Tài liệu Luận án nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguyễn Thị Minh Diệp NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH THUỘC NHÓM FLUOROQUINOLON TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG VÀ NƢỚC TIỂU LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguyễn Thị Minh Diệp NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH THUỘC NHÓM FLUOROQUINOLON TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG VÀ NƢỚC TIỂU Ngành: Hóa học Mã số: 9440112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG 2. GS.TS. TRẦN TỨ HIẾU Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. TM Tập thể hướng dẫn Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2022 Tác giả PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường Nguyễn Thị Minh Diệp i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu”, Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, giảng viên, cán bộ, chuyên viên Viện Kỹ thuật Hóa học; Phòng Đào tạo - Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội; Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Dược - Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ. Tôi xin cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường, GS.TS. Trần Tứ Hiếu, người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho Tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tại Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở, các Thầy Cô phản biện độc lập đã nhận xét và đóng góp những ý kiến quí báu để luận án này được hoàn chỉnh hơn. Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2022 Tác giả Nguyễn Thị Minh Diệp ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ................................................. vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ ................................................................. xi MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 4 1.1. Tổng quan chung về nhóm fluoroquinolon ...................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc .......................................................................................................4 1.1.2. Phân loại .........................................................................................................4 1.1.3. Cấu trúc hóa học fluoroquinolon ....................................................................5 1.1.4. Tính chất hóa lý của nhóm fluoroquinolon ....................................................6 1.1.5. Tác d ng và cơ chế tác d ng ..........................................................................9 1.1.6. Dược động học .............................................................................................. 10 1.1.7. Tính chất quang của FQL .............................................................................11 1.2. Tổng quan về các phương pháp phân tích kháng sinh nhóm fluoroquinolon14 1.2.1. Các phương pháp phân tích fluoroquinolon tiêu chuẩn trong Dược điển ....14 1.2.2. Phương pháp điện hóa ..................................................................................15 1.2.3. Phương pháp điện di mao quản ....................................................................16 1.2.4. Phương pháp LC-MS phân tích các quinolon ..............................................17 1.3. Tổng quan về phương pháp HPLC xác định các hợp chất kháng sinh fluoroquinolon .......................................................................................................... 18 1.3.1. Xử lý mẫu dịch sinh học trong phân tích HPLC ..........................................18 1.3.2. Detector cho phân tích fluoroquinolon .........................................................20 1.3.3. Một số nghiên cứu định lượng fluoroquinlon trong dịch sinh học ...............22 iii 1.3.4. Đặc điểm và các vấn đề gặp phải khi phân tích fluoroquinlon ....................25 1.4. Tổng quan phương pháp quang phổ huỳnh quang trong phân tích định lượng fluroquinolon ................................................................................................. 27 1.5. Đánh giá chung .................................................................................................. 29 Chương 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................ 31 2.1.1. Kháng sinh fluoroquinolon ...........................................................................31 2.1.2. Đối tượng phân tích ......................................................................................31 2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị .................................................................................... 31 2.2.1. Hóa chất, thuốc thử .......................................................................................31 2.2.2. Chất chuẩn ....................................................................................................32 2.2.3. Thiết bị, d ng c ........................................................................................... 