Tài liệu Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt cây neem (azadirachta indica a. juss)

Mục lục LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC VIẾT TẮT Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ............................................................................................................ 2 1.3. Mục đích ........................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 2.1. Giới thiệu về cây Neem .................................................................................... 3 2.1.1. Mô tả cây và giá trị của cây Neem ............................................................ 4 2.1.2. Dƣợc tính ................................................................................................... 7 2.1.3. Các hợp chất limonoid trong cây Neem .................................................... 8 2.2. Các phƣơng pháp trích ly limonoid từ hạt Neem ........................................... 14 2.2.1 Phƣơng pháp sử dụng dung môi ............................................................... 14 2.2.2 Phƣơng pháp hiện đại, trích ly bằng CO2 siêu tới hạn ............................. 16 2.3. Tính chất vật lý của họ Limonoid................................................................... 17 2.4. Tính chất hóa học của limonoid ..................................................................... 18 2.5. Các phƣơng pháp xác định limonoid .............................................................. 18 2.5.1. Phƣơng pháp sắc kí khí – khối phổ (GC – MS) ...................................... 18 2.5.2. Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC ................................................... 19 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ............................................................ 20 2.6. Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc liên quan đến việc trích ly hợp chất limonoid từ cây Neem ........................................................ 21 2.6.1. Tổng quan các công trình nghiên cứu tại Việt Nam ................................ 21 2.6.2. Tổng quan các công trình nghiên cứu trên thế giới ................................. 23 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 25 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ........................................................... 25 3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 25 3.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị ......................................................................... 25 3.3.1 Dụng cụ..................................................................................................... 25 3.3.2. Hóa chất ................................................................................................... 25 3.3.3. Thiết bị ..................................................................................................... 25 3.4. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 26 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 26 3.5.1. Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem ........................................................................................................ 26 3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem............................................................. 29 3.5.3. Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem..................................................... 