Tài liệu Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng kaviran

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC Mã số: 62 72 04 02 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THANH HẢI PGS.TS. NGUYỄN TÙNG LINH HÀ NỘI – NĂM 2017 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS. TS. Nguyễn Thanh Hải PGS. TS. Nguyễn Tùng Linh Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y, Phòng sau đại học và các cơ quan chức năng trong Học viện đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Minh Chính và các cán bộ, giảng viên, kỹ thuật viên Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của GS.TS. Hoàng Văn Lương, PGS.TS. Nguyễn Văn Long, PGS.TS. Vũ Bình Dương cùng các cán bộ, kỹ thuật viên Trung tâm nghiên cứu Y Dược học quân sự, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc thực nghiệm - Học viện Quân y. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Dược lý, Bộ môn Y học quân binh chủng, Bộ môn Giải phẫu bệnh lý, Khoa Y học hạt nhân - Học viện Quân y, Bộ môn Dược lý - Trường Đại học y Hà Nội, TT kiểm nghiệm Dược Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2017 Nghiên cứu sinh Nguyễn Trọng Điệp ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả số liệu trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. TÁC GIẢ NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu trong luận án Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. DƯỢC LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU............................................... 3 1.1.1. Cây nhàu................................................................................................ 3 1.1.2. Cúc hoa vàng ......................................................................................... 8 1.1.3. Sâm Ngọc linh sinh khối ..................................................................... 13 1.2. KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ PHUN SẤY ........................ 15 1.2.1. Kỹ thuật chiết xuất dược liệu .............................................................. 15 1.2.2. Kỹ thuật phun sấy và ứng dụng trong làm khô dịch chiết dược liệu ......................................................................................................................... 29 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 36 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................. 36 2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................... 36 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 36 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 38 2.2.1. Nghiên cứu bào chế bột cao khô tiêu chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối .......................................................................... 38 2.2.2. Nghiên cứu bào chế, tiêu chuẩn hóa và đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran ........................................................................................ 48 2.2.3. Nghiên cứu tính độc tính và tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran trên động vật thực nghiệm .............................................................. 52 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................... 55 iv Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 56 3.1. KẾT QUẢ BÀO CHẾ BỘT CAO KHÔ TIÊU CHUẨN ............................. 56 3.1.1. Kết quả định tính, định lượng các hoạt chất trong dược liệu.............. 56 3.1.2. Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô cúc hoa vàng............ 58 3.1.3. Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô quả nhàu .................. 72 3.1.4. Kết quả chiết xuất, bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô sâm Ngọc linh sinh khối ............................................................................................... 89 3.2. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÔNG THỨC, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN .................. 97 3.2.1. Xây dựng công thức viên nang Kaviran ............................................. 97 3.2.2. Kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng Kaviran ................................................................................................................ 101 3.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran ............... 101 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN ............ 101 3.3.1. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn ........................................ 