33 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 33 2.3.1. Thu thập, xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu ........................................................33 2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích .......................................................................34 2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích ..........................................43 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................46 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 47 3.1. Quy trình phân tích hàm lượng moxifloxaxin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA ....................................................................................... 47 3.1.1. Điều kiện phân tích .......................................................................................47 3.1.2. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương............................................................ 50 3.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích ..........................................53 3.1.4. Ứng d ng phương pháp phân tích một số mẫu thực.....................................56 3.2. Quy trình định lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang .......................................................................................... 57 3.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp phân tích ..................................................58 iv 3.2.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp .......................................................... 61 3.2.3. Ứng d ng phương pháp để phân tích MOXI trong mẫu thực ......................64 3.3. Quy trình định lượng đồng thời bốn fluoroquinolon trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC-FLD ............................................................. 65 3.3.1. Quy trình định lượng NOR, CIP, LEVO, MOXI trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-FLD .......................................................................................65 3.3.2. Quy trình định lượng NOR, CIP, LEVO, MOXI trong nước tiểu bằng phương pháp HPLC-FLD .......................................................................................85 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 101 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA ...................................... 103 LUẬN ÁN ................................................................................................................... 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 104 PHỤ LỤC ................................................................................................................ PL-1 v DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ACN ADN ARN Acetonitril Deoxyribonucleic Acid Assosiation of Official Analytical Chemists Ribonucleic Acid CAS Chemical Abstracts Service AQ CGE CIP CZE DU-6859 ESI Accidic quinolone Electrophoresis Ciprofloxacin Capillary Zone Electrophoresis Trichiral fluoroquinolone Ethylenediaminetetraacetic Acid Electrospray Ionization FDA Food and Drug Administration FLS Fluorescent spectrometry FLD FLE FQL GAT GRE Fluorescence Detector Fleroxacin Fluoroquinolon Gatifloxacin Grepafloxacin Hexadecyl-Trimetylamoni Cloride Hanging mercury drop electrode High Performance Liquid Chromatography AOAC EDTA HDTACl HMDE HPLC ICH International Conference on Harmonization IFF Isoelectric Focusing IS ITP ITP Internal Standardization Isotachophoresis Isotachophoresis IPCC-MS3 IPCC-MS3 (Heptafluorobutyric acid) LC-ESIMS / MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem vi Acetonitril Acid Deoxyribonucleic Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức Acid Ribonucleic Thuật ngữ của Hiệp hội hoá chất Hoa Kỳ dùng gắn số định danh cho tất cả các loại hóa chất Acid quinolon Điện di mao quản gel Ciprofloxacin Điện di mao quản vùng Trichiral fluoroquinolone Acid Ethylenediaminetetraacetic Ion hóa tia điện C c quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ Phương pháp quang phổ huỳnh quang Detector huỳnh quang Fleroxacin Fluoroquinolon Gatifloxacin Grepafloxacin Hexadecyl-Trimetylamoni Clorid Điện cực giọt thuỷ ngân treo Sắc ký lỏng hiệu năng cao Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa các thủ t c đăng ký dược phẩm sử d ng cho con người Điện di mao quản điểm đẳng diện Chất nội chuẩn Điện di đẳng tốc Điện di mao quản đẳng tốc độ Acid Heptafluorobutyric Thuốc thử cặp ion dung cho LC/MS Sắc ký lỏng điện quang ion hóa Tandem khối phổ LEV LLE LOD LOM LOQ Mass Spectrometric Liquid Chromatography Mass Spectrometry Levofloxacin Liquid-Liquid Extraction Limit of Detection Lomefloxacin Limit of Quantification MDL Method Detection Limit LC-MS MECC MeOH Micellar Electrophoresis Capillary Chromatography Methanol MIC Minimum Inhibitory Concentration MOXI Moxifloxacin MQL Method Quantification Limit NOR ODS OFL PDA PP PQ RP RSD SD Norfloxacin Octadecylsilyl Ofloxacin Photodiode Array