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ........................................................................ 33 4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem ............................................................................................................... 33 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem ........................................................................ 36 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem ................................................................ 38 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 41 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 41 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 42 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Th.S Kha Chấn Tuyền, Th.S Đoàn Thị Tuyết Lê. Ngƣời đã luôn động viên, tận tình hƣớng dẫn, quan tâm và giúp đỡ em rất nhiều về kiến thức cũng nhƣ truyền đạt kinh nghiệm cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học & Môi Trƣờng, cũng nhƣ tất cả các thầy cô của trƣờng đại học Lạc Hồng đã truyền đạt kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập. Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện khoa học và ứng dụng Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm việc tại viện. Em xin cảm ơn các anh chị trong phòng phân tích, cùng các anh chị làm việc tại Viện. Con vô cùng biết ơn ba mẹ và anh chị đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho con hoàn thành chƣơng trình đại học trong suốt thời gian vừa qua. Xin cảm ơn sự góp ý và giúp đỡ của tất cả các bạn trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Sinh viên Phạm Hồng Thắng Nguyễn Thành Trung DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Khu vực vƣờn giống cây Neem tại xã Phƣợc Dinh, huyện Ninh Phƣớc, tỉnh Ninh Thuận .................................................................................................................. 3 Hình 2.3 Lá và trái Neem trồng tại Ninh Thuận ................................................................ 5 Hình 2.3 Nhân hạt Neem tại Ninh Thuận ........................................................................... 7 Hình 2.4. Cấu trúc Limonoid .............................................................................................. 9 Hình 2.6 Các hoạt chất chính trong lá và hạt Neem ......................................................... 14 Hình 3.1 Thiết bị trích ly dầu Neem ................................................................................. 27 Hình 3.2 Máy cô quay chân không .................................................................................. 29 Hình 3.3 Máy sắc kí cột cao áp (HPLC) ........................................................................... 30 Hình 3.4 Thiết bị trích ly có hỗ trợ vi sóng ....................................................................... 32 Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện khối lƣợng cao thu đƣợc từ 3 loại dung môi.......................... 34 Hình 4.2 Cao Neem sau khi trích ly .................................................................................. 35 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào loại dung môi ................. 35 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng cao phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi ........................................................................................... 