Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà muscadomestica trong vi khuẩn escherichia coli

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------- LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica trong vi khuẩn Escherichia coli Học viên: Đặng Văn Tiến Lớp: CHST _ K15 Hƣớng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính Hà Nội, 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................viii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... ix MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis. .................................................................. 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis. ................................3 1.1.2. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam. ................................................4 1.1.3. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bt. ........................................................5 1.1.3.2. Đặc điểm hình thái. ..............................................................................................6 1.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa................................................................................................7 1.1.4. Đặc điểm phân loại. ................................................................................................7 1.1.5. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. ........................................................11 1.1.6. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng............................................15 2. ..................................................................................... 17 1.3. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm. ................................................................. 18 1.3.1. Phân loại khoa học của ruồi nhà (Musca domestica). ........................................19 1.3.2. Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica) ..........................................................19 1.3.3. Ảnh hưởng của ruồi đối với sức khỏe cộng đồng. ...............................................21 1.3.4. Một số phương pháp diệt và phòng chống ruồi hiện nay. ...................................22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 24 2.1. Vật liệu. ............................................................................................................. 24 2.1.1. Sinh phẩm. .............................................................................................................24 2.1.2. Hóa chất và thiết bị. ..............................................................................................24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. .................................................................................. 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.1. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch..............................................................................................................................27 2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học. ...................................................................27 2.2.3. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn. ............................................29 2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli.........................................................30 2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A............................................................30 2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose. .................................................................30 2.2.7. Phương pháp tách dòng gen cry2.........................................................................31 2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng. ...............32 2.2.9. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % ........................................32 2.2.10. Phương pháp biểu hiện gen ................................................................................34 2.2.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện .......................34 2.2.12. Xác định khả năng hoà tan của protein .............................................................35 2.2.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin ...............................35 CHƢƠNG 3: ẢO LUẬN ........................................................... 37 Bacillus thuringiensis nghiên cứu. .......................................................................................................................... 37 3.2. Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis .... 38 Musca domestica của các chủng Bt phân lập đƣợc. ............................................................ 40 3.4. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phƣơng pháp PCR. ................................................................................ 42 đọc trình tự gen cry2A. ............................................................... 43 2A. ...........................................................................................43 2A..........................................................................................45 3.6. Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) .............. 48 3.6.1.Thiết kế vector biểu hiện mang gen cry2A ............................................................48 3.6.2. Gắn đoạn gen cry2A vào vector biểu hiện pET22b(+)........................................49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.6.3. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen cry2A ............................................50 3.6.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của cry2A trong plasmid tái tổ hợp ...................................50 3.6.4. Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong E. coli BL21 ...........................................54 3.7. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin................58 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 60 4.1. Kết luận ............................................................................................................. 60 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 61 ....................................................................................... 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ết tắt STT ết đầy đủ 1 Bp Base pair 2 Bt Bacillus thuringiensis 3 CFU Colony Forming Unit 4 dH2O Deion water 5 DNA Deoxyribonucleotide acid 6 dNTP deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate 7 ĐC Đối chứng 8 E. coli Escherichia coli 9 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid 10 EtBr Ethidium Bromide 11 kDa Kilo Dalton 12 OD Optical density - mật độ quang học 13 PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi 14 SDS Sodium dodecyl sulphate 15 Sol Solution 16 TE Tris EDTA 17 X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bt . Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A Bảng 3.1: Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bt. Bảng 3.2: Kết quả phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh. Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) và bào tử (Spore) Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung của một protein tinh thể độc tố Cry. Hình 1.5. Ruồi nhà (Con ruồi đực - Bên trái; Con ruồi cái - bên phải) Hình 1.6. Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica) Hình 1.7. Trứng của ruồi nhà (Musca domestica) Hình 3.1. Hình dạng bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt Hình 3.2. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học Hình 3.3. Ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của các chủng Bt phân lập Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Hình 3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp pCR2.1- cry2A vào vi khuẩn E.coli DH5α Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide từ các dòng khuẩn lạc pCR2.1 cry2A - LNT7.12 và pCR2.1 - cry2A - MSS8.4 trên agarose 1%. Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen cry2A Hình 3.8. So sánh trình tự gen của 2 chủng MSS8.4 và LNT7.12 với AJ488143.1 Hình 3.9. sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen cry2A Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt mở vòng vector pET22b(+) Hình 3.11. Điện di sản phẩm cắt đoạn gen cry2A từ vector tái tổ hợp pCR2.1 – cry2A Hình 3.12. Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên môi trƣờng LBA Hình 3.13. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 % agarose Hình 3.16. Trình tự acid amin của protein Cry2A trên lý thuyết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.17. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng BL21 trên môi Hình 3.18. Điện di sự biểu hiện protein rCry2A trên gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.19. Điện di protein tái tổ hợp Cry2A theo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.20. Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp Cry2A theo nồng độ IPTG Hình 3.21. Điện di mẫu protein Cry2A theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Ruồi nhà (Musca domestica) sống rất gần gũi với loài ngƣời trên toàn thế giới. Khoảng 90 % ruồi hiện diện xung quanh con ngƣời. Chúng thƣờng đƣợc tì vật sinh sống, nơi có nhiều thực phẩm và chất thải. Sự có mặt của chúng là dấu hiệu của điều kiện mất vệ sinh vì chúng mang theo nhiều chất bẩn và mầm bệnh. Ruồi không chỉ gây khó chịu cho con ngƣời làm việc và nghỉ ngơi mà còn là vật trung gian lây truyền rất nhiều bệnh cho ngƣời, động vật và cây trồng. Do tập tính ruồi vận chuyển mầm bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, trứng giun sán từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành và từ môi trƣờng vào cơ thể con ngƣời. Ruồi truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae, lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus). Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt ruồi nhà khác nhau mà con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt ruồi nhà đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi. Tuy nhiên, những loại thuốc diệt ruồi hiện nay thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh. Để khắc phục những tồn tại của thuốc diệt ruồi hóa học và các phƣơng pháp diệt ruồi truyền thống, chúng ta cần tạo ra những chế phẩm sinh học vừa có tác dụng tiêu diệt hiệu quả mầm bệnh, lại vừa thân thiện với con ngƣời, với môi trƣờng. Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất, gram dƣơng đƣợc phát hiện và biết đến từ năm 1901. Chúng có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Chế phẩm Bt đƣợc sử dụng lần đầu tiên vào năm 1930 để kiểm soát loài sâu đục thân Sau Angasta kuehnella ở Châu Âu. Bt 1 ... Bt . đạt đƣợc nhiều thành tựu trong nghiên , cứu, sản xuất Bt và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống. Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ruồi nhà của các chủng Bt phân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ruồi. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica trong vi khuẩn Escherichia coli”. Mục tiêu của đề tài: 1. Sàng lọc đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt ruồi nhà (Musca domestica). 2. Tách dòng và đọc trình tự đƣợc Gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt ruồi nhà. 3. Biểu hiện đƣợc protein Cry2 diệt ấu trùng ruồi. Để đạt đƣợc các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nhiệm sau: 1. Phân loại các chủng Bt bằng phƣơng pháp huyết thanh miễn dịch. 2. Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà. 3. Khuếch đại gen mã hóa protein độc tố diệt ấu trùng ruồi nhà sử dụng cặp mồi đặc hiệu. 4. Tách dòng gen cry2A mã hóa tinh thể protein diệt ruồi nhà. 5. Đọc trình tự gen cry2A và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen Quốc tế. 6. Biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E.coli BL21 (DE3). 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis. 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis. Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đƣợc coi là vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng. Lịch sử nghiên cứu ứng dụng của Bacillus thuringiensis đƣợc bắt nguồn ngay từ những năm đầu tiên của thế kỉ 20. Từ năm 1870 khi Loius Pasteur phát hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces. Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto. Đến mƣời năm sau (1911), loài vi khuẩn này đƣợc nhà khoa học ngƣời Đức là E. Berliner phân lập đƣợc từ xác ấu trùng bƣớm Địa Trung Hải, Anagasta kuhniella và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất, tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử này. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis do phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức. Năm 1927, Mattes và cộng sự đã phân lập lại Bt từ Anagasta kuhniella. Chế phẩm Bt đƣợc sử dụng lần đầu tiên là vào năm 1930 để kiểm soát loài côn trùng hại có tên là Angasta kuhniella, một loài sâu đục thân ở Châu Âu. Chế phẩm thƣơng mại đầu tiên, đƣợc sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh đƣợc hoạt tính diệt sâu là do tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử. Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của Bt đã đƣợc sản xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau đó, Howard Dulmage và 3 Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập đƣợc bộ sƣu tầm đầu tiên về các chủng Bt. Năm 1962, De Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phƣơng pháp huyết thanh. Năm 1970, Dulmage đã phân lập đƣợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đƣợc sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt. Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra Bacillus thuringiensis subsp. isralensis diệt đƣợc cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc trình tự. Từ đó một lƣợng lớn gen đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính của chúng. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu Tenebrio molitar. Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tƣơng tự Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt subsp. sandiego và đã tổng hợp đƣợc chuỗi gen độc tố của chúng. Năm 1985, gen cry của Bt đƣợc chuyển vào cây trồng để diệt sâu. Năm 1987, công ty Mycogen đã sản xuất chế phẩm dạng con nhộng Cellcap. Trong những năm 1987 - 1992, ngƣời ta tiếp tục nghiên cứu và phát hiện thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa vào sản xuất, từ đó một chƣơng trình mới về ứng dụng Bt vào cây trồng - thực vật chuyển gen (Genetically Modified Organisms - GMOs) [5] 1.1.2. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam. Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bt và phải kể đến một chặng đƣờng dài mà các nhà khoa học của Việt Nam nghiên cứu về thuốc trừ sâu sinh học 4 Bt. Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bt các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp [4]. Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt đƣợc ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ thực vật năm 1971. Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bt phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp lên men trên máy lắc và có chế phẩm diệt sâu rất tốt [1]. Năm 1973 - 1976, Bt đƣợc sản xuất chủ yếu trên môi trƣờng đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác nhƣ: bã khô lạc, bột đậu tƣơng, bột cá... Các chủng sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc. Các chế phẩm này đã đƣợc sử dụng cho vùng trồng rau ở ngoại thành Hà Nội và đã thu đƣợc các kết quả tốt đẹp [2]. Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phƣơng pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5 m3. Từ năm 1984 - 1994, việc sản xuất chế phẩm Bt đã giảm sút bởi vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lƣợng không cao do vậy tốc độ tiêu thụ giảm. Trong những năm gần đây, việc ứng dụng Bt đƣợc mở rộng hơn. Nhiều tƣ liệu nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đã đƣợc công bố. Các công trình tập trung chủ yếu vào các nội dung chính nhƣ sự phân bố và đa dạng sinh học của các chủng Bt phân lập tại Việt Nam và nghiên cứu về các gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng cũng ứng dụng các protein này trong sản xuất chế phẩm sinh học [17, 18, 19, 20]. 1.1.3. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bt. 1.1.3.1. Vị trí phân loại. Bacillus thuringiensis đƣợc xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes. Nhóm này gồm hơn 20 loài khác nhau, ngoài Bt còn có vi khuẩn 5 B. subtilis, B. cereus (vi khuẩn gây ), vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn gây bệnh than). Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thƣờng đƣợc coi là vi khuẩn đất. Chúng sống trong môi trƣờng đất, côn trùng và bề mặt tiếp xúc với côn trùng [35]. 1.1.3.2. Đặc điểm hình thái. Bacillus thuringiensis hình que (Hình 1.1), có khả năng di động nhờ có tiên mao mọc trên bề mặt tế bào, bắt màu Gram dƣơng. Vi khuẩn Bt hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Mỗi tế bào Bt có khả năng sinh bào tử và tin khả năng diệt côn trùng. Kích thƣớc tế bào khoảng 0,8 1,4µm x 2,5 - 10µm [8]. Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích thƣớc 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm, quá trình hình thành bào tử không làm thay đổi hình dạng tế bào. Một đặc điểm quan trọng là trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể. Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng, kích thƣớc và số lƣợng khác nhau, tuy nhiên chúng mang đặc điểm chung là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng. Khi ở trong tế bào sinh dƣỡng, tinh thể thƣờng nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể và bào tử đều thoát ra ngoài. Trong môi trƣờng lỏng Bt có khả năng chuyển động, khả năng này có đƣợc là nhờ các lông roi (flagellar) trên bề mặt tế bào có kích thƣớc lớn hơn 0,9 µm [54]. Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) và bào tử (Spore) B. thuringiensis đƣợc xem nhƣ là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trƣờng khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ biến của Bt trong môi trƣờng tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [16]. 1.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa. Bt không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng arrabinoza, xylose, manitol, nhƣng tạo axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose. Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không có khả năng khử amin của phenilalamin, không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat. Bt có khả năng sinh trƣởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45oC. Nhiệt độ tối ƣu là 28 - 30oC. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ƣu cho sự phát triển của Bt là pH = 7. Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas [5]. 1.1.4. Đặc điểm phân loại. Có rất nhiều phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis khác nhau [5]: - Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus, 1958). Tuy nhiên phân loại theo phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc các chủng Bt một cách rõ ràng bởi vì Bt có các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 7 rất giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. anthacis. Mới đây mới phát hiện thêm loài B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [5, 8, 14]. - Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên H. - Phân loại theo ngoại hình enzyme lipase. - Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau. - Phân loại theo nguồn bệnh. - Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể. Tuy nhiên, các phƣơng pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế. Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp…Phƣơng pháp phân loại theo typ huyết thanh H đƣợc sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. : Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngƣng kết. Kết quả của phản ứng là tạo ra cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Dƣới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động đƣợc. Cho đến năm 2003, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bt [6, 15] (Bảng 1.1). Đây là phƣơng pháp phân loại đƣợc sử dụng phổ biến và là phƣơng pháp đáng tin cậy đƣợc trung tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [6, 47]. 8 1.1: Kháng nguyên H Thứ huyết thanh Bt . Ngƣời đầu tiên nghiên cứu Code 1 thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958 2 finitimus FIN Heimpel & Angus 1958 3a, 3c alesti ALE Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus 1958 3a, 3b, 3c kurstaki KUR de Barjac & Lemille 1970 3a, 3d sumiyoshiensis SUM Ohba & Aizawa 1989 3a, 3d, 3e fukuokaensis FUK Ohba & Aizawa 1989 4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905 ; Heimpel & Angus 1958 4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi & de Barjac 1963 5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959; de Barjac & Bonnefoi 1962 5a, 5c canadensis CAN de Barjac & Bonnefoi 1972 6 entomocidus ENT Heimpel & Angus 1958 7 aizawai AIZ Bonnefoi & de Barjac 1963 8a, 8b morrisoni MOR Bonnefoi & de Barjac 1963 8a, 8c ostriniae OST Ren et al. 1975 8b, 8d nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon 1984 9 tolworthi TOL Norris 1964 ; de Barjac & Bonnefoi 1968 10a, 10b darmstadiensis DAR Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968 10a, 10c londrina LON Arantes et al. (Không công bố) 11a, 11b toumanoffi TOU Krieg 1969 11a, 11c kyushuensis KYU Ohba & Aizawa 1979 12 thompsoni THO de Barjac & Thompson 1970 13 pakistani PAK de Barjac, Cosmao Dumanoir, Shaik & Viviani 1977 14 israelensis ISR de Barjac 1978 15 dakota DAK De Lucca, Simonson & Larson 1979 16 indiana IND De Lucca, Simonson & Larson 1979 17 tohokuensis TOH Ohba, Aizawa & Shimizu 1981 18a, 18b kumamotoensis KUM Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981 18a, 18c yosoo YOS Lee, H. H et al. 1995 19 tochigiensis TOC Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981 20a, 20b yunnanensis YUN Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei 1979 20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al. (Không công bố) 21 colmeri De Lucca, Palmgren & de Barjac 1984 COL 9 Kháng nguyên H Thứ huyết thanh Ngƣời đầu tiên nghiên cứu Code 22 shandongiensis SHA Wang Ying et al. 1986 23 japonensis JAP Ohba & Aizawa 1986 24a, 24b neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al. 1988 24a, 24c novosibirsk NOV Burtseva, Kalmikova et al. 1995 25 coreanensis COR Lee H. H et al. 1994 26 silo SIL de Barjac and Lecadet (Không công bố) 27 mexicanensis MEX Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không công bố) 28a, 28b monterrey MON Rodriguez-Padilla et al. (Không công bố) 28a, 28c jegathesan JEG 29 amagiensis AMA Ohba (Không công bố) 30 medellin MED Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac 1992 31 togucshini TOG Hodirev (Không công bố) 32 cameroun CAM Jacquemard 1990; Juarez-Perez et al. 1994 33 leesis LEE Lee H. H et al. 1994 34 konkukian KON Lee H. H et al. 1994 35 seoulensis SEO Lee H. H et al. 1995 36 malaysiensis MAL Ho (Không công bố) 37 andaluciensis AND Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996 38 oswaldocruzi OSW Rabinovitch et al. 1995 39 brasiliensis BRA Rabinovitch et al. 1995 40 huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al. 1996 41 sooncheon SOO Lee H. H et al. 1995 42 jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al. (in press) 43 guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al. (in press) 44 higo HIG Ohba et al. 1995 45 roskildiensis ROS Hinrinschen, Hansen and Daamgaard (Không công bố) 46 chanpaisis CHA Chanpaisaeng (Không công bố) 47 wratislaviensis WRA Lonc et al. 1997 48 balearica BAL Caballero et al. (Không công bố) 49 muju MUJ Seung Hwan Park et al. (Không công bố ) 50 navarrensis NAV Caballero et al. (Không công bố) 51 xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (Không công bố) 52 kim KIM Kim et al. (Không công bố) Seleena, Lee, H. L. & Lecadet 1995 10