Detector Protein precipitation Piperazinyl quinolone Reversed-Phase Relative Standard Deviation Standard Deviation Sodium dodecylbenzenesulfonate Sodium Dodecyl Sulfate Solid-Phase Extraction Tetrabutylammonium Bromide Trichloroacetic acid Trietylamin Trofloxacin Ultraviolet–Visible SDBS SDS SPE TBAB TCA TEA TRO UV-Vis vii Sắc ký lỏng Khối phổ. Levofloxacin chiết lỏng lỏng Giới hạn phát hiện Lomefloxacin Giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện phương pháp Sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micell Methanol nồng độ tối thiểu của kháng sinh có tác d ng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn ở mức có thể quan sát được Moxifloxacin Giới hạn định lượng phương pháp Norfloxacin Octadecylsilyl Ofloxacin Detector mảng diot quang Kết tủa protein Nhóm piperazinyl quinolon Pha đảo Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Natri dodecyl benzen sulfonat Natri Dodecyl Sulfat Chiết pha rắn Tetrabutylamoniu Bromid Acid tricloacetic Trietylamin Trofloxacin Cực tím-nhìn thấy DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại nhóm kháng sinh quinolon và fluoroquinolon ................................ 4 Bảng 1.2. Phân loại theo cấu trúc hóa học kháng sinh quinolon ..................................... 5 Bảng 1.3. Tính chất huỳnh quang của MOXI và LEVO trong các dung môi ............... 13 Bảng 1.4. Tổng hợp một số kỹ thuật xử lý mẫu dịch sinh học và độ thu hồi tương ứng trong phân tích định lượng FQL .................................................................................... 20 Bảng 1.5. Tổng hợp các công trình nghiên cứu đã được công bố về định lượng FQL trong dược phẩm và dịch sinh học bằng phương pháp HPLC ...................................... 23 Bảng 1.6. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQL trong thuốc viên nén .............. 27 Bảng 1.7. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQL trong thuốc viên, huyết tương, nước tiểu ........................................................................................................................ 28 Bảng 2.1. Các kháng sinh FQL được nghiên cứu trong Luận án .................................. 31 Bảng 2.2. Thông tin các chất chuẩn được sử d ng........................................................ 32 ảng 2.3. Chuẩn bị hóa chất khảo sát sự tạo phức của MOX với Eu3+. ....................... 36 ảng 2.4. Chuẩn bị hóa chất khảo sát ảnh hướng pH ................................................... 36 ảng 2.5. Khảo sát lượng Eu3+ ...................................................................................... 37 ảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt SDBS ................................ 37 Bảng 3.1. Điều kiện sắc ký khi định lượng MOXI bằng phương pháp HPLC – PDA . 50 Bảng 3.2. Giá trị LOD, LOQ của phương pháp định lượng MOXI trong huyết tương 54 Bảng 3.3. Độ đúng và độ chính xác của MOXI (n=5) .................................................. 56 Bảng 3.4. Kết quả phân tích MOXI trong mẫu huyết tương người bệnh ...................... 57 Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định LOD, LOQ ...................................................... 62 Bảng 3.7. Xây dựng đường chuẩn xác định MOX trong huyết tương. ....................... 63 Bảng 3.8. Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp phân tích .............................. 64 Bảng 3.9. Kết quả phân tích hàm lượng MOXI trong mẫu huyết tương người bệnh ... 65 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thành phần pha động đến tR và khả năng tách của các chất69 viii Bảng 3.11. Ảnh hưởng của gradient nồng độ MeOH đến tR và khả năng tách của các FQN ............................................................................................................................... 70 Bảng 3.12. Chương trình gradient tỷ lệ thể tích MeOH của thành phần pha động ....... 72 Bảng 3.13. Tốc độ dòng pha động và thời gian lưu tương ứng của các FQL ............... 72 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của giá trị pH pha động đến diện tích pic của các FQL ........... 75 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lò cột đến diện tích pic của các FQL ................... 75 Bảng 3.16. Điều kiện sắc ký khi định lượng đồng thời LEVO, NOR, CIP và MOXI .. 76 Bảng 3.17. Xây dựng đường thêm chuẩn trên mẫu huyết tương thử tự tạo để giá hiệu thu hồi của phương pháp kết tủa protein bằng dung môi MeOH .................................. 78 Bảng 3.18. Diện tích pic thu được tương ứng với nồng độ các FQL thêm vào dịch nổi sau khi xử lý mẫu huyết tương ...................................................................................... 79 Bảng 3.19. Phương trình đường thêm chuẩn, hệ số tương quan và hiệu suất thu hồi của phương pháp khi xử lý mẫu bằng MeOH ...................................................................... 79 Bảng 3.20. Xây dựng đường thêm chuẩn trên mẫu huyết tương thử tự tạo để giá hiệu thu hồi của phương pháp kết tủa protein bằng dung môi TCA 20% ............................. 