Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng tích lũy solasodine ở tế bào in vitro của cây cà gai leo (tt)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN HỮU THUẦN ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ - 2016 Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế và Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huê (2011-2014). Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc PGS.TS. Cao Đăng Nguyên Phản biện 1: ............................................................................................................ ............................................................................................................ Phản biện 2: ............................................................................................................ ............................................................................................................ Phản biện 3: ............................................................................................................ ............................................................................................................ Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại: ................................................................................................................................ Vào hồi ............ giờ ........ ngày ....... tháng .......... năm .......................................... Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường đại học Khoa học, Đại học Huế MỞ ĐẦU T n cấp t iết c a đề t i Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu . Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) có tên khoa học khác là Solanum procumben Lour. thuộc họ Cà (Solanaceae). Trong thành phần h a học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, c hoạt t nh kháng vi m và ảo vệ gan, chống ại tế ào ung thư. Ngoài ra solasodine đã được nghiên cứu cho thấy có nhiều tác dụng trong y dược. Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai eo được khai thác chủ yếu từ nguồn hoang dại, nguồn nguyên liệu này không đủ để đáp ứng cho việc nghiên cứu và điều trị. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là phương pháp có những ưu điểm vượt trội mở ra tiềm năng ớn để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm ượng hợp chất thứ cấp cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những kh khăn n i tr n. Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp, bổ sung vào môi trường nuôi cấy à phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất, vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao. uất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh ưởng c a một số elicitor lên khả năng t c lũy solasodine ở tế bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance). p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự nhiên 1 cho các nghiên cứu trong ĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ àm cơ sở cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế ào để ứng dụng trong ĩnh vực dược phẩm sau này. M c tiêu c a đề t i Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance). ng a oa ọc v t c tiễn : Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng t ch ũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung các elicitor. Đồng thời luận án cũng à tài iệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và giảng dạy về ĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật. : Đề tài à hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong ĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học dùng àm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào việc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. N ng đ ng g p i c a lu n n Đây à công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế bào cà gai leo. Kết quả của luận án à đáng tin cậy và có thể sử dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn. P ạ vi ng iên cứu Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguy n, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014. 