Tài liệu Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y - sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN VẬT LÝ PHẠM MINH TÂN CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN VẬT LÝ PHẠM MINH TÂN CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH CHUYÊN NGÀNH: VẬT LÝ CHẤT RẮN MÃ SỐ: 62 44 01 04 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN HỒNG NHUNG 2. PGS.TS. TỐNG KIM THUẦN HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần, những người thầy luôn tận tụy hết lòng hướng dẫn tôi, tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu ở Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Hồng Nhung đã luôn giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần, tạo mọi điều kiện cho tôi có cơ hội học tập, trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu ở trong và ngoài nước. Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. Nghiêm Thị Hà Liên, TS. Vũ Thị Thùy Dương, CN. Trần Anh Đức, ThS. Nguyễn Thị Vân, ThS. Trần Thu Trang, ThS. Nguyễn Thị Thùy, PGS.TS. Đỗ Quang Hòa, TS. Vũ Dương, TS. Phạm Long và các bạn đồng nghiệp trong nhóm NanoBiophotonics đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm và các trao đổi khoa học trong suốt quãng thời gian tôi học tập, nghiên cứu ở Viện. Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình. Tôi xin cảm ơn NCS. Nguyễn Đình Hoàng, ThS. Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo quang học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Trần Thanh Thủy, ThS. Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tôi trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo và bạn đồng nghiệp trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn các thầy cô và bạn đồng nghiệp trong Phòng Đào tạo, các thầy cô, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên Khoa Vật lý và Công nghệ, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện về thời gian, vật chất và động viên tôi để tôi có thể hoàn thành được luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô, chú, anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Điện tử học Lượng tử, Viện Vật lý. Cuối cùng, tôi xin dành những lời cảm ơn sâu nặng nhất đến những người thân thương trong gia đình tôi: Bố, mẹ, vợ, con, các anh chị em và các cháu đã dành cho tôi những tình cảm, động viên, chia sẻ cho tôi rất nhiều trong những năm tháng làm việc vất vả này. Phạm Minh Tân LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần. Các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Phạm Minh Tân Luận án được hoàn thành bởi kinh phí của đề tài NAFOSTED Mã số: 103.06.101.09 Và đề tài cấp Nhà nước Mã số: 01/2/2011/HĐ-NCCBUD MỤC LỤC Tiêu đề Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN………………………..…… i DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………....……iii DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ………………………………….....…v MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN .................................. 10 1.1. Chất màu hữu cơ .............................................................................................. 10 1.1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 10 1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học ............................ 11 1.1.3. Quang phổ của chất màu .............................................................................. 13 1.1.4. Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ ........................................... 15 1.1.5. Hiện tượng dập tắt vì nồng độ ...................................................................... 16 1.1.6. Ảnh hưởng của môi trường .......................................................................... 17 1.1.6.1. Ảnh hưởng của dung môi........................................................................... 17 1.1.6.2. Sự kết tụ các phân tử màu ......................................................................... 18 1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ....................................................... 18 1.2.1. Các hạt nano silica và latex .......................................................................... 18 1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil .......................................................................... 19 1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ........................ 20 1.2.3.1. Phương pháp Stober ............................................................................ 20 1.2.3.2. Các phương pháp micelle .................................................................... 21 1.2.4. Các đặc trưng hóa lý ............................................................................... 22 1.2.4.1. Vật liệu nền .......................................................................................... 22 1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang ..................................................................... 23 1.2.4.3. Thế Zeta................................................................................................ 24 1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh ......................................................................... 26 1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh ............................................ 1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học .......................... 26 27 1.2.6. Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học.......................................... 31 1.2.6.1. Phép thử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays) ........... 31 1.2.6.2. Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học ................................. 31 1.1.6.3. Đầu dò DNA siêu nhạy .............................................................................. 32 1.1.6.4. Phân tích đa kênh ...................................................................................... 32 1.1.6.5. Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm................................. 33 1.1.6.6. Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer) ..................................................... 34 1.2.6.7. Vận chuyển thuốc ...................................................................................... 35 1.3. Các đối tượng sinh học .................................................................................... 36 1.3.1. Protein ........................................................................................................... 36 1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) ........................................ 36 1.3.3. Strepavidin (SA) ........................................................................................... 37 1.3.4. Kháng thể ...................................................................................................... 37 1.3.5. Kháng nguyên ............................................................................................... 38 1.3.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 39 1.3.7. Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể) ............ 39 1.3.7.1. Khái niệm................................................................................................... 39 1.3.7.2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể .............................................. 39 1.4. Kết luận chương 1 ........................................................................................... 40 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.............................................................................. 41 2.1. Các thí nghiệm chế tạo .................................................................................... 41 2.1.1. Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng 41 phương pháp micelle thuận .................................................................................... 2.1.1.1. Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB .................. 41 2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein............................................................... 46 2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý ....................................... 49 2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp 50 micelle đảo .............................................................................................................. 2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với 50 APTES ..................................................................................................................... 2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC ............................................ 51 2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp 53 Stober ...................................................................................................................... 2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng 53 xúc tác lên kích thước hạt ....................................................................................... 2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC ................................... 54 2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu .............................................. 55 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt .................................. 55 2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................................................ 56 2.2.1.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................................................. 56 2.2.2. Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) 56 xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta ........................ 2.2.3. Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation 57 Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán ....................... 2.2.4. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học ................ 59 2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý ......................................... 63 2.2.5.1. Phương pháp phổ hấp thụ ......................................................................... 63 2.2.