81 Bảng 3.21. Diện tích pic của các FQL tương ứng với các nồng độ thêm chuẩn ........... 81 Bảng 3.24. Phương trình đường chuẩn, hệ số hồi quy, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, MDL và MQL của bốn FQL ......................................................................................... 83 Bảng 3.25. Kết quả độ lặp lại của phương pháp (n=6) .................................................. 84 Bảng 3.26. Chương trình gradient nồng độ MeOH trong điều kiện sắc ký xác định FQL trong nước tiểu ...................................................................................................... 85 Bảng 3.27. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết ......................................................... 87 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết .................................................... 88 Bảng 3.29. Kết quả khảo sát thời gian lắc chiết ............................................................ 88 Bảng 3.30. Diện tích pic của các FQL khi sát độ thu hồi của phương pháp chiết lỏnglỏng ................................................................................................................................ 89 Bảng 3.31. Phương trình đường thêm chuẩn, hệ số tương quan, hiệu suất thu hồi của các FQL khi xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng ....................................... 89 ix Bảng 3.32. Ảnh hưởng của loại cột chiết đến hiệu suất thu hồi FQL khi phân tích bằng hệ thống HPLC .............................................................................................................. 90 Bảng 3.33. Kết quả chiều cao nhiễu nền và tín hiệu thu được tại giá trị LOD ............. 92 Bảng 3.34. Các thông số xác nhận phương pháp phân tích FQL trong nước tiểu ........ 93 Bảng 3.35. Hiệu suất thu hồi của các FQL khi thêm các nồng độ chất chuẩn (n=6) .... 94 Bảng 3.36. Giá trị LOD và LOQ, MDL, MQL của NOR, CIP, LEVO và MOXI ........ 95 Bảng 3.37. Phương trình đường chuẩn, hệ số hồi quy của 4 FQL ................................ 95 Bảng 3.38. Độ đúng của phương pháp định lượng FQL (n=6) .................................... 96 Bảng 3.39. Kết quả độ lặp lại tại nồng độ FQL bằng 1,0 µg/ml ................................... 97 Bảng 3.40. Kết quả độ lặp lại tại nồng độ FQL bằng 5,0 µg/ml ................................... 97 Bảng 3.41. Kết quả độ lặp lại tại nồng độ FQL bằng 10,0 µg/ml ................................. 98 x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của MOXI ............................................................................ 6 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của LEVO ............................................................................ 7 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của NOR .............................................................................. 7 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của CIP ................................................................................ 8 Hình 1.5. Cân bằng acid base của quinolon .................................................................... 8 Hình 1.6. Cân bằng acid base của các fluorroquinolon ................................................... 9 Hình 1.7. FQL tương ứng (1)-LOM; (2)-FLE; (3)-CIP; (4)-NOR ................................ 28 Hình 3.1. Phổ hấp th UV của MOXI ........................................................................... 47 Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát thành phần dung môi pha động khi định lượng MOXI .. 48 Hình 3. 3. Kết quả khảo ảnh hưởng của tỷ lệ pha động đến diện tích pic của MOXI .. 48 Hình 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm phosphat đến diện tích pic MOXI ....................................................................................................................... 49 Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm đến diện tích pic MOXI ...... 49 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động ..................................................... 50 Hình 3.7. Quy trình xử lý mẫu huyết tương chứa MOXI sau khi đã tối ưu hóa xử lý mẫu ................................................................................................................................ 52 Hình 3.8. Sắc ký đồ MOXI trong mẫu huyết tương người tại nồng độ 3,0 µg/mL ...... 53 Hình 3.9. Sắc ký đồ của MOXI (a) mẫu trắng, (b) mẫu huyết tương tự tạo với nồng độ MOXI 10,0 µg/mL......................................................................................................... 54 Hình 3.10. Đường chuẩn khi định lượng MOXI trong huyết tương bằng phương pháp HPLC ............................................................................................................................. 55 Hình 3.11. Sắc ký đồ của MOXI trong mẫu huyết tương người bệnh sử d ng thuốc tiêm truyền Avelox ........................................................................................................ 