37 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi ....................................................................................... 38 Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu ở các khoảng thời gian và công suất khác nhau ...................................................................................... 39 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện lƣợng Limonoid khi xử lý nguyên liệu ở các công suất và khoảng thời gian khác nhau .............................................................................................. 40 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các hợp chất limonoid trong cây Neem ............................................................. 9 Bảng 2.2 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân, cành, lá, rễ và thân cây Neem ................ 12 Bảng 2.3 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân hạt nem ở các nƣớc ................................. 13 Bảng 2.4. So sánh phƣơng pháp trích ly bằng dung môi có hỗ trợ vi sóng ...................... 16 Bảng 4.1 Kết quả lƣợng cao Neem thu đƣợc bằng 3 loại dung môi khác nhau................ 33 Bảng 4.2 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc bằng 3 loại dung môi khác nhau ................ 34 Bảng 4.3 Mã hóa yếu tố thí nghiệm ................................................................................. 36 Bảng 4.4 Kết quả lƣợng cao thu đƣợc khi khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem .......................... 36 Bảng 4.5 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc khi khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem .......................... 37 Bảng 4.6 Kết quả lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng ...................... 38 Bảng 4.7 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng ..............39 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình trích ly tổng quát đối với nguyên liệu hạt Neem .............................. 15 Sơ đồ 3.1 Quy trình trích ly hoạt chất limonoid từ hạt cây Neem .................................... 28 DANH MỤC VIẾT TẮT SCFs : Lƣu chất siêu tới hạn GC – MS: Phƣơng pháp sắc kí khí - khối phổ (gas chromatography- Mass Spechrmetry) HPLC: Sắc kí lỏng cao áp (High performance liquid chromatography) 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thiên nhiên từ thực vật, động vật, vi sinh vật … ngày nay đƣợc hƣớng đến sử dụng thay thế cho các hóa chất tổng hợp ở các lĩnh vực nông nghiệp, môi trƣờng và dƣợc phẩm. Trong lĩnh vực nông nghiệp các hoạt chất sinh học đƣợc ứng dụng bảo vệ thực vật, kích thích sinh trƣởng cho cây trồng, bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm … Các hoạt chất sinh học trong cây Neem hay cây Xoan chịu hạn tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, thuộc họ xoan (Meliaceae) trên thế giới đã nghiên cứu đƣợc ứng dụng nhƣ chất chống viêm trong y học, chống nấm mốc, kháng khuẩn, diệt côn trùng gây hại, … trong bảo vệ thực vật và bảo quản nông sản cho đến các sản phẩm thực phẩm chức năng chống oxy hóa. Nhƣng tại Việt Nam các nghiên cứu đi vào ứng dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem chủ yếu về lĩnh vực bảo vệ thực vật và bắt đầu có những nghiên cứu sử dụng các hoạt chất này trong bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm nhƣ việc sử dụng dầu Neem với nồng độ 200 ppm có tác dụng