101 3.3.2. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran .................................................................... 105 Chương 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 112 4.1. CHIẾT XUẤT, BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘT CAO KHÔ CÚC HOA VÀNG, QUẢ NHÀU VÀ SÂM NGỌC LINH SINH KHỐI .......... 112 4.1.1. Lựa chọn nguyên liệu và kiểm định các dược liệu đầu vào.............. 112 4.1.2. Điều chế cao cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối ...................................................................................................................... 113 4.1.3. Bào chế bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối bằng phương pháp phun sấy ................................................................ 121 4.1.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối ................................................................................. 131 4.2. XÂY DỰNG CÔNG THỨC, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN ........................................... 133 4.2.1. Xây dựng công thức bào chế............................................................. 133 4.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng Kaviran ........................ 135 v 4.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN. 138 4.3.1. Đánh giá tính an toàn của viên nang cứng Kaviran .......................... 138 4.3.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa trên động vật thực nghiệm của viên nang Kaviran ............................................................................ 138 4.3.3. Đánh giá tác dụng của viên nang Kaviran trên chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ ................................................................. 141 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 146 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 1 AE Aerosil 2 ALT Alanin Transaminase 3 AST Aspartat Transaminase 4 BC Bạch cầu 5 BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh) 6 CHV Cúc hoa vàng 7 CHV-PS Cao cúc hoa vàng phun sấy 8 CI Carr’s compressibility index (Chỉ số nén) 9 CR Chất rắn 10 CR/DP Chất rắn/ dịch phun (Tỷ lệ chất rắn trong dịch phun sấy) 11 cs Cộng sự 12 CT Công thức 13 d Khối lượng riêng (g/ml) 14 DĐVN Dược điển Việt Nam 15 DL Dược liệu 16 DM Dung môi 17 DM/DL Dung môi/ dược liệu 18 DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical 19 EtOH Ethanol 20 Fla Flavonoid 21 Gy Grey – đơn vị chiếu xạ 22 HH Hỗn hợp 23 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 24 HS Hiệu suất 25 KLTB Khối lượng trung bình 26 KLCT Khối lượng cơ thể 27 KLLTĐ Khối lượng lách tương đối vii TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 28 KLƯTĐ Khối lượng ức tương đối 29 MAE Microwave - assisted Extraction (Chiết xuất vi sóng) 30 MD Maltodextrin 31 MDA Malondialdehyd 32 n Số lượng mẫu thử 33 NC Nghiên cứu 34 NLSK Ngọc linh sinh khối 35 Noni-ppt Phần kết tủa trong ethanol giàu hợp chất polysaccharid của dịch chiết quả nhàu 36 PL Phụ lục 37 QN Quả nhàu 38 SEM Scanning Electron Microscope (Quét hiển vi điện tử) 39 SGMD Suy giảm miễn dịch 40 TD Tá dược 41 TD/CR Tá dược/ chất rắn (Tỷ lệ tá dược so với chất rắn trong cao dược liệu) 42 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 43 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 44 TNJ Tahitian noni juice (Nước ép quả nhàu) 45 V Thể tích 46 Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số ứng dụng của MAE trong chiết xuất dược liệu 23 2.1 Thành phần công thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 49 3.1. Hàm lượng luteolin và apigenin trong CHV 56 3.2. Hàm lượng scopoletin trong quả nhàu 57 3.3. Hàm lượng ginsenosid Rg1 và Rb1 trong sâm NLSK 57 3.4. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong CHV 58 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đến chiết xuất flavonoid từ CHV 59 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất flavonoid từ CHV 59 3.7. Ảnh hưởng của số lần chiết và tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất flavonoid từ CHV 60 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.9. Thông số qui trình điều chế dịch chiết CHV 62 3.10. Chiết xuất flavonoid từ CHV ở qui mô 3kg/mẻ 62 3.11. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao CHV 2:1 63 3.12. Thành phần cao CHV dùng để nghiên cứu phun sấy 64 3.13. Công thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao CHV 64 3.14. Ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao CHV 64 3.15. Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun sấy cao CHV 66 3.16. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/ chất rắn đến phun sấy cao CHV 67 3.17. Công thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch phun đến phun sấy cao CHV 69 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ, tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao CHV 69 3.19. Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao CHV 70 3.20. Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao CHV 71 3.21. Thông số qui trình bào chế bột cao khô CHV bằng phun sấy 72 3.22. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong quả nhàu 72 ix Bảng Tên bảng Trang 3.23. Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL và số lần chiết đến chiết flavonoid từ quả nhàu 74 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất noni-ppt từ quả nhàu 76 3.25. Kết quả chiết xuất, cô cao, loại tạp của cao quả nhàu toàn phần 77 3.26. Tỷ lệ chất rắn và hàm lượng hoạt chất trong quả nhàu và cao quả nhàu 1:1 78 3.27. Thiết kế công thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao quả nhàu 79 3.28. Ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao quả nhàu 79 3.29. Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao quả nhàu 81 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao quả nhàu 82 3.31. Công thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao quả nhàu 84 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao quả nhàu 84 3.33. Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất CR/DP đến phun sấy cao quả nhàu 86 3.34. Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao quả nhàu 86 3.35. Thông số qui trình bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phun sấy 88 3.36. Thành phần nguyên liệu và cao sâm NLSK 89 3.37. Công thức khảo sát ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao sâm NLSK 90 3.38. Ảnh hưởng của tá dược đến kết quả phun sấy cao sâm NLSK 90 3.39. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 91 3.40. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 92 3.41. Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao sâm NLSK 93 3.42. Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao sâm NLSK 93 3.43. Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao sâm NLSK 95 3.44. Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao sâm NLSK 95 3.45. Thông số qui trình bào chế bột cao khô sâm NLSK bằng phun sấy 96 x Bảng Tên bảng Trang 3.46. Giá trị IC50 của hỗn hợp cao và các cao thành phần 97 3.47. Thành phần công thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 99 3.48. Thành phần công thức cho một viên nang cứng Kaviran 100 3.49. Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 giờ uống Kaviran 102 3.50. Ảnh hưởng của Kaviran đối với khối lượng cơ thể thỏ 102 3.51. Ảnh hưởng của Kaviran đối với điện tim thỏ 103 3.52. Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu và tiểu cầu ở các lô thỏ nghiên cứu 103 3.53. Nồng độ AST, ALT, Creatinin và Ure của các lô thỏ 104 3.54. Tóm tắt nhận xét mô bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm 105 3.55. Ảnh hưởng của Kaviran lên khối lượng gan tương đối 106 3.56. Ảnh hưởng của Kaviran lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh của các nhóm chuột nghiên cứu 106 3.57. Tóm tắt nhận xét về đại thể và vi thể gan của các nhóm chuột đánh giá tác dụng bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran 107 3.58. Ảnh hưởng của Kaviran lên KLƯTĐ và KLLTĐ chuột nhắt trắng 108 3.59. Ảnh hưởng của Kaviran lên số lượng bạch cầu chuột nhắt trắng 108 3.60. Nhận xét về vi thể tuyến lách của các lô chuột nghiên cứu 109 3.61. Nhận xét về vi thể tuyến ức của các lô chuột nghiên cứu 110 3.62. Nhận xét về vi thể hạch của các lô chuột nghiên cứu 110 3.63. Nhận xét về vi thể tủy xương của các lô chuột nghiên cứu 111 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây nhàu và quả nhàu 3 1.2 Cúc hoa vàng 9 1.3 Thiết kế bình chiết sử dụng que siêu âm 18 1.4 Đồ thị biểu diễn trạng thái của các chất 24 1.5 Sơ đồ cấu tạo thiết bị và quy trình phun sấy 29 1.6. Một số kiểu thiết kế của đĩa phun ly tâm 31 3.1 Sự phụ thuộc của mật độ quang theo nồng độ của quercetin 58 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.3 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy với các tá dược khác nhau 65 3.4 