57 Hình 3.12. Phổ UV-VIS(a) và phổ phát xạ (b) của dung dịch Eu3+, MOXI, Eu3+MOXI, Eu3+-MOXI-SBDS .......................................................................................... 58 Hình 3.13. Đồ thị cường độ huỳnh quang thay đổi theo thời gian phản ứng ................ 59 xi Hình 3.14. Cường độ phát xạ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS tại các giá trị pH khác nhau ............................................................................................................ 59 Hình 3.15. Cường độ phát xạ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS theo nồng độ Eu(III)+ ..................................................................................................................... 60 Hình 3.16. Cường độ phát xạ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS theo nồng độ SBDS ........................................................................................................................ 60 Bảng 3.5. Điều kiện phân tích MOXI bằng phương pháp phổ huỳnh quang ................ 61 Hình 3.17. Phổ huỳnh quang của mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn MOXI ............ 61 Hình 3.18. Đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ MOXI và cường độ huỳnh quang ............................................................................................................................. 63 Hình 3.19. Phổ huỳnh quang của các dung dịch xây dựng khoảng tuyến tính ............. 63 (Nồng độ trên hình nhân với 10-5) ................................................................................ 63 Hình 3.20. Đường chuẩn xác định hàm lượng MOXI trong huyết tương ..................... 64 Hình 3.21. (a) Phổ phát xạ (em= 515 nm) và (b) phổ kích thích (ex = 295nm) của LEVO/MOXI tại nồng độ 1,0 µg/ml ............................................................................. 66 Hình 3.22. Sắc ký đồ của bốn FQL tương ứng với các hệ dung môi pha động khác nhau (trú thích trên sắc ký đồ) ....................................................................................... 67 Hình 3.23. Sắc ký đồ của 4 FQL tương ứng với dung môi pha động MeOH:H2O (H3PO4 0,025M) (35:65) .............................................................................................. 68 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ MeOH trong pha động đến thời gian lưu và khả năng tách của các FQL .................................................................................................. 69 Hình 3.25 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chương trình gradient nồng độ MeOH đến sự tách các FQL ............................................................................................................. 71 Hình 3.26. Sắc ký đồ tách đồng thời 4 FQN tương ứng với pha động đã tối ưu tại bước sóng kích kích và phát xạ 290/500nm ........................................................................... 72 Hình 3.27. Ảnh hưởng của bước sóng kích thích (270-300nm) đến diện tích pic của các FQL tại bước sóng phát xạ tại 515 nm.................................................................. 73 Hình 3.28. Ảnh hưởng của bước sóng kích thích (270-300nm) đến diện tích pic của các FQL tại bước sóng phát xạ tại 480 nm.................................................................. 73 xii Hình 3.29. Ảnh hưởng của bước sóng phát xạ (430-515nm) đến diện tích pic NOR và CIP tại bước sóng kích thích 280 nm ............................................................................ 74 Hình 3.30. Ảnh hưởng của bước sóng phát xạ đến diện tích pic các FQL tại bước sóng kích thích 290 nm .......................................................................................................... 74 Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu FQL chuẩn ở hai bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng Ex/Em 290/500nm (LEVO/MOXI) và 280/445nm (NOR/CIP) tại nồng độ 1,0 µg/mL75 Hình 3.32. Sắc ký đồ mẫu trắng (a) và mẫu huyết tương tự tạo chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml kết tủa bằng MeOH (b), TCA 20% (c) ............................................................... 76 Hinh 3.33. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng dung môi kết tủa protein MeOH ............................................................................................................................ 78 Hình 3.34. Quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng dung môi kết tủa protein – TCA 20% ................................................................................................................................ 80 Hình 3.35. Sắc ký đồ a) Mẫu huyết tương trắng, b) Mẫu huyêt tương thêm chuẩn FQL nồng độ 1,0 µg/ml.......................................................................................................... 82 Hình 3.36. Đường chuẩn xác định hàm lượng FQL trong huyết tương ........................ 84 Hình 3.37. Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu chứa FQL chuẩn nồng độ 1,0 µg/ml (b)...... 86 Hình 3.38. Kết quả khảo sát dùng môi chiết ................................................................. 87 Hình 3.39. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng ................................................................................................... 90 Hình 3.40. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn .......................................................................................................... 91 Hình 3.41. Sắc ký đồ mẫu nước tiểu (a) không chứa FQL, (b) mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml - xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng ............................ 92 Hình 3.42. Đường chuẩn xác định của bốn FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng chiết lỏng–lỏng .............................................................................................................. 93 Hình 3.43. Mẫu nước tiểu không chứa FQL (a), mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml (b)- xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn ................................................. 94 Hình 3.44. Đường chuẩn xác định của bốn FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng chiết pha rắn................................................................................................................... 96 xiii MỞ ĐẦU Fluoroquinolon (FQL) là nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp có hiệu lực kháng khuẩn mạnh, phổ rộng, chống lại nhiều vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm. Chúng có tác d ng tốt với nhiều bệnh nhiễm khuẩn như: nhiễm trùng đường tiết niệu, đường tiêu hóa, hô hấp, tình d c, da và mô mềm [1], [2]. Các kháng sinh này được sử d ng phổ biến nhất trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm tuyến tiền liệt, nhiễm trùng da, xương, nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn và các bệnh do các chủng vi sinh vật đã kháng penicillin và macrolid, dự phòng trong bệnh bạch cầu trung tính [1], [2]. Tác d ng kháng khuẩn của nhóm kháng sinh này do ức chế ADN gyrase, ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn. Ngoài ra, chúng còn tác d ng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic, nhóm kháng sinh này được cho là cơ nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai cho người và động vật mang thai khi sử d ng [3]. Các FQL được sử d ng phổ biến trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu tại Hòa Kỳ và Châu Âu là ciproflxacin, levofloxacin, moxifloxacin và norfloxacin [3, 4]. Mức liều sử d ng được quy định đối với từng kháng sinh trên, giúp phân bố thuốc đạt nồng độ tại vị trí nhiễm trùng để thể hiện tác d ng. Tuy nhiên khi sử d ng liều chuẩn, có thể dẫn tới phơi nhiễm quá mức ở 1 số cá thể, thể hiện nhiều tác d ng không mong muốn làm cho bệnh nhân không tuân thủ hoặc ngừng dùng thuốc. Hoặc, một số bệnh nhân bị thiếu hàm lượng thuốc tại vị trí tác d ng, dẫn đến thất bại trong điều trị. Các yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ tối ưu tại đích tác d ng như đặc điểm sinh lý bệnh nhân, vi khuẩn gây bệnh, vị trí nhiễm trùng, dược động học, dược lực học của thuốc [5, 6]. Trong phân tích FQL, nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các kỹ thuật phát hiện khác nhau đã được áp d ng. Phổ biến nhất là HPLC ghép nối với detector UV, huỳnh quang (FLD) và khối phổ (MS). Để phân tích các FQL trong các chế phẩm bào chế thường đơn giản, chỉ cần hòa tan dược chất, pha loãng nếu cần sau đó phân tích trên hệ thống HPLC. Đối với các mẫu dịch sinh học như huyết tương, dịch mật, nước tiểu, nước bọt sẽ phức tạp hơn do lẫn nhiều tạp và có nồng độ thấp khó phát hiện. Cần có phương pháp thích hợp để chiết xuất chất phân tích ra khỏi mẫu, đồng thời loại các tạp gây nhiễu [7], [8]. Phương pháp phân tích đồng thời các FQL được xây dựng với ưu điểm dùng một phương pháp, trong cùng một điều kiện có thể áp d ng cho định lượng FQL khác nhau. Tuy nhiên, việc lựa chọn tối ưu các điều kiện cho các FQL khác nhau sẽ gặp khó khăn hơn do tính chất khác nhau của chúng. Việc theo dõi đánh giá dược động học của các kháng sinh FQL sẽ là công c hữu ích để tránh các thất bại trong sử d ng thuốc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Do đó, xây dựng các phương pháp phân tích xác định hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học người bệnh là cần thiết. Các phương pháp được đề xuất phù hợp với điều kiện kỹ thuật sẵn có của các cơ sở y tế, sẽ góp phần ứng d ng thành công trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh FQL. Căn cứ trên điều kiện thực tế của các phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm, phòng nghiên cứu tại Việt Nam và vai trò của việc phân tích hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học, chúng tôi đã đề xuất và thực hiện đề tài luận án tiến sỹ có tên: “Nghiên cứu 1 phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu ”. Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. M c tiêu: nghiên cứu cơ bản nhằm phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon trong nền mẫu dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu) bằng hai phương pháp khác nhau đó là phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký hỏng hiệu năng cao ghép nối với 2 loại detector (HPLCPDA và HPLC-FLD). Đối tượng nghiên cứu: bốn loại kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon thế hệ 2, 3 và 4 gồm norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu. Các loại kháng sinh này, trong đó mới nhất là moxifloxacin (thế hệ 4), đang được sử d ng phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng đến rất nặng. Phạm vi nghiên cứu: khảo sát xây dựng và đánh giá các quy trình phân tích đơn kháng sinh (moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và phân tích đồng thời 4 kháng sinh (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu; áp d ng thử nghiệm các quy trình phân tích đã xây dựng với đơn kháng sinh moxifloxacin trong nền mẫu thử huyết tương. 2. Các kết quả dự kiến đạt được 1) Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC –PDA. 2) Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp FLS. 3) Quy trình xác định đồng thời bốn fluoroquinolon (norfloxacin, ciprocaxin, levofloxacin, moxifloxaxin) trong nước tiểu và huyết tương bằng phương pháp HPLC-FLD. Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu khảo sát điều kiện phân tích xác định kháng sinh moxifloxacin trên 2 hệ thống: sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector PDA (HPLC-PDA) và hệ thống máy quang phổ huỳnh quang phân tử (FLS). Nghiên cứu khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi moxifloxacin, lựa chọn điều kiện tối ưu khi xác định moxifloxacin bằng HPLC-PDA. Nghiên cứu khảo sát điều kiện phân tích xác định đồng thời 4 FQL trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector huỳnh quang (HPLC-FLD). Nghiên cứu khảo sát các quy trình xử lý mẫu huyết tương và nước tiểu, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi đồng thời 4 FQL, lựa chọn điều kiện tối ưu khi xác định đồng thời 4 FQL bằng HPLC-FLD. Đánh giá độ tin cậy của các phương pháp phân tích đã xây dựng: (i) định lượng moxifloxacin bằng FLS, (ii) định lượng moxifloxacin bằng HPLC-PDA và (iii) định lượng đồng thời 4 FQL bằng HPLC-FLD gồm các thông số: độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại. Áp d ng thử nghiệm quy trình xác định hàm lượng kháng sinh moxifloxacin trong nền mẫu thử huyết tương bằng HPLC-PDA và FLS. 2 Những đóng góp mới về mặt ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học: - Moxiflocaxin là kháng sinh fluoroquinolon thế hệ mới chưa có phương pháp phân tích trong Dược điển Việt Nam. Moxifloxacin hiện nay được sử d ng rộng rãi trong điều trị do đặc tính ít độc hơn so với các FQL khác. Phương pháp xác định moxifloxacin trong dược phẩm và dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu) cũng đã có không ít đề tài đã công bố. Tuy nhiên tại Việt Nam hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào về việc định lượng moxiflocaxin trong huyết tương, đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng kháng sinh này bằng hai phương pháp đó là phương pháp HPLC- PDA và phương pháp FLS. Phương pháp để xác định đối tượng nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ đề tài nào. Đối với phương pháp quang phổ huỳnh quang việc sử d ng chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl benzen sulfonat (SD S) làm tăng cường độ huỳnh quang, tăng độ nhạy và giới hạn phát hiện cũng là một điểm mới trong việc nghiên cứu phân tích xác định moxiflocaxin trong huyết tương cho tới thời điểm này tại Việt Nam. - Khả năng phát huỳnh quang là đặc trưng điển hình cho cấu trúc của kháng sinh họ FQL và đó cũng là cơ sở để định lượng FQL trong dược phẩm và dịch sinh học. Ngoài việc phát triển phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng moxifloxacin trong huyết tương, trong luận án này chúng tôi còn phát triển thành công phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector huỳnh quang (HPLC-FLD) hai kênh, là một trong những ưu điểm của phương pháp. Do phương pháp phổ huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao. Phương pháp HPLC-FLD hai kênh đã được khảo sát và lựa chọn hai cặp bước sóng kích thích/phát xạ phù hợp với hai nhóm chất sao cho đạt được tín hiệu chất phân tích là lớn nhất, tăng độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của phương pháp. Ý nghĩa thực tiễn: - Đề tài đã nghiên cứu xây dựng thành công hai quy trình định lượng đơn kháng sinh moxifloxacin bằng HPLC-PDA và FLS trong nền mẫu huyết tương. Việc áp d ng thử nghiệm các quy trình phân tích này trên một số mẫu thử huyết tương cho kết quả tốt. Bên cạnh đó, đề tài đã xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời 4 FQL (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin), đại diện cho 3 thế hệ FQL 2, 3 và 4, trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu. Các FQL này đang được sử d ng rất phổ biến trong phác đồ điều trị của các y bác sỹ cho các bệnh nhiễm khuẩn nặng. Các quy trình này có thể áp d ng trong trường hợp nhiều bệnh nhân đang sử d ng các kháng sinh khác nhau trong 4 kháng sinh trên mà chỉ cần một quy trình xử lý mẫu, cùng một điều kiện sắc ký có thể định lượng đồng thời giúp rút ngắn thời gian mà vẫn cho kết quả chính xác. Từ đó gợi ý cho việc nghiên cứu ứng phương pháp phân tích này trong hỗ trợ giám sát nồng độ thuốc, điều chỉnh phác đồ điều trị của các y bác sỹ hoặc nghiên cứu dược động học của thuốc kháng sinh mới có chứa norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin. - Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án tương đối đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện thực tiễn trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam, máy móc thiết bị, dung môi, hóa chất tương đối phổ biến. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan chung về nhóm fluoroquinolon 1.1.1. Nguồn gốc Kháng sinh được định nghĩa: “Kháng sinh là những chất kháng khuẩn được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác d ng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khácʼʼ [1]. Hợp chất quinolon đầu tiên được điều chế là acid nalidixic (1962). Các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu về hoạt tính sinh học của acid nalidixic được công bố năm 1964, kết quả cho thấy hợp chất này có tác d ng kháng khuẩn với vi khuẩn Gram (–) [2]. Với sự phát hiện về hoạt tính sinh học này các nhà khoa học tiếp t c tổng hợp điều chế các chất dẫn xuất tử acid nalidixic như norfloxacin (1978), pefloxacin (1979), ofloxacin (1982)…[2]. Với các hợp chất dẫn xuất của acid nalidixic đều có tác d ng sinh học kháng khuẩn tốt và được sử d ng nhiều trong các thuốc kháng sinh. Với ưu điểm về hoạt tính sinh học, các dẫn xuất của quinolon ngày càng được điều chế, tổng hợp nhiều hơn và dựa trên tác d ng sinh học, đặc tính dược động học của chúng, quinolon được phân biệt thành các thế hệ [1], [2], [8], [9]. 1.1.2. Phân loại 1.1.2.1. Phân loại theo phổ kháng khuẩn và chỉ định lâm sàng Theo cách phân loại mới từ năm 1997, các kháng sinh nhóm quinolon và fluoroquinolon có liên quan đến phổ kháng khuẩn và chỉ định lâm sàng của chúng. Các loại thuốc trong mỗi nhóm tương tự nhau về tác d ng kháng khuẩn, theo cách phân loại này, các thế hệ tiếp theo và các mầm bệnh mới sẽ được bổ sung vào trong nhóm (Bảng 1.1) [9-11]. Bảng 1.1. Phân loại nhóm kháng sinh quinolon và fluoroquinolon Tên kháng Thế hệ Phổ kháng khuẩn Chỉ định lâm sàng sinh Thế hệ 1 Thế hệ 2 Acid nalidixic Cinoxacin Vi sinh vật Gram-âm trừ Nhiễm trùng đường tiết loài Pseudomonass niệu không biến chứng. Norfloxacin Lomefloxacin Enoxacin Ofloxacin Ciprofloxacin - Vi sinh vật Gram (-) (gồm loài Pseudomonas) - Một số vi sinh vật Gram (+) (gồm Staphylococcus aureus, trừ Streptococcus pneumoniae). - Một số vi sinh vật không điển hình. 4 - Nhiễm trùng đường tiết niệu không biến chứng và phức tạp. - Viêm thận. - Bệnh lây qua đường tình d c. - Viêm tuyến tiền liệt. - Nhiễm trùng da và mô mềm. Thế hệ 3 Thế hệ 4 Levofloxacin Sparfloxacin Gatifloxacin Moxifloxacin - Phổ tác d ng giống như nhóm quinolon thế hệ 2. - Vi sinh vật Gram dương (S. pneumoniae nhạy cảm hoặc kháng penicillin) Trovafloxacin - Tác d ng tương tự như quinolon thế 3 và 4 (trừ - Phổ tác d ng giống như nhiễm trùng đường tiết nhóm quinolon thế hệ 3. niệu phức tạp và viêm - Kháng vi sinh vật yếm thận). khí. - Nhiễm trùng ổ b ng. - Viêm phổi bệnh viện. - Nhiễm trùng vùng chậu. - Viêm phế quản cấp hoặc mạn tính. - Viêm phổi mắc phải ở cộng đồng. 1.1.2.2. Phân loại theo nhóm naphthyridon Phân loại theo nhóm naphthyridon và fluoroquinolon (Bảng 1.2). Cấu trúc cơ bản quinolon vòng acid carboxylic, vòng pyridin, carbon, nitơ và mạch nhánh [12]. Bảng 1.2. Phân loại theo cấu trúc hóa học kháng sinh quinolon Quinolon Fluoroquinolon Thế hệ 1 Thế hệ 2 Thế hệ 3 Thế hệ 4 Acid Nalidixic Norfloxacin Tosufloxacin Trovafloxacin Acid Oxolinic Pefloxacin Temafloxacin Moxifloxacin Acid Piromidic Enoxacin Sparfloxacin Prulifloxacin Cinonaxin Ofloxacin Grepafloxacin Sitafloxacin Miloxacin Ciprofloxacin Pazufloxacin Gemifloxacin Rosoxacin Flumequine Balofloxacin Clinafloxacin Acid Pipemidic Lomefloxacin Levofloxacin Besifloxacin Droxacin Nadifloxacin Garenoxacin Rufloxacin Gatifloxacin Fleroxacin Alatrofloxacin 1.1.3. Cấu trúc hóa học fluoroquinolon Trong cấu tạo của nhóm quinolon có hai loại cấu trúc vòng: Một là nhân naphthyridin với nitơ ở vị trí 1 và 8 (như trong acid nalidixic), và một là nhân quinolin chỉ có một ni tơ ở vị trí 1 (như trong acid oxolinic). Tất cả các hợp chất, cả quinolon và naphthyridon đều chứa nhóm xeton ở vị trí 4 và bên cạnh là nhánh acid carboxylic ở vị trí 3. Các dẫn xuất của quinolon là những hợp chất có gắn thêm nhánh các hợp chất hữu cơ tại vị trí 1, 2, 6, 8 trong acid nalidixic hoặc acid oxolinic [10]. Quinolon thế hệ một không có nguyên tử Flo, các thế hệ sau trong cấu trúc phân tử có thêm 5