm cacbon bậc 4, nhóm cacboxylic với  = 181,6 ppm và tín hiệu nối đôi C12 = C13;  = 139,8, 126,6 ppm. Phổ H-H-COSY cho thấy có sự tương tác giữa hai proton ở H: 3,297 (d, J = 11 Hz); 3,535 (d; J = 11 Hz) gắn trực tiếp với cacbon ở vị trí C-23, proton ở  = 3,387 (J = 9,5 Hz; H-3) tương tác với proton ở  = 3,718 (m, H-2). Phổ HSQC cho thấy rõ giữa H-2 (3,72 ppm) và C-2 (69,7 ppm), giữa C-3 (72,2 ppm) và H-3 (3,38 ppm), tương tác giữa C-12 (126,6 ppm) và H-12 (5,26 ppm). Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z = 487,4 [M-H]-. Kết hợp với phổ 1H- và phổ 13C NMR dự đoán chất 82 có công thức phân tử là C30H48O5. So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-NMR của chất 82 với số liệu của axit asiatic trong tài liệu tham khảo, thấy hoàn toàn trùng khớp. Vậy kết luận chất 82 chính là axit asiatic. *). Chất 83 (RM2): Axit madecassic Phổ hồng ngoại của chất 83 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl (3416 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930 và 2867 cm-1). Phổ 1H- 17 NMR cho thấy có 4 metyl sinlet, hai metyl doublet tại 0,92 và 1,10 ppm. Ngoài ra trên phổ có các tín hiệu của nhóm hydroxymetin (-CHOH) tại H: 3,31 (d, J = 9,5 Hz, H-3); 4,4 (m, H-6); tín hiệu ở H = 5,31 ppm đặc trưng cho nhóm metin olephinic (= CH) và 2 tín hiệu doublet đặc trưng cho nhóm CH2 gắn với OH tại H: 3,46 và 3,61ppm. Sự có mặt của các nhóm này được củng cố bởi các tín hiệu trên phổ 13CNMR ở C: 69,6 ppm (C-2), 78,2 (C-3), 68,4 (C-6), 126,9 và 139,0 ppm (C12 và C13) . Phổ 1H và 13C- NMR của chất 83 gợi ý rằng chất 83 có cùng khung cacbon với chất 83. Phổ khối cho pic ion phân tử tại m/z = 505,35 [M+H]+ , kết hợp với phổ 1H- và 13C - NMR suy ra chất 83 phù hợp với công thức phân tử là C30H48O6. Các số liệu phổ MS, 1H- và 13CNMR của chất 83 hoàn toàn phù hợp với số liệu của axít madecassic trong tài liệu tham khảo. Do đó chất 83 chính là axit madecassic. *). Chất 84: RM3 (Hỗn hợp stigmasterol glucosid + β - sitosterol glucosid): So sánh các dữ kiện phổ ESI-MS, phổ 1H, 13CNMR và DEPT với tài liệu của hỗn hợp stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid cho phép xác định đây chính là hỗn hợp stigmasterol glucosid + β sitosterol glucosid. 18 Bảng 3.8. Công thức các hợp chất phân lập được từ cây cọ hạ long và cây rau má 19 3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học 3.3.1. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ cây cọ hạ long. *) Hoạt tính gây độc tế bào: Dịch chiết diclometan (LHRd) từ rễ có hoạt tính ức chế sự phát triển của 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB, LU, và HepG2. *). Hoạt tính chống oxi hoá: Dịch chiết metanol của rễ, dịch chiết nhexan và dịch chiết metanol của vỏ có hoạt tính kháng oxi hoá. *). Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Dịch chiết diclometan của rễ thể hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định Gram (+) là Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus. Dịch chiết n-hexan của rễ thể hiện khả năng kháng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus. 3.3.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học đối với các hợp chất mới: LHRn2 LHRm2, LHRm4 *) Hoạt tính gây độc tế bào: Chất mới 76 (LHRm2) có hoạt tính gây độc với cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB, LU, MCF7 và HepG2.. Chất mới 78 (LHRm4) không thể hiện hoạt tính. Điều đáng chú ý ở đây là: Chất 76 và 78 chỉ khác nhau ở gốc đường β-D-glucose gắn ở vị trí 5-OH. Ở chất 76 là gốc 5-OH tự do (aglycon), còn ở chất 78 thì gốc 5OH đã bị glucosid hóa. Song sự khác nhau trong hoạt tính gây độc tế bào thì rất rõ rệt. Aglycon thì ức chế cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, còn Glucosid thì hoàn toàn không. Như vậy có thể sơ bộ kết luận là nhóm 5-OH tự do đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính gây độc tế bào của lớp chất này. *). Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Chất mới 78 (LHRm4) thể hiện khả năng kháng một cách chọn lọc chủng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus. Đặc biệt, hiện nay trên thế giới chủng vi khuẩn 20
- Xem thêm -