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy với tỷ lệ TD/CR khác nhau 67 3.5 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy ở các nhiệt độ khác nhau 69 3.6 Ảnh hưởng của dung môi đến chiết flavonoid từ quả nhàu 73 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết flavonoid từ quả nhàu 75 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến chiết flavonoid từ quả nhàu 75 3.9 Hàm lượng và hiệu suất thu hồi scopoletin trong bột cao khô quả nhàu phun sấy với các tá dược khác nhau 79 3.10 Ảnh SEM của bột cao khô quả nhàu ở các tỷ lệ TD/CR khác nhau 80 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi scopoletin của bột cao khô quả nhàu 82 3.12 Ảnh SEM của bột cao khô quả nhàu ở các tỷ lệ TD/CR khác nhau 82 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi scopoletin của bột cao khô quả nhàu 84 3.14 Ảnh SEM bột cao khô quả nhàu phun sấy ở nhiệt độ khác nhau 85 3.15 Hàm lượng và hiệu suất thu hồi scopoletin của bột cao khô quả nhàu phun sấy ở tỷ lệ CR/DP khác nhau 86 3.16 Ảnh SEM của bột cao khô quả nhàu ở tỷ lệ CR/DP khác nhau 87 3.17 Ảnh hưởng của tá dược đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK 90 3.18 Ảnh SEM của bột cao khô sâm NLSK với tá dược MD/AE (50:50) 91 xii Hình Tên hình Trang 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK 92 3.20 Ảnh SEM của bột cao khô sâm NLSK khi phun sấy ở 120ºC (a) và 140ºC (b) 92 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK 93 3.22 Ảnh SEM của bột cao khô sâm NLSK phun sấy ở tỷ lệ TD/CR khác nhau 94 3.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/ dịch phun sấy đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK 95 3.24 Ảnh SEM của bột cao khô sâm NLSK phun sấy ở tỷ lệ CR/DP 15% 95 3.25 Khối lượng tuyến lách và tuyến ức tương đối của các nhóm chuột 98 3.26 Ảnh hưởng của tá dược đến thông số của hỗn hợp bột đóng nang và viên nang khảo sát 99 3.27 Hàm lượng MDA trong gan của các lô chuột nghiên cứu 107 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng rộng rãi và phát triển nhanh chóng trong hệ thống y tế. Ngay ở các nước phát triển, thuốc nguồn gốc dược liệu đã được sử dụng rất phổ biến như là một liệu pháp bổ trợ hoặc thay thế (Canada 70%, Úc 48%, Mỹ 42%, Pháp 75%) [148]. Thuốc cổ truyền đã được đưa vào chương trình đào tạo ở các trường đại học từ bậc cử nhân đến tiến sỹ (39 nước, 30% các nước khảo sát) [150]. Ở Việt Nam, thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng từ lâu đời, nhưng vấn đề tiêu chuẩn hóa từ nguyên liệu ban đầu, bán thành phẩm đến thành phẩm nhằm nâng cao chất lượng và độ ổn định còn chưa được thực hiện triệt để. Phát triển các dạng thuốc hiện đại từ dược liệu cũng còn nhiều vấn đề cần giải quyết. Việc áp dụng các tiến bộ khoa học (công nghệ chiết xuất, bào chế bột cao khô và bào chế thành phẩm) để hiện đại hóa các dạng thuốc này là rất cần thiết, nhằm đảm chất lượng, tác dụng điều trị cũng như các lợi ích trong ứng dụng trên lâm sàng. Suy giảm miễn dịch mắc phải là hậu quả của nhiều quá trình bệnh lý như: Suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau khi dùng các thuốc ức chế hoặc độc với các tế bào của hệ thống miễn dịch, do tia xạ hoặc hoá chất điều trị ung thư, đặc biệt là trong nhiễm HIV/AIDS [13], [17]. Trong các trường hợp bệnh lý trên, ngoài điều trị đặc hiệu để loại trừ tác nhân gây bệnh thì điều trị nhằm nâng đỡ cơ thể, tăng cường miễn dịch là cần thiết. Tuy nhiên, do chi phí điều trị cao, đặc biệt là khi sử dụng thuốc kháng retrovirus trong điều trị HIV/AIDS, nhiều bệnh nhân không có cơ hội tiếp cận, thì việc tìm kiếm các thuốc điều trị bổ sung hoặc thay thế, với giá thành dễ chấp nhận là vấn đề cấp bách và có ý nghĩa thực tiễn cao. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, một số hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng ức chế sự nhân lên của HIV [105], [133], kích thích miễn dịch [82], [90] và chống oxy hóa [133], [158], do vậy rất có thể có hiệu quả trong điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, vì những người này bị tổn thương hệ miễn dịch nghiêm trọng. Mặt khác, tình trạng cân bằng oxy hóa khử gây ảnh hưởng đến các hoạt động của hệ miễn dịch và stress oxy hóa có liên quan đến sự nhân lên 2 của HIV [11]. Các nghiên cứu này đã gợi ý việc sử dụng các chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng tăng cường miễn dịch hết hợp với chống oxy hóa như một biện pháp trị liệu thay thế hoặc bổ sung trong điều trị các trường hợp suy giảm miễn dịch mắc phải nói chung và HIV/AIDS nói riêng. Quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) là các dược liệu sẵn có ở Việt Nam với trữ lượng lớn, đã được sử dụng từ lâu để làm thuốc. Các nghiên cứu gần đây cho thấy quả nhàu và CHV có nhiều tác dụng sinh học quí như: tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm...Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) được tạo ra bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật, có chất lượng ổn định. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy sâm NLSK có một số tác dụng sinh học tương tự với sâm tự nhiên như: tăng lực, tăng quá trình nhận thức và ghi nhớ, chống oxy hóa, bảo vệ gan...Tuy nhiên, các nghiên cứu về chiết xuất, bào chế chế phẩm từ ba dược liệu này còn đơn giản và chưa có chế phẩm thuốc nào bào chế phối hợp từ ba dược liệu này. Do vậy, để góp phần nghiên cứu phát triển một chế phẩm thuốc mới từ quả nhàu, CHV và sâm NLSK (Viên Kaviran) nhằm tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa theo hướng hiện đại, an toàn, hiệu quả, thuận tiện khi sử dụng và ứng dụng được vào sản xuất, đề tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau: 1. Bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. 2. Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. 3. Đánh giá được độc tính, tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran trên thực nghiệm. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. DƯỢC LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.1.1. Cây nhàu 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Nhàu có tên khoa học là Morinda citrifolia L, họ Cà phê (Rubiaceae), nguồn gốc từ Đông Nam Á đến Úc, được trồng ở Ấn độ, vùng Ca-ri-bê, Nam mỹ [38]. Ở Việt Nam, cây mọc chủ yếu ở miền Nam từ Quảng Bình trở vào [20]. Cây Nhàu là cây nhỡ hay to, cao 6 - 8m, có nhiều cành to, lá mọc đối xứng hình bầu dục, đỉnh lá nhọn hoặc tù, dài 12 - 30cm, rộng 6 - 15cm, mép uốn lượn, mặt trên xanh lục bóng, mặt dưới nhạt. Quả nhàu hình bầu dục, dài 3 - 10cm, rộng 3 - 6cm, mọc thành chùm, quả chín có màu trắng vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt lồi lõm. Mùa quả: tháng 3 - 5. Sản lượng quả nhàu ở Hawaii có thể đạt 50 tấn/ha/năm [4], [38]. Bộ phận dùng: Vỏ, rễ, lá, quả phơi hoặc sấy khô [4]. Hình 1.1. Cây nhàu và quả nhàu 1.1.1.2. Thành phần hóa học Có khoảng 160 hợp chất hóa học đã được xác định trong cây nhàu và các nguyên tố vi lượng. Quả nhàu chứa khoảng 90% nước, các thành phần khác gồm: Chất rắn hòa tan, chất xơ, protein (chiếm 11,3% khối lượng dịch ép khô), các amino acid (acid aspartic, acid glutamic và isoleucin), chất khoáng chiếm 8,4% chất rắn (thành phần chính là kali, sulfur, calci, phospho và vết selen). Vitamin chính trong quả nhàu là vitamin C, ngoài ra còn có tiền vitamin A. Các hợp chất chính trong quả là phenolic, acid hữu cơ, alcaloid và polysarcharid. Nhóm phenolic bao gồm: damnacanthal, scopoletin, morindon, alizarin, 4 nordamnacathal, rubiadin, rubiadin-1-methyl ether và các anthraquinon glycosid khác. Damnacanthal là một antraquinon có tác dụng chống ung thư. Scopoletin là một coumarin đã được phân lập vào năm 1993 tại Đại học Hawaii, có hoạt tính giảm đau, kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, đồng thời kiểm soát mức độ serotonin trong cơ thể. Các acid hữu cơ chính là acid aproic và caprylic. Trong khi alcaloid quan trọng nhất là xeronin - là một alcaloid có khả năng kết hợp với protein của người làm tăng chức năng của chúng. Có khoảng 51 hợp chất dễ bay hơi đã được xác định trong quả nhàu chín [38], [144]. Quả nhàu chứa hàm lượng cao các polysarcharid, là thành phần chính có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống khối u [28], [66]. Theo Nguyễn Trọng Thông và cs, quả nhàu non, già và chín đều chứa anthraglycosid, flavonoid, coumarin, triterpenoid, saponin, polyphenol, alcaloid, dầu béo, tinh dầu, acid hữu cơ, đường khử, acid uronic. Trong đó, anthraquinon trong quả nhàu non là 0,56%, quả nhàu già là 0,55% [24]. 1.1.1.3. Tác dụng sinh học Nhàu đã được sử dụng làm thuốc trong dân gian từ hơn 2000 năm, với nhiều tác dụng điều trị [144]. Tuy nhiên, những bằng chứng nghiên cứu khoa học gần đây góp phần làm sáng tỏ những tác dụng điều trị của nhàu, bao gồm: a. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus: Một số nghiên cứu cho thấy, quả nhàu ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus morgaii, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella và Shigella. Tác dụng kháng khuẩn có thể do sự hiện diện của các hợp chất phenolic như acubin, L-asperuloside, alizarin, scopoletin trong quả nhàu. Dịch chiết ethanol và hexan của quả nhàu có tác dụng chống lao với khả năng ức chế 89-95% sự phát triển của Mycobacterium tuberculosis. Quả nhàu có tác dụng kháng virus và kháng nấm, nó có thể dùng như một hoạt chất để chống nấm [38], [62], [144]. 5 b. Tác dụng tăng cường miễn dịch và chống ung thư: Các đặc tính điều hòa miễn dịch và chống ung thư của quả nhàu đã được công bố trong nhiều nghiên cứu gần đây, trong đó tính đến năm 2011 đã có 19 nghiên cứu liên quan đến ung thư (7 nghiên cứu in vitro, 9 nghiên cứu in vivo trên động vật và 3 nghiên cứu in vivo trên người), nhưng chủ yếu là thử nghiệm với nước ép quả nhàu không tinh khiết [35]. Một số nghiên cứu tập trung vào phần kết tủa trong ethanol (Noni-ppt) của nước ép quả nhàu, tương ứng với một hợp chất giàu polysaccharid gồm acid glucuronic, galactose, arabinose và rhamnose. Noni-ppt đã được chứng minh là có tác dụng điều hòa miễn dịch và chống khối u trong ung thư biểu mô phổi trên chuột thực nghiệm, được báo cáo lần đầu bởi Hiramizu A. và cs [66]. Trên mô hình tế bào, Noni-ppt kích thích việc sản xuất các tế bào lympho T, tế bào tuyến ức và đại thực bào sản xuất cytokin, là những chất trung gian quan trọng trong ức chế tăng trưởng tế bào và độc tế bào khối u [38]. Noni-ppt cũng có khả năng kích thích giải phóng một số các chất trung gian từ các tế bào chuột phản ứng, bao gồm yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-10, IL-12 p70, interferon-γ (IFN-γ) và nitơ oxid (NO), ngăn chặn giải phóng IL-4, nhưng không có tác dụng trên IL-2. Noni-ppt làm chậm chu kỳ tế bào trong khối u, tăng đáp ứng của tế bào để các tế bào miễn dịch chống lại sự phát triển của khối u và tăng hoạt động của đại thực bào. Làm tăng thời gian sống sót và tác dụng điều trị khi dùng kết hợp noni-ppt với ngưỡng dưới liều điều trị tối ưu của các tác nhân hóa trị liệu chuẩn như adriamycin, cisplatin, 5-fluorouracil và vincristin. Điều này cho thấy ứng dụng lâm sàng quan trọng của noni-ppt như một chất bổ sung trong điều trị ung thư [66]. Nghiên cứu về cơ chế tác dụng cho thấy, nước ép quả nhàu cô đặc điều chỉnh các hệ thống miễn dịch thông qua kích hoạt của thụ thể cannabinoid 2 (CB2), nhưng ức chế CB1, ức chế sản xuất IL-4, nhưng tăng sản xuất của IFN-α. Đồng thời nó cũng có ích trong đáp ứng miễn dịch không đầy đủ [111]. Một số 6 nghiên cứu gần đây cho thấy, không chỉ nhóm polysacharid trong quả nhàu mà các phân đoạn chiết bằng dung môi hữu cơ cũng thể hiện tác dụng ức chế ung thư. Đặc biệt, phân đoạn chiết với ethyl acetat hoặc ethyl acetat - nước thể hiện tác dụng ức chế ung thư mạnh nhất khi thử nghiệm với dòng ung thư vú và gan. Phân tích về thành phần hóa học cho thấy ethyl acetat - nước chứa hàm lượng cao chrysin [69], [121]. Trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid và tia xạ, cao quả nhàu liều 6g/kg uống liên tục trong 5 ngày và 9 ngày đã làm cải thiện rõ rệt các chỉ số đánh giá chức năng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cũng như tình trạng chung miễn dịch như: Khối lượng tuyến lách, tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu của chuột nhắt trắng [2], [24], [25]. c. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan: - Dịch chiết ethyl acetat từ quả nhàu gây ức chế mạnh quá trình oxy hóa lipid khi so sánh với tocopherol và butyl hydroxy toluen. Hoạt động dọn gốc tự do của nước ép quả nhàu là do khả năng bảo vệ các tế bào hoặc lipid từ thay đổi oxy hóa được thúc đẩy bởi các gốc tự do anion superoxid (SAR) và lipid peroxid (LPO). Tác dụng ức chế của nước ép quả nhàu phụ thuộc vào liều của cả LPO và SAR khi thử nghiệm in vitro. Hoạt động dọn SAR của nước ép quả nhàu cao gấp 2,8 lần so với vitamin C, 1,4 lần so với pycnogenol và 1,1 lần so với bột hạt nho [38], [144]. Trên mô hình gây tổn thương cấp tính gan gây ra bởi carbon tetraclorid (CCl4) in vivo, nước ép quả nhàu 10% cho uống trong 12 ngày đã có khả năng làm giảm mức SAR và LPO của gan đến mức 20% và 50% so với ba nhóm chứng sau 3 giờ uống CCl4. Như vậy, nước ép quả nhàu có thể bảo vệ gan từ một tiếp xúc với CCl4 gây ung thư bên ngoài [144]. - Phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của nước ép quả nhàu lên men có tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn mannitol hoặc vitamin C, trong khi phân đoạn chiết với ether dầu hỏa và n-butanol có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn