Tài liệu Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thực vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------------------*****--------------------- NGUYỄN HỒ THƯ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH, ỨNG DỤNG VÀ BIỆN PHÁP KIỀM CHẾ TÁC HẠI CỦA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TỪ THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2012 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6 sulphobic acid) CPE : Chế phẩm enzyme HđC : Hoạt độ chung HđR : Hoạt độ riêng Hđmax : Hoạt độ cao nhất KC : Kiểm chứng LMS : Laccase mediator system NL : Nguyên liệu OD : Giá trị mật độ quang ∆OD : Hiệu số giá trị mật độ quang PPO : Polyphenol oxidase Pr-E : Protein-enzyme SGZ : Syringaldazine TB : Trung bình TN : Thí nghiệm UI : Đơn vị hoạt độ E ΣUI : Tổng đơn vị hoạt độ E VddE : Thể tích dung dịch enzyme VEthanol : Thể tích ethanol vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau............................... 18 Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản trong lá trà tươi ............................................36 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO .....................................41 Bảng 2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford ........................................42 Bảng 3.1. Độ ẩm của lá trà nguyên liệu .....................................................................50 Bảng 3.2. Hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu ...............................................50 Bảng 3.3. Hàm lượng protein trong nguyên liệu .......................................................51 Bảng 3.4. Hoạt độ riêng của PPO từ nguyên liệu ......................................................51 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO .....................52 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO........................53 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO ............................................................................................................54 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ............................................................................................................56 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian .....................................................................................57 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO .....................................................................................................59 Bảng 3.11 . Kết quả khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian ...............61 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO ............................................................................................................62 Bảng 3.13. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà đen (mẫu TN) ...................64 Bảng 3.14. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà xanh (mẫu TN) .................65 Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả ...............69 Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả .......................69 Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của rau quả ..............70 Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của rau quả ...............71 vii Bảng 3.19. Kết quả thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu ............................. 71 Bảng 5.1. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ albumin .................................83 Bảng 5.2. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu.................................................................................................84 Bảng 5.3. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ PPO từ nguyên liệu .............84 Bảng 5.4. Giá trị OD tương ứng khi xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO .....................................................................................................85 Bảng 5.5. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO .............................................................................................. 86 Bảng 5.6. Giá trị OD tương ứng khi xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO ...........................................................................................87 Bảng 5.7. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO .........................................................................................88 Bảng 5.8. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian ...........................................................89 Bảng 5.9. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO ..........................................................................92 Bảng 5.10. Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của PPO theo thời gian .....................................................................................93 Bảng 5.11. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid ascorbic đến hoạt độ của PPO ...................................................................94 Bảng 5.12. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric đến hoạt độ của PPO..................................................................................95 Bảng 5.13. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến hoạt độ của PPO .......................................................................................96 Bảng 5.14. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) ..................................................................................................97 Bảng 5.15. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) ..................................................................................................97 viii Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu ............................................................................................ 98 Bảng 5.17. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong CPE – PPO thô .........................................................................................98 Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của benzoquinon ở bước sóng 420nm ............................................................. 98 Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin .......................................100 Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu ...............................................................................................100 Bảng 5.21. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin ...............................101 Bảng 5.22. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của enzyme bromelin và ficin ......................................................................................102 Bảng 5.23. Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và enzyme ficin ...........................................................................................102 ix DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH MINH HỌA Trang BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt độ của PPO ...........................................................................................................62 ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO ..............................................52 Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO ................................................54 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của PPO ........................................55 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO .......................................56 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian .................58 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của PPO ..........................60 Đồ thị 3.7. Động học phản ứng PPO theo thời gian ..................................................61 Đồ thị 3.8. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) ...................................................................................................64 Đồ thị 3.9. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) ..................................................................................................66 Đồ thị 5.1. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ albumin............................. 84 Đồ thị 5.2. Sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ benzoquinon .......................99 Đồ thị 5.3. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ tyrosin .............................101 x HÌNH MINH HỌA Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase .................................9 Hình 1.2. Cấu trúc của tyrosinase ..............................................................................10 Hình 1.3. Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và oxi hóa của o-diphenol thành o-quinone bởi tyrosinase ...............................................12 Hình 1.4. Phản ứng xúc tác của laccase .....................................................................13 Hình 1.5. Trung tâm hoạt động với nguyên tử đồng của laccase .............................. 14 Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của laccase .........................................................................15 Hình 1.7. (a) Chu trình xúc tác của laccase (b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator .................................16 Hình 1.8. Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên ............................... 33 Hình 1.9. Cây trà ........................................................................................................35 Hình 3.1. Sản phẩm trà xanh ......................................................................................67 Hình 3.2. Sản phẩm trà đen ........................................................................................67 Hình 3.3. Nước trà đen và trà xanh ............................................................................68 Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol ....................................103 Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây .......................103 Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây ............................104 Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây.................................104 Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây.....................................105 Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây ........................105 Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây ............................106 Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây .........................106 Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây .............................107 Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà ...................................................................107 xi MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ, đồ thị và hình minh họa Trang Mở đầu ..........................................................................................................................1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử .........................................................3 1.1.1. Các dehydrogenase .......................................................................................3 1.1.1.1. Dehydrogenase – piridin ...................................................................3 1.1.1.2. Dehydrogenase – flavin ...................................................................4 1.1.1.3. Dehydrogenase – ubiquinon (UQ) ....................................................5 1.1.2. Các oxydase ..................................................................................................6 1.2. Enzyme polyphenol oxidase ...............................................................................8 1.2.1. Khái niệm......................................................................................................8 1.2.2. Nguồn thu nhận PPO....................................................................................8 1.2.3. Phân loại .......................................................................................................8 1.2.3.1. Tyrosinase và catechol oxidase .........................................................9 1.2.3.2. Laccase ............................................................................................. 