xua đuổi sự ký sinh của bọ hà (Cylas Formicarius F.) [7]. Điều chế thuốc với hoạt chất từ lá Neem Ninh Thuận để phòng trừ mối mọt trong bảo quản ngũ cốc… Theo kết quả điều tra mới nhất của Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai về tổn thất sau thu hoạch đối với 8 loại nông sản chính (lúa, bắp, cà phê, điều, tiêu, rau ăn lá, rau ăn quả và trái cây) thì trái cây đứng hàng đầu với tỷ lệ tổn thất trung bình gần 19%. Còn rau ăn lá và rau ăn quả tổn thất từ 12 - 13,6%, với lúa là trên 12%, cà phê trên 7%, bắp trên 6%...Trong đó, tổn thất nặng nề nhất là ở các khâu thu hoạch, vận chuyển và bảo quản sơ chế. Do đó, để góp phần vào việc giảm tổn thất sau thu hoạch ở khâu bảo quản nông sản đồng thời nâng cao giá trị sử dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem, 2 chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt cây Neem (Azadirachta indica A. Juss)”. Từ đó làm tiền đề ứng dụng tác dụng các hoạt chất sinh học từ hạt Neem trong ngành bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm. 1.2 . Mục tiêu - Xác định đƣợc loại dung môi cho hiệu suất thu hồi limonoid cao. - Xác định tỉ lệ dung môi và nguyên liệu, thời gian thích hợp của phƣơng pháp trích ly các hoạt chất limonoid từ hạt Neem cho hiệu suất cao và có hiệu quả. - Khảo sát và xác định đƣơc sự ảnh hƣởng của vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt cây Neem. 1.3 . Mục đích Góp phần xây dựng quy trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ hạt cây Neem với hiệu suất cao. 3 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về cây Neem Cây Neem (Xoan chịu hạn) tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, thuộc họ Xoan (Meliaceae), có nguồn gốc từ Ấn Độ và chính tại đây cây Neem đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Là loài cây chịu hạn và thích nghi rất tốt với các điều kiện khác nhau của môi trƣờng, do vậy cây Neem đƣợc trồng từ cực nam Karaia của dãy Hymalya, từ vùng nhiệt đới tới vùng cận nhiệt đới, vùng khô cằn tới vùng nhiệt đới, từ vùng gần mặt nƣớc biển đến vùng có độ cao 700 m so với mặt nƣớc biển. Cây Neem đƣợc du nhập vào Việt Nam từ năm 1981 trồng thử nghiệm bƣớc đầu thành công ở tỉnh Thuận Hải (cũ), ngày nay thuộc tỉnh Ninh Thuận với diện tích nhỏ, nhƣng thực sự phát triển nhanh ở Ninh Thuận kể từ năm 1998 bắt đầu từ mô hình nghiên cứu khoa học trồng thử nghiệm 5 ha cây Neem trồng xen với cây Keo lá tràm tại hộ ông Nguyễn Văn Phóng, xã Phƣớc Dinh, huyện Ninh Phƣớc. Hình 2.1 Khu vực vƣờn giống cây Neem tại xã Phƣợc Dinh, huyện Ninh Phƣớc, tỉnh Ninh Thuận Sau đó, cây Neem đƣợc trồng nhiều ở vùng khô hạn Ninh Thuận, diện tích hiện nay trên 6.000 ha và triển vọng sẽ trở thành cây quan trọng trong chiến lƣợc 4 phát triển của tỉnh trong tƣơng lai, do đặc điểm sinh học thích hợp với điều kiện khí hậu và đất đai của vùng khô hạn Ninh Thuận và những tiềm năng ứng dụng của nó. Ngoài các lợi ích trong việc cải tạo môi trƣờng sinh thái cho vùng bán khô hạn của Ninh Thuận nhƣ: phủ xanh đất cát ven biển và đồi núi trọc, chống xói mòn, cây Neem còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau trong nông nghiệp nhƣ chế biến thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản nông sản có nguồn gốc thảo mộc, phân bón, dƣợc phẩm, mỹ phẩm cho đến thực phẩm chức năng phục vụ đời sống. Khi diện tích Neem phát triển thì việc thu hoạch, bảo quản và chế biến các sản phẩm từ lá, trái, gỗ cây Neem trong theo hƣớng công nghiệp cần đƣợc nghiên cứu để tăng hiệu suất sử dụng, mở thêm ngành sản xuất mới, tạo công ăn việc làm cho ngƣời dân. Theo Báo Tuổi trẻ Online, ngày 3/7/2011 Ban quản lý rừng phòng hộ ven biển Ninh Phƣớc đã bán 4 tấn lá Neem tƣơi và hơn 10 tấn lá Neem khô cho Công ty quốc tế Phi Long (Hà Nội) với mức giá 2.000 đồng/kg lá tƣơi và 6.000 đồng/kg lá khô. Công ty sẽ xuất khẩu số hàng này sang Nhật Bản làm dƣợc liệu (kem đánh răng, thuốc chữa đau bụng...). 