2 C ương 1. T NG QUAN T I LIỆU 1.1. SẢN TẾ UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NU I CẤY O THỰC VẬT Nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương iệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng phương pháp h a học. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn ượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy. Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một ượng nhỏ (nhỏ hơn 1% trọng ượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và phát triển của thực vật. Mặc dù hợp chất thứ cấp dường như không được thừa nhận vai trò trong việc duy trì quá trình sống cơ ản của thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng có vai trò quan trọng trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường. 1. . ỨNG D NG CHẤT KÍCH KH NG ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NU I CẤY TẾ O THỰC VẬT Elicitor thực vật có thể được định nghĩa như à một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Sự cảm ứng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm ượng của elicitor. Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor 3 nội sinh). Tr n cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học. Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên cứu cải thiện khả năng t ch ũy các hợp chất thứ cấp khi nuôi cấy tế bào mới được quan tâm trong thời gian gần đây. Trên thế giới cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng và khả năng t ch ũy hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật. Hầu hết các nghiên cứu cho thấy hàm ượng hợp chất thứ cấp tăng n khi ổ sung elicitor. 1. . C Y C GAI LEO Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn có tên khoa học khác là Solanum procumbens, mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300 m. Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc chữa thấp khớp, ho, dị ứng, đau nhức xương, đau răng, trị rắn cắn, đau ưng, cảm cúm… Gần đây, nhiều tác dụng khác của cà gai leo được phát hiện như: kháng vi m, ức chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u. Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ Cà, nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại hormon steroid khác nhau. Solasodine đã được báo cáo là có thể chống ung thư, ức chế độc hại nhiều loài sinh vật. Solasodine alkaloid ức chế acetylcholinsterase - một enzyme quan trọng trong việc truyền xung động thần kinh. Gần đây, so asodine được biết như một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đặc biệt là ung thư da. 4 C ương ĐỐI TƯ NG, NỘI DUNG V PHƯ NG PH P NGHI N CỨU .1. ĐỐI TƯ NG NGHI N CỨU Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in vitro. . . NỘI DUNG NGHI N CỨU - ác định khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo: + Nồng độ elicitor: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250 µM SA) + Thời gian nuôi cấy: 7 tuần + Thời điểm cảm ứng: 7-21 ngày - Khảo sát sơ ộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine n khả năng ức chế co agenase. - Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro của cây cà gai leo. . . PHƯ NG PH P NGHI N CỨU . .1. P ương p p nuôi cấy ô v tế ot cv t 2.3.1.1. Nuôi cấy cây in vitro 2.3.1.2. ấ 2.3.1.3 ấ 2.3.1.4. Xử lý cảm ứng t bào Bổ sung methyl jasmonate (25-250 µM), dịch chiết nấm men (1-5 g/L), và salicylic acid (50-250 µM) ở dạng riêng rẽ hoặc phối hợp các nồng độ tối ưu của chúng vào môi trường nuôi cấy tế bào với 5 thời điểm cảm ứng từ 7 đến 21 ngày sau khi nuôi cấy. 2 3 1 4 Xá định sinh khối t bào . . . P ương p p a sin 2.3.2.1. Chi t Soxhlet 2.3.2.2. Sắc ký lỏng hiệ 2323 . . . ă g cao ức ch collagenase của solasodine l số liệu T t t sơ đồ t ng iệ Cây cà gai leo in vitro Nuôi cấy callus Nhân callus Nuôi cấy tế ào ử ý các elicitor khác nhau Thăm dò nồng độ elicitor Thăm dò thời điểm ổ sung elicitor Thu sinh khối tế ào Tách chiết so asodine Định ượng Thử nghiệm hoạt t nh sinh học 6 C ương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .1. SINH TRƯỞNG V TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO .1.1. Sin trưởng c a tế bào Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo .1. . T c lũy solasodine c a tế bào Hình 3.2. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo 7 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR L N SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO 3.2.1. Ản 3.2.1.1. Nồ ưởng c a methyl jasmonate độ methyl jasmonate Bảng 3.1. Ảnh hưởng của MeJA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế o (g) Nồng độ MeJA GI (µM) Tươi Khô 25 3,89b 0,37b 1,30 d bc 50 3,38 0,35 1,13 100 3,57c 0,34c 1,19 150 2,96e 0,36bc 0,99 f bc 200 2,40 0,34 0,80 250 2,29g 0,35bc 0,76 a a ĐC 4,98 0,45 1,66 ĐC: Tế bào không xử lý elicitor. Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test). Chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng. Dịch chiết tế bào 4 tuần tuổi được phân t ch HPLC để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MeJA (25-250 µM) n t ch ũy solasodine. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo Nồng độ MeJA (µM) 25 50 100 150 200 250 ĐC1 ĐC2 Solasodine (mg/g) 127,5c 159,0a 138,0b 98,0e 38,0f 36,5f 123,5d 23,5g ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi 3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy 8 Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM MeJA Hình 3.6. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM MeJA 3.2.1.3. Thờ đ ểm cảm ứng Dựa vào kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MeJA lên khả năng t ch ũy so asodine trong tế bào cà gai leo, 50 µM MeJA được chọn để khảo sát thời điểm cảm ứng trong nuôi cấy tế bào. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời điểm xử ý MeJA 50 µM 9 n sinh trưởng của tế bào cà gai leo Ngày cả 7 14 21 ĐC ứng K ối lượng tế Tươi 3,39b 3,43b 3,71a 3,38b o (g) Khô 0,31b 0,33ab 0,34a 0,35a GI 0,88 0,84 0,99 1,13 ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo T ời điể (ng y) 7 14 21 ĐC H lượng ( g g) 108,5b 79,5c 74,5d 159,0a ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy 3.2.2. Ản 3.2.2.1. Nồ ưởng c a dịch chiết nấm men độ dịch chi t nấm men Bảng 3.5. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế o (g) Nồng độ YE GI (g/L) Tươi Khô 1 9,30a 0,54a 3,10 b 2 9,20 0,53a 3,07 3 8,80c 0,48b 2,93 d c 4 8,08 0,43 2,69 5 7,94e 0,41c 2,65 ĐC 4,98f 0,45bc ĐC: Tế bào không xử lý elicitor 10 1,66 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo Nồng độ YE (g L) H lượng ( g g) 125,5d 165,0c 220,5a 198,0b 112,0e 123,5d 23,5f 1 2 3 4 5 ĐC1 ĐC2 ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor. ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi 3.2.2.2. Thời gian nuôi cấy Từ kết quả thăm dò nồng độ, 3 g/L YE được chọn để bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy và khảo sát thời điểm t ch ũy solasodine cao nhất của tế bào cà gai leo trong suốt 7 tuần. Lượng sinh khối tế bào cũng như hàm ượng solasodine đều tăng dần từ tuần thứ 1 và đạt cực đại vào tuần thứ 4. Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE 11 Hình 3.9. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3g/L YE 3.2.2.3. Thời đ ểm cảm ứng Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế T ời điể (ng y) Tươi 7 8,79a 14 8,41a 21 5,66b ĐC 8,80a o (g) Khô 0,45a 0,36b 0,35b 0,48a GI 2,93 2,80 1,89 2,93 ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo T ời điể (ng y) 7 14 21 ĐC H lượng ( g g) 110,5b 96,0c 92,0d 220,5a ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy. 12 3.2.3. Ản ưởng c a salicylic acid 3.2.3.1. Nồ độ salicylic acid SA ở các nồng độ từ 50-250 µM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy để khảo sát khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo sau 4 tuần. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo Nồng độ SA (µM) 50 100 150 200 250 ĐC K ối lượng tế Tươi 12,03a 8,05b 7,61bc 5,99bc 5,21c 4,98c o (g) Khô 0,81a 0,68ab 0,64ab 0,53bc 0,51c 0,45c GI 4,01 2,68 2,54 2,00 1,74 1,66 ĐC: Tế bào không xử lý elicitor Bảng 3.10. Ảnh hưởng của SA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo Nồng độ SA (µM/L) 50 100 150 200 250 ĐC1 ĐC2 H lượng (mg/g) 133,5d 186,5b 245,0a 162,0c 51,0f 123,5e 23,5g ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và YE. Ở môi trường có bổ sung 150 µM SA, ượng solasodine trong tế ào đạt cao nhất (245 mg/g khối ượng khô), cao hơn khi xử ý 50 μM MeJA khoảng 1,5 lần và 3 g/L YE khoảng 1,1 lần. 3.2.3.2. Thời gian nuôi cấy 13 Hình 3.11. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA 150 µM. Hình 3.12. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150 µM SA. 3.2.3.3. Thờ đ ểm cảm ứng Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA của tế bào cà gai leo T ời điể (ng y) 7 14 21 ĐC K ối lượng tế Tươi 8,12c 8,90b 9,13a 7,61d o (g) Khô 0,68b 0,69b 0,74a 0,68b n sinh trưởng GI 2,71 2,97 3,04 2,54 ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy. 14 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo T ời điể (ngày) 7 14 21 ĐC H lượng (mg/g) 117,0b 101,5c 82,5d 245,0a ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy. 3.2.4. Ản 3.2.4.1. Nồ ưởng kết hợp c a các elcitor độ các elicitor 3.2.4.1.1. Kết hợp hai elicitor Chúng tôi chọn nồng độ thích hợp nhất của chất này kết hợp với các nồng độ khác nhau của chất kia để tìm hiểu ảnh hưởng phối hợp chúng n sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo. Cụ thể như sau: 50 µM MeJA kết hợp với YE (1-5 g/L) hoặc SA (50-250 µM); 3 g/L YE kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc SA (50-250 µM); 150 µM SA kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc YE (1-5 g/L). Các elicitor được bổ sung vào môi trường vào lúc bắt đầu nuôi cấy. Bảng 3.13. Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor ũy so asodine của tế bào cà gai leo Elicitor K ối lượng tế o (g) SA MeJA YE Tươi Khô (µM) (µM) (g/L) 50 2 4,56f 0,43e d 50 50 5,17 0,42f c 150 25 5,37 0,49b a 150 3 7,74 0,47c b 25 3 5,91 0,55a 4,98e 0,45d ĐC 15 n sinh trưởng và tích GI Solasodine (mg/g) 1,52 1,72 1,79 2,58 1,97 1,66 186,0b 165,5e 173,0c 197,5a 170,5d 123,5f 3.2.4.1.2. Kết hợp ba elicitor Bảng 3.14. Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor solasodine của tế bào cà gai leo Nồng độ elicitor K ối lượng tế SA MeJA YE Tươi (µM) (µM) (g/L) 150 50 5 4,82b 150 150 3 4,24c 100 50 3 4,05d ĐC 4,98a n sinh trưởng và t ch ũy o (g) Khô 0,31c 0,32c 0,39b 0,45a GI Solasodine (mg/g) 1,61 1,41 1,35 1,66 153,0c 160,0b 180,5a 123,5b 3.2.4.2. Thời gian nuôi cấy Nồng độ xử lý kết hợp của 2 chất SA 150 µM và YE 3 g/L cho hàm ượng solasodine cao nhất đã được sử dụng để nghiên cứu. Hình 3.15. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA 150 µM và YE 3 g/L Hình 3.16. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE 16 3.2.4.3. Thờ đ ểm cảm ứng Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế T ời điể (ngày) Tươi 7 14 21 ĐC 6,62b 5,35cd 5,13d 7,74a o (g) Khô 0,45ab 0,39b 0,32c 0,47a GI 2,21 1,78 1,71 2,58 ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy. Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo T ời điể (ng y) 7 14 21 ĐC Solasodine (mg/g) 11,8b 51,0c 46,0d 197,5a ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy 3.3. Khảo s t sơ ộ hoạt tính c a solasodine từ dịch chiết tế bào cà gai leo Bảng 3.17. Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên collagenase Chiều dài cột gel an đầu (mm) Chiều dài cột gel sau 24 giờ (mm) Chiều cao cột gel bị tiêu (mm) Dịch chiết solasodine 119 ± 2,1 104,0 ± 1,5 15,0 ± 0,6 ĐC 118 ± 1,8 50,3 ± 1,2 67,7 ± 1,6 Thí nghiệm ĐC: dung dịch collagenase 0,1 mg/mL. 17 3.4. Quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro cây cà gai leo Cây cà gai leo tự nhiên 1. Kh trùng: - Ethanol 70% trong 1 phút - HgCl2 0,1% trong 8 phút - Rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng 2. Tạo cây in vitro từ đoạn thân có mắt lá trong môi trường S0 Cây cà gai leo in vitro 3. Tạo callus từ đoạn thân, đoạn rễ và cuống lá của cây in vitro trên môi trường S1 Tạo callus 4. Nhân callus trong môi trường S2 Nhân callus 5. Nuôi 3 g callus trong 50 mL môi trường S2 (không agar) tốc độ lắc 120 vòng/phút 6. Nuôi 20 mL dịch tế bào trong 50 mL môi trường S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút Nuôi tế bào huyền phù 7. Bổ sung 150 µM salicylic acid vào môi trường S3 lúc bắt đầu nuôi cấy tế bào, tốc độ lắc 150 vòng/phút, 4 tuần. Tăng sinh so asodine 8. Tách chiết solasodine từ tế bào theo p ương p p Sox let. 9. Địn lượng dịch chiết solasodine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 10. c định hoạt tính trên cột collagen gel. Dịch chiết solasodine Hình 3.20. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm 18