12 1.2.4. Tính chất của PPO ......................................................................................17 1.2.5. Một số công trình nghiên cứu về PPO .......................................................22 1.2.6. Chức năng sinh học của PPO .....................................................................22 1.2.7. Ứng dụng của PPO ....................................................................................23 1.2.7.1. Trong công nghiệp thực phẩm ..........................................................24 1.2.7.2. Trong các ngành công nghiệp khác ..................................................25 1.2.7.3. Trong công nghệ môi trường ...........................................................26 1.2.7.4. Trong y học và mỹ phẩm .................................................................26 ii 1.2.7.5. Trong công nghệ sinh học nano ........................................................27 1.2.8. Sự ức chế PPO ...........................................................................................27 1.2.8.1. Phương pháp vật lý ...........................................................................28 1.2.8.2. Phương pháp hóa học .......................................................................29 1.2.8.3. Phương pháp enzyme .......................................................................32 1.2.8.4. Phương pháp gen ..............................................................................32 1.2.9. Cơ chất của PPO: Phenol .........................................................................33 1.3. Cây trà và các sản phẩm từ trà........................................................................34 1.3.1. Giới thiệu chung về cây trà ........................................................................34 1.3.2. Các sản phẩm từ trà ....................................................................................36 CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................39 2.1. Vật liệu ................................................................................................................39 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................39 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị......................................................................................39 2.1.3. Hóa chất ......................................................................................................39 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................39 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm của lá trà .....................................................39 2.2.2. Phương pháp thu nhận PPO từ nguyên liệu ...............................................40 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ của PPO ....................................................40 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích ...............41 2.2.5. Xác định hoạt độ riêng của PPO ................................................................ 42 2.2.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của PPO ..................................................................................................................43 2.2.6.1. Phương pháp xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO ...............43 2.2.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO ..................................................................................................................43 2.2.6.3. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO ..................................................................................................................43 iii 2.2.6.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ..........................................................................................................44 2.2.6.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian ....................................................................................44 2.2.6.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO ..........................................................................................45 2.2.6.7. Phương pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian .................................................................................................................45 2.2.6.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO ..........................................................................................45 2.2.7. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà ...........................................................................46 2.2.7.1. Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà ............................................................................................................46 2.2.7.2. Phương pháp chế biến trà đen ..........................................................46 2.2.7.3. Phương pháp chế biến trà xanh .......................................................47 2.2.8. Phương pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây .........................................................48 2.2.9. Phương pháp thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu .......................49 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..........................................................50 3.1. Khảo sát các đặc tính của lá trà nguyên liệu .................................................50 3.1.1. Xác định độ ẩm của lá trà nguyên liệu .......................................................50 3.1.2. Xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu ............................................50 3.1.3. Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu ......................................51 3.1.4. Xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu ...................................51 3.2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho hoạt động của PPO trong lá trà nguyên liệu ..................................................................................................52 3.2.1. Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của PPO ...............................................52 iv 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO ...................................53 3.2.3. Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO .....................................54 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO ............................. 56 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian.............................................................................................................57 3.2.6. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của PPO .........................59 3.2.7. Khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian................................ 60 3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO .......................62 3.3. Ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà ......................................................................................................................63 3.3.1. Sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà ....................................................63 3.3.2. Sản phẩm trà xanh ......................................................................................66 3.3.3. Sản phẩm trà đen ........................................................................................67 3.4. Một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO trong sẫm màu rau quả ........................................................................................................................68 3.4. 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................69 3.4.2. Ảnh hưởng của pH.....................................................................................69 3.4. 3. Sử dụng hóa chất .......................................................................................70 3.4. 4. Sử dụng enzyme ........................................................................................70 3.5. Thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu .................................................71 CHƢƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 73 Tài liệu tham khảo ......................................................................................................75 CHƢƠNG 5 : PHỤ LỤC .........................................................................................82 v MỞ ĐẦU Polyphenol oxidase (PPO) là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong các loài thực vật, động vật và vi sinh vật, xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất phenol thành quinon với sự tham gia của oxi nguyên tử. Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về PPO, các kết quả nghiên cứu cho thấy PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau có nhiều tính chất khác nhau. PPO có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt may, công nghệ y học và môi trường. Đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm PPO có hai tác dụng chính: tác dụng có lợi của PPO là loại hợp chất phenolic trong bia, rượu và nước trái cây, tạo màu và tăng hương vị cho các sản phẩm cà phê, trà, cacao và đánh giá chất lượng thực phẩm. Tác dụng có hại là PPO xúc tác quá trình oxi hóa phenol thành quinon tạo màu nâu trong mô bị tổn thương được xem là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng hóa nâu ở nhiều loại trái cây và rau củ trong quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến, gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm và giảm khả năng chấp nhận của người tiêu dùng và do đó tác động đáng kể đến nền kinh tế, ảnh hưởng đến nhà sản xuất và ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Ước tính hơn 50% rau quả bị thiệt hại do enzyme gây hiện tượng hóa nâu, trong đó trái cây và rau củ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới dễ xảy ra hiện tượng này. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu các đặc tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase từ thực vật” với mục tiêu là khảo sát các đặc tính của PPO trên cơ sở đó để ứng dụng tính chất có lợi của enzyme trong tạo màu cho thực phẩm và kiềm chế tác hại của enzyme gây hiện tượng sẫm màu ở rau quả. 1 Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm : - Khảo sát các đặc tính và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme PPO như nhiệt độ, pH, cơ chất, các chất ức chế enzyme, …. - Khảo sát ứng dụng của enzyme trong việc tạo màu cho sản phẩm thực phẩm. - Khảo sát một số tác nhân kiềm chế tác hại của enzyme như nhiệt độ, pH, hóa chất, enzyme, …. 2 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện luận văn, tôi đã luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ, chỉ bảo từ quý thầy cô, gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp. Nhân dịp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến. Cô PGS.TS. Đồng Thị Thanh Thu đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, luôn động viên và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa Trường đại học Khoa học tự nhiên TPHCM đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành luận văn. UBND tỉnh Bến Tre, Sở GD&ĐT tỉnh Bến Tre, Quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp Trường THPT Huỳnh Tấn Phát tỉnh Bến Tre đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học vừa qua. Con xin khắc ghi sâu sắc công ơn sinh thành và dưỡng dục của Ba, Mẹ và gia đình đã vất vả nuôi dưỡng cho con có được ngày hôm nay. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị làm ở phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh hóa, các bạn cao học khóa 20 đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012 Nguyễn Hồ Thƣ i CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử Quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sinh vật do hệ enzyme oxi hóa khử xúc tác. Các enzyme này thuộc nhóm chính 1 trong hệ thống phân loại enzyme và có tên gọi chung là oxidoreductase. Trong điều kiện sinh học oxi phân tử có khả năng oxi hóa cơ chất khi được hoạt hóa bởi các enzyme đặc hiệu – các chất hoạt hóa oxi (oxydase) hay các chất hoạt hóa hidro (dehydrogenase). Nhóm enzyme oxi hóa khử rất phổ biến trong tế bào của mọi sinh vật vì phản ứng oxi hóa khử là một trong những quá trình cơ bản nhất của sự sống. [10] 1.1.1.Các dehydrogenase [10] Đa số các phản ứng oxi hóa sinh học là phản ứng tách hidro khỏi cơ chất. Enzyme xúc tác quá trình này gọi là dehydrogenase. Cơ chế tác dụng của chúng được biểu diễn theo sơ đồ phản ứng : Cơ chất bị oxi hóa (khử) mất đi nguyên tử hidro còn chất B nhận hidro (oxi hóa) được hoàn nguyên. Tất cả dehydrogenase đều là enzyme có cấu tạo gồm 2 cấu tử (protein + phi protein), tính đặc hiệu của dehydrogenase do phần protein của enzyme quyết định. Theo bản chất của chất nhận hydro, dehydrogenase được chia thành 2 nhóm chính : dehydrogenase hiếu khí (enzyme xúc tác chuyển hidro trực tiếp cho oxi không khí) và dehydrogenase yếm khí (enzyme xúc tác chuyển hidro cho một chất trung gian không phải là oxi) Dựa vào bản chất của nhóm ngoại, dehydrogenase được chia thành dehydrogenase – piridin, dehydrogenase – flavin, dehydrogenase – ubiquinon 1.1.1.1. Dehydrogenase – piridin Dehydrogenase – piridin là enzyme có nhóm ngoại là dẫn xuất piridin, trong quá trình oxi hóa sinh học codehydrogenase piridin là chất tiếp nhận hydro đầu tiên, có gần khoảng 200 enzyme loại này. 3 Nhóm ngoại của dehydrogenase – piridin có cấu trúc phức tạp chứa vitamin PP gọi tắt là NAD (nicotinamit – adenin – dinucleotit) và NADP (nicotinamit – adenin – dinucleotit – photphat). Cấu tạo của NADP chỉ khác NAD là thêm một gốc acid photphoric và có công thức cấu tạo như sau Sơ đồ phản ứng tổng quát 1.1.1.2. Dehydrogenase - flavin Nhóm enzyme này còn gọi là men vàng (hay flavon – protein) vì nhóm ngoại là dẫn xuất của flavin (riboflavin hay vitamin B2) có màu vàng. Nhóm ngoại flavin gồm FMN (flavin – mono – nucleotit) và FAD (flavin – adenin – dinucleotit) có công thức cấu tạo như sau 4 Sơ đồ phản ứng tổng quát 1.1.1.3. Dehydrogenase – ubiquinon (UQ) Enzyme dehydrogenase – ubiquinon được tìm ra năm 1960 bởi D.E.Green, enzyme có nhóm ngoại là ubiquinon và là enzyme quan trọng xếp thứ tự thứ 3 trong chuỗi hô hấp sau NAD (hay NADP) và FAD (hay FMN) đến UQ, trước khi vào hệ chuyển electron cytocrom trong chuỗi hô hấp AH2 → NAD → FAD → UQ → hệ cytocrom → O2 → H2O + Q (hay NADP) (hay FMN) Nhóm hoạt động có chức năng chuyển và nhận H+ là vòng quinon theo sơ đồ sau 5 Phương trình tổng quát chuyển hydro của enzyme – ubiquinon Enzyme trao đổi [H+] với cơ chất AH2 theo sơ đồ sau 1.1.2. Các oxydase [10] Đây là nhóm enzyme oxi hóa cơ chất, xúc tác phản ứng chuyển hidro (hay electron) trực tiếp từ cơ chất sang oxi phân tử tạo thành H2O hay H2O2 Sơ đồ phản ứng của oxydase như sau Oxydase là những enzyme phức tạp có cấu tạo gồm 2 cấu tử, có kim loại tham gia trong thành phần cấu tạo (ví dụ: Cu, Fe, ...) Nhóm oxydase bao gồm: 6 * Hệ Cytocrom (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): là các enzyme chuyển electron cho oxi, cytocrom trong chuỗi hô hấp thường là b, c1, c, aa3 xếp lần lượt theo chuỗi hô hấp aa3 đến oxi, hiện nay có trên 20 cytocrom khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên có trong hầu hết các sinh vật. * Peroxidase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): là nhóm enzyme oxi hóa tách oxi từ peroxit (H2O2) hoặc các peroxit hữu cơ khác. Cơ chất được oxi hóa nhờ peroxidase ở cơ thể thường là polyphenol hoặc các axit amin mạch vòng AH2 + H2O2 → A + 2H2O * Catalase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): Xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 tạo O2 theo phản ứng * Polyphenol oxidase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon. Enzyme này khá phổ biến trong thực vật và vi khuẩn. Polyphenol oxidase không có tính đặc hiệu cơ chất cao. Polyphenol oxidase và polyphenol có trong rau củ và trái cây nên khi rau quả bị dập, cắt, thái,....thì sự phối hợp giữa các giai đoạn oxi hóa và khử của sự hô hấp bị phá vỡ, các o-quinon được tạo thành do sự oxi hóa các polyphenol có thể trùng hợp với axitamin, amin để hình thành các sản phẩm có màu, đây là nguyên nhân gây hiện tượng thâm đen khi cắt táo, khoai tây, vò lá chè, thuốc lá, .... * Ascorbat – oxydase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme oxi hóa vitamin C (acid ascorbic), có chứa trong hầu hết các mô xanh của thực vật và trong tảo, cơ chế tác dụng có thể biểu diễn theo phản ứng 7 1.2. Enzyme polyphenol oxidase 1.2.1. Khái niệm PPO được phát hiện đầu tiên ở nấm bởi Schoenbein năm 1856, là một metalloprotein có chứa nguyên tử đồng và thuộc vào nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic với sự hiện diện của oxi tạo sản phẩm quinone, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương nên PPO được gọi là enzyme hóa nâu. [30] 1.2.2. Nguồn thu nhận PPO PPO được tìm thấy trong phần lớn các mô của thực vật như táo (Harel et al., 1964), nho (Ivanov, 1966), lê (Rivas and Wtaker, 1973), khoai tây (Craft, 1966), trà (Zawistoski et al., 1991), hạt cacao, cà phê… ; trong vi sinh vật bao gồm vi khuẩn và nấm (Vamas-Vigyazo, 1981) ; trong động vật như côn trùng (Sugumaran, 1988; 1990), động vật chân khớp, động vật có vú và người (Witkop,1985). Vị trí của PPO trong tế bào thực vật phụ thuộc vào loài, độ tuổi và độ chín của trái cây và rau củ [30]. Trong thực vật PPO là enzyme nằm trong thể hạt, tuy nhiên khi trái cây, rau củ bị tổn thương hay lão hóa PPO ở dạng tự do trong tế bào chất. Nhiều nghiên cứu cho biết gen mã hóa cho PPO có mức độ biểu hiện cao trong các cơ quan khi còn non và không biểu hiện trong mô trưởng thành. PPO có thể tìm thấy trong nhiều dạng thể hạt khác nhau như hạt bột (khoai tây), thể hạt trong biểu bì, thể hạt trong rễ, lục lạp của lá. [54] Ở động vật PPO được tìm thấy trong ti thể của tế bào biểu bì tạo sắc tố, trong tôm hùm PPO được tách chiết từ lớp da nằm giữa cơ và bộ xương ngoài. [54] 1.2.3. Phân loại PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của enzyme bao gồm tyrosinase, catechol oxidase và laccase. [41] 8