2.1.1. Mô tả cây và giá trị của cây Neem Cây Neem là loại cây gỗ trung bình, đƣờng kính 40-50 cm cao từ 12-15 mét, chịu hạn tốt. Nó là loại cây có lá xanh quanh năm, phát triển tốt ngay cả trên đất cát bạc màu, đất nghèo dinh dƣỡng với khí hậu khô cằn. Cây có nhánh rộng, tán lá hình oval hay hình tròn đƣờng kính khoảng 1 – 1,5m.. Cây từ 8 tuổi trở đi bắt đầu cho gỗ tốt, dùng cho công nghiệp đồ mộc, làm trụ trồng thanh long, làm giàn nho... cành nhỏ làm củi đốt. Lá Neem thuộc loại lá kép lông chim một lần, dạng mác, bìa lá có khía hình răng cƣa, cuống lá ngắn. Cây ra lá non và khoảng tháng 2 – 4 và bộ lá thƣờng xanh tốt quanh năm, không có thời kỳ rụng lá. Một cây Neem cao 7,5 – 8m cho trung bình hàng năm khoảng 350 kg lá tƣơi (tƣơng đƣơng khoảng 50 kg lá khô). Lá Neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ: Nimbin, Nimbinene, Nimbandiol, Nimbolide, Quercetin ...có nhiều tác dụng trong việc chữa trị các vết thƣơng lở loét, 5 vết thƣơng làm độc, các bệnh về mắt, có thể dùng làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất vừa có tác dụng phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đƣờng ruột. Hình 2.3 Lá và trái Neem trồng tại Ninh Thuận Trái Neem có hình bầu dục, trơn láng và dài khoảng 2cm. Trái hình thành, phát triển và chín trong khoảng 1-2 tháng. Thông thƣờng trái chín từ tháng 6 – 8, trái Neem khi chín có vị ngọt, có thể ăn đƣợc, phần thịt bên trong có chứa hạt màu sáng, chiều dài khoảng 1,5 cm, chứa 1-2 nhân hạt màu nâu bên trong. Thời điểm thu hoạch tốt nhất là lúc trái vừa chuyển sang màu xanh vàng và nên thu hoạch khi trái còn ở trên cây. Cây Neem trƣởng thành mỗi năm có thể cho 30 – 50 kg trái tƣơi. Trái Neem đƣợc dùng làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đƣờng tiết niệu, bệnh trĩ. Nƣớc thịt quả khi phun lên cây có thể xua đuổi côn trùng, diệt các ổ bệnh nhƣ dịch tả, sốt xuất huyết … Theo nghiên cứu của Phân viện cơ điện nông nghiệp và công nghệ sinh học năm 2002, để bảo quản hạt Neem sau thu hoạch không bị mất các hàm lƣợng có chứa các hoạt chất sinh học thì việc thu hoạch và sơ chế hạt phải thực hiện theo các bƣớc sau: - Thu hoạch: Trái Neem đƣợc hái khi chín, trái có màu vàng nhạt, không đƣợc hái trái xanh vì tỷ lệ nảy mầm và hàm lƣợng dầu thấp. Khi chín trái dài khoảng 2cm, có hình oval. Phần thịt bên trong có chứa hạt màu sáng, chiều dài 6 khoảng 1,5 cm, chứa 1-2 nhân hạt màu nâu bên trong. Cƣờng độ hô hấp trái Neem rất cao trong giai đoạn chín (400 ml CO2/kg/giờ), chứng tỏ hoạt động sinh lý của trái Neem diễn ra rất mạnh, thoát nƣớc rất nhiều và cần nhiều oxy, vì vậy không nên sử dụng các loại bao bì PE, PP đựng trái và hạt, phải sử dụng loại bao đay, bao vải. Sau khi hái trái phải đƣợc trải mỏng 2-3 cm ra nền thấm nƣớc tốt để thoát nƣớc, tránh hƣ hỏng trái. - Sơ chế: Sau khi thu hoạch cần phải nhanh chóng bóc phần thịt quả càng nhanh càng tốt. Ngâm trong nƣớc lạnh trong vài giờ làm cho phần thịt quả rời ra. Trái sau đó cọ xát mạnh bằng nƣớc sạch và ngâm trong nƣớc để tách hạt khỏi phần thịt quả. Hạt sau khi tách ra đƣợc trải mỏng ra, phơi nắng từ 3-4 ngày trên sàn hoặc sân phơi thấm nƣớc. Quá trình hong khô phải đƣợc tiến hành cẩn thận vì những hạt chƣa khô dễ bị nhiễm mốc, chủ yếu là Aspergillus sp. gây ra. Sau khi hong khô đạt ẩm độ khoảng 12% đựng hạt trong các bao vải, bao đay, bao bố ... tránh đựng hạt trong các túi nylong làm ảnh hƣởng đến sự hô hấp của hạt và làm giảm phẩm chất tinh dầu cũng nhƣ các hoạt chất sinh học. Không dùng các hạt có nhân màu đen để đem gieo hoặc ép tinh dầu. Nhân hạt Neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ azadirachtin, salanin, meliantriol … Dầu chiết từ nhân hạt Neem đƣợc dùng để sản xuất thuốc giảm đau, thuốc sát trùng … Ngoài ra, dầu hạt Neem còn đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng và nhiều ngành công nghiệp khác. 7 Hình 2.3 Nhân hạt Neem tại Ninh Thuận 2.1.2. Dƣợc tính Hợp chất nimbidol đƣợc trích từ hạt Neem có tính hạ sốt và trị sốt rét. Các công trình của Obaseki cho thấy dịch trích trong quả của loài cây này nếu cho uống thì có hiệu quả trên chuột nhắt đã nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoellinigeriensis [21]. Theo Abatan, dịch trích metanol của lá Neem có tác dụng trên ký sinh trùng ở chuột nhắt đã nhiễm Plasmodium berghei với liều lƣợng 500 mg/kg trong 4 ngày [8]. Hợp chất nimbidin đƣợc trích từ hạt Neem có tác dụng chống viêm loét bao tử, trị phong thấp. Nimbidin có ức chế nấm da, tóc Tinea rubrum. Dung dịch nimbidin còn ức chế vi trùng lao. Hợp chất mahmoodin, trích từ dầu Neem đƣợc thử nghiệm tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Hợp chất natri nimbidinat và natri nimbinat là dẫn xuất của nimbidin và nimdin có tính diệt côn trùng. 8 Omkar Parshad và cộng sự đã nghiên cứu về dịch chiết nƣớc và dịch sterol của lá Neem tác động đến khả năng thụ thai của chuột. Các tác giả cho rằng, trong dịch chiết sterol có chứa azadirachtin và những limonoid có tác dụng ngăn chặn sự sản sinh hormon tạo hoàn thể [22]. Parshad và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng an thần đối với chuột của dịch chiết sterol thô của lá Neem. Dịch chiết sterol thô của lá Neem đƣợc đƣa vào chuột với liều 100 mg/kg trọng lƣợng chuột, 2 lần trong một tuần, liên tục trong 6 tuần, nhận thấy có tác dụng làm giảm hoạt động của thần kinh tự phát ở chuột, do đó dịch chiết này có tác dụng an thần ở chuột. Các tác giả cho rằng, đó là do dung dịch chiết của lá Neem có tác động đến thần kinh trung ƣơng hoặc lực của cơ vận động và không ảnh hƣởng đến thần kinh ngoại biên [22]. Năm 1873, Alfre Petelot và Broughton đã cô lập từ các bộ phận của cây Neem một chất nhựa rất đắng có tên azadin, có chứa D-glucosamin, arabinoz, galactoz, dùng trong nghề nhuộm. Theo Alfre Petelot, còn cho biết lá có hoạt tính diệt côn trùng, khi cháy cho khói có mùi khó chịu và giết đƣợc côn trùng [9]. Khảo cứu dƣợc lý học của Luscombe cho thấy lá cây Neem có tác dụng kháng virus. Tác dụng của cây này trên hệ thống tim mạch đã đƣợc thử nghiệm, với dịch trích nƣớc của lá thì làm nhịp tim ở thỏ giảm đi trong khi ở chuột lang thì trở nên mất cảm ứng với dƣợc liệu này [26]. Theo Shimizu Masaki, tính chất chống khối u đƣợc ghi nhận với dịch trích nƣớc của rễ và lá trên chuột do Polysacharid gọi là N9G1 [20]. Ngoài ra, dịch trích của Neem có ảnh hƣởng lớn đối với côn trùng nhƣ gây ngán ăn, chất xua đuổi hay ức chế tăng trƣởng của côn trùng. 2.1.3. Các hợp chất limonoid trong cây Neem Các hoạt chất sinh học từ cây Neem đƣợc chia thành hai nhóm chính là Isoprenoid và các chất không phải là Isoprenoid nhƣ các hợp chất polyphenolic (Flavonoid, Flavonoglycoside, Dihydrochalcone, Tanin, Coumarin), các hợp chất Cacbonhydrate, protein và các hợp chất sulfua dễ bay hơi. Các hoạt chất sinh học 9 thuộc nhóm Isoprenoid gồm 24 chất thuộc diterpenoid, triterpenoid (hay còn gọi là limonoid) đƣợc chia thành 8 nhóm nhỏ: protomeliacin, limonoid với chuỗi bên xác định, azadirone và dẫn xuất, gedunin và dẫn xuất, valasinin và 3 nhóm C-secomeliacin là nimbin, salanin và azadirachtin. (Theo bảng 2.1) Về mặt cấu trúc, limonoid là một dẫn xuất của triterpenoid có khung cơ bản là 4, 4, 8-trimethyl-17-furamyl-steroid với 5 vòng A, B, C, D, và E theo hình 2.5. Trừ vòng furan E rất ít bị thay đổi, 4 vòng A, B, C, D có thể bị oxy hóa ở nhiều mức độ khác nhau, dựa vào tính chất oxy hóa của các vòng, ngƣời ta có thể xếp các hợp chất limonoid vào nhiều nhóm khác nhau. O 23 E 21 22 18 12 11 19 17 C30 1 9 2 A 3 4 10 B 5 6 29 13 16 D 15 14 8 7 28 Hình 2.4. Cấu trúc Limonoid Bảng 2.1 Các hợp chất limonoid trong cây Neem Tên hoạt chất Công thức Phân tử Điểm nóng Nguồn cô phân tử lƣợng chảy lập Các hợp chất nhóm protomelicin Meliantriol C30H50O5 490 176 Dầu Neem Nomolinone C30H44O3 452 190 Quả Azadirachtol C32H46O6 526 112 Quả Các hợp chất nhóm Azadirone và các hợp chất tương tự Azadirone C28H36O4 436 - Quả, Dầu 10 7-Aeacetyl azadirone C26H34O3 394 - - Nimocinol C28H36O5 452 130 Quả Meldenin C28H36O5 452 244 Dầu hạt Isomeldenin C28H36O5 452 - 4α-6α-dihydroxy-A-homo- C28H36O6 468 180 Lá khô 7-azacetylneo-trichilenone C28H36O5 452 208 Hạt Meldenin C28H36O5 452 244 Dầu hạt Azadiradione C28H34O5 450 168 Dầu, Quả 17-Epi- Azadiradione C28H34O5 450 205 Hạt, quả 17-β-hydroxy- C28H34O6 466 177 Hạt, quả 17-β-hydroxy-nimbocinol C26H32O5 424 - Hạt, quả 7-Benzoyl- nimbocinol C33H36O5 512 - Hạt, quả Nimolicinoic acid C26H34O6 442 94 Quả Nimbinin (Nn) C28H34O6 466 203 Dầu 1-α-methoxy-1,2- C29H38O7 498 235-6 Hạt khô 1β,2β-EpoxyNn C28H34O7 482,6 110-11 Hạt khô 7-Deacetyl-&-benzoylNn C33H36O6 528,3 - Hạt khô DihyroNn C28H36O6 468 - Hạt khô Lá Azadiradione azadiradione dihydroNn Các hợp chất nhóm gedunin và các dẫn xuất Gedunin C28H34O7 482 220 Quả, vỏ cây 7-Desacetyl gedunin C26H32O6 440 259-62 Quả, vỏ cây 7-Desacetyl-7-benzoyl C33H36O7 544 278 Hạt khô C30H38O8 526 - Dầu hạt 452 - Dầu hạt gedunin Mahmoodin Các hợp chất nhóm pro-C-seco-meliacin Vepinin C28H36O5 11 Nimbidinin C26H36O6 442 282,2 Dầu hạt 1,3-Diacetyl vilasinin C30H40O7 512 157-8 Dầu hạt Vilasinin triacetate C32H42O8 554 228 Dầu hạt 1-Tygloxyl-3-acetyl C33H46O8 570 - Hạt C33H46O8 570 242-3 Hạt Limbocinin C35H42O11 638 - Hạt Limbocidin C35H42O13 670 - Hạt Ohchinolide C35H44O10 624 211-2 Nhân hạt Salanin C34H44O9 596 168 Dầu hạt 3-Desacetyl salanin C32H42O8 554 214-5 Salannol C32H44O8 556 208 Dầu hạt 2,3-Dehydro-salanin C32H42O8 554 - Dầu hạt Salanol acetate C34H36O9 598 - Hạt Vepinin 3-Acetyl-7-tigloxylVepenin lactone Các hợp chất nhóm salanin Hạt Các hợp chất nhóm C-secomeliacin nimbin Nimbin C30H36O9 540 205 Dầu hạt 6-Desacetyl nimbin C28H34O8 498 208 Dầu hạt Nimbanal C29H34O8 510 195-7 - 6-Desacetyl nimbanal C27H32O7 468 - - Nimbinol C29H36O8 512 - - - - Lá 245-7 Lá Dihyro nimbic acid - Nimbolie C27H30O7 466 28-Deoxonimbolide C27H32O6 452 170 Lá Nimbinene C28H34O7 482 134 Hạt 6- Desacetyl nimbinene C26H32O6 440 141 Dầu hạt Nimbandiol C26H32O7 456 121 - 6-0-acetyl nimbandiol C28H43O8 498 178 - 12 Các hợp chất C-secomeliacin với chuỗi bên γ-hydroxybutenolide Salnanolide C34H44O11 628 >320 Salannolactam-I C34H45O9 611,31 213 Salannolactam-II C34H45O9 611,31 Hạt Nhân hạt Nhân hạt Các hoạt chất thuộc nhóm Azadirachtin và các đồng phân Azadirachtin A C35H44O16 720 165 - 3-Desacetyl-3-cinnamoyl C42H48O16 808 - - Azadirachtin B C33H42O14 662 204-6 - Azadirachtin D C34H44O14 676 - - Azadirachtin E C30H38O15 638 248 - Azadirachtin H C33H42O14 662 200 - Azadirachtin I C32H42O12 618 - Vepaol C36H48O17 762 - Isovepaol C48H36O17 762 - Azadirachtin F C33H44O14 664 - - 1,3-Deacetyl-11,19-deoxa- C31H40O13 620 - - Azadirachtin G C33H42O14 662 - - Azadirachtin K C34H40O15 688 220 - 11-Methoxy-azadirachtin C36H46O16 734 - - azadirachtin 11-oxo-meliaccarpin Theo nghiên cứu của Sundaram (1996) hàm lƣợng các hợp chất limonoid trong cây Neem chứa nhiều nhất trong nhân hạt kế đến lá, vỏ cây, rễ cây và thân cây đƣợc thể hiện trong bảng 2.2. Bảng 2.2 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân, cành, lá, rễ và thân cây Neem Bộ phận từ cây Neem Độ ẩm (% m/m) Hàm lƣợng Azadirachtin (mg/ 100g tính luôn ẩm độ) Nhân hạt 25 24,8 13 Vỏ cây 17 0,42 Lá 35 0,59 Rễ 15 0,24 Thân cây 20 0,15 Ngoài ra theo nghiên cứu thì hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân hạt nem ở các nƣớc khác nhau thì khác nhau do có sự khác biệt về khí hậu và thổ nhƣỡng. Hàm lƣợng Azadirachtin trung bình trong nhân hạt Neem khoảng 3,5 – 5 mg/g. Hàm lƣợng azadirachtin trong cây Neem trồng ở Myanmar thì cho hàm lƣợng azadirachitin cao nhất 6,10 ± 0,70 mg/g và thấp nhất là tại Mali với hàm lƣợng 2,05 mg/g. Theo Bảng 2.3 Bảng 2.3 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân hạt nem ở các nƣớc Quốc gia Hàm lƣợng Azadirachtin (mg/g ± SE) Cộng hòa Dominica 3,43 ±0,74 Haiti 3,05 ±0,59 Mali 2,05 Senegal 3.03 ±0,63 Nigeria 3,4 ±0,67 Ấn độ 5,14±1,8 Sri Lanka 3,40±0,34 Myanmar 6,10±0,70 Thái Lan 5,20±1,10 Úc 4,90 Các hợp chất limonoid chính trong lá Neem gồm Nimbin, Nimbidin, Nimbidol, sodium nimbinate, geduin, và các hợp chất limonoid chính trong lá Neem khô tại tỉnh Ninh Thuận gồm azadirachtolid A, azadirachtolid B, 6-Desacetylnimbin và azadirachtolid [3] và các hợp chất limonoid chính trong nhân hạt Neem là Nimbin, 6-Desacetylnimbin, Salanin và Azadirachtin [3]. 14 O C H3CO O 12 11 19 20 30 13 1 2 9 8 10 3 28 H 5 4 H3CO C H 6 O 29 O 11 19 1 2 3 32 C 31 C 12 20 30 13 4 28 CH3 H3CO C 9 8 10 H 5 6 H OH 29 O O Nimbin H O O H H 6-Desacetylnimbin C OCH3 1' 2' 12 O 19 C O 2 3 6' CH3 C O O 29 1 10 4 9 8 5 28 6 15 7 O 23 3' O 20 17 14 4' 22 18 13 11 30 3' 21 16 22 5' O 17 15 7 23 22 18 14 16 H O H H3CO O 21 H 15 7 O 17 14 O 23 22 18 2' 4' 5' 21 1 16 6' CH3 H C O 33 2 3 Salanin 10 5 4 31 C O OO H3C O 23 O CH3 HO 21 20 O O H 18 O 12 O H 1' 17 C O O 19 11 13 16 O H 15 14 9 30 H 6 8 OH H 7 OH O Azadirachtin Hình 2.6 Các hoạt chất chính trong lá và hạt Neem 2.2. Các phƣơng pháp trích ly limonoid từ hạt Neem 2.2.1 Phƣơng pháp sử dụng dung môi Để trích ly limonoid trong hạt Neem, hạt Neem phải đƣợc thu hoạch và bảo quản theo đúng quy trình, độ ẩm khoảng 13%. Hạt đem đi tách nhân, ép đƣợc dầu từ nhân hạt Neem và bã ép. Dầu ép đƣợc và bã ép làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình trích ly limonoid theo quy trình sơ đồ 2.1.