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang................................................................. 64 2.2.5.3. Hiệu suất lượng tử ..................................................................................... 65 2.2.5.4. Thời gian sống phát quang ........................................................................ 67 2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học .......................... 68 2.2.6.1. Kính hiển vi quang học .............................................................................. 68 2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy ......................................................... 70 2.3. Kết luận chương 2 ........................................................................................... 71 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ........ 73 3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề 73 mặt theo phương pháp micelle thuận ..................................................................... 3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt ............................................................................ 73 3.1.2. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 74 3.1.3. Đường kính thủy động học ........................................................................... 77 3.1.4. Các đặc trưng quang học .............................................................................. 80 3.1.4.1. Hấp thụ và huỳnh quang............................................................................ 80 3.1.4.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang ..................................... 81 3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương 85 pháp micelle thuận .................................................................................................. 3.2.1. Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ) .................................................. 86 3.2.2. Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano ........................ 88 3.2.2.1. Tính chất quang ......................................................................................... 88 3.2.2.2. Độ phân cực huỳnh quang ......................................................................... 92 3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp 93 FCS ......................................................................................................................... 3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) ...... 95 3.3.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 95 3.3.2. Tính chất quang ............................................................................................ 96 3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA) ............................ 98 3.4.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 98 3.4.2. Tính chất quang ............................................................................................ 98 3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước .................................................................... 98 3.4.2.2. Phổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS ......................... 99 3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo ...................... 100 3.5.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với 100 APTES .................................................................................................................... 3.5.2. Tính chất quang ............................................................................................ 102 3.6. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober .............................. 104 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt........................... 104 3.6.2. Tính chất quang ............................................................................................ 105 3.6.3. Chức năng hóa .............................................................................................. 107 3.6.3.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH2 ........................... 107 3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt ................................................ 108 3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH.......................... 110 3.7. Kết luận chương 3 ........................................................................................... 112 CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU 114 SINH HỌC ............................................................................................................. 4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh .................. 114 4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn 114 dịch huỳnh quang.................................................................................................... 4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 .......... 114 4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli 114 O157 :H7 ................................................................................................................ 4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào ......................................................................................... 114 4.1.1.4. Xây dựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn ... 115 4.1.2. Phát hiện tế bào ung thư vú .......................................................................... 115 4.1.2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ...................................................................... 115 4.1.2.2. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể HER2 115 (SiO2RB@HER2) .................................................................................................... 4.1.2.3. Nuôi cấy tế bào .......................................................................................... 115 4.1.2.4. Sử dụng phức hệ SiO2RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4 116 4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy ................................................... 116 4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474 ............................................................. 116 4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể HER2 116 (SiO2FITC@HER2) ................................................................................................ 2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO2FITC@HER2 ....................... 116 4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch 117 huỳnh quang ........................................................................................................... 4.2.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang ..................................................... 117 4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi 119 khuẩn E. coli O157:H7 ........................................................................................... 4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú ............................................................................ 121 4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang ........................ 121 4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào ............... 124 4.4. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC ........... 127 4.5. Kết luận chương 4 ........................................................................................... 127 KẾT LUẬN ............................................................................................................ 129 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN 131 ÁN .......................................................................................................................... TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 133 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN Ký hiệu Giải nghĩa φ Kích thước hạt (đường kính) τ Thời gian sống huỳnh quang ∆λHQ Độ bán rộng phổ huỳnh quang ∆λHT Độ bán rộng phổ hấp thụ λHQ Đỉnh phổ huỳnh quang λHT Đỉnh phổ hấp thụ APTES Aminopropyltriethoxysilane AOT Aerosol-OT BSA Bovine serum albumin C Nồng độ (mol/l) COOH Nhóm carboxyl CTMES Chlorotrimethylsilane DLS Dynamic Light Scattering DMSO Dimethyl Sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid DTOH Dập tắt OH E. coli Escherichia coli EDC Ethylene dichloride FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy FITC Fluorescein Isothiocyanate HĐBM Hoạt động bề mặt HSLT Hiệu suất lượng tử IHQ Cường độ huỳnh quang IHT Cường độ hấp thụ KT Kháng thể LSCM Laser Scanning Confocal Microscope MES axit 2-(N-morpholino)etansulfonic MTEOS Methyl triethosyxilane NP Nano particles – các hạt nano NH2 Nhóm amine OH Nhóm hydroxyl Ormosil Organically modifiled silicate PEG polyethylene glycol PdI Polydispertion Index PDT Photodynamic Therapy Precursor Tiền chất PTTMEOS 3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol Q Hiệu suất lượng tử R Bán kính R6G Rhodamine 6G RB Rhodamine B SA Streptavidin SEM Scanning Electron Microscope SH Nhóm thiol SiFITC Hạt nano silica chứa FITC SiRB Hạt nano silica chứa RB TCSPC Time-correlated single photon counting TEM Transmission electron microscopy TEOS Tetraethyl orthosilicate TGSPQ Thời gian sống phát quang DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Độ ổn định của huyền phù theo thế Zeta .......................................... 25 Bảng 2.1. Thí nghiệm xác định lượng BSA đủ để bọc hạt ................................ 47 Bảng 2.2. Dãy mẫu thay đổi nhóm chức năng ......... ........................................ 49 Bảng 2.3. Dãy mẫu thay đổi kích thước hạt ...................................................... 49 Bảng 2.4. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp micelle đảo ................................................................................................ 52 Bảng 2.5. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp Stober với lượng NH4OH thay đổi............................................................ 54 Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt nano silica với các nhóm chức khác nhau ......................................................... 79 Bảng 3.2. Các thông số về kích thước theo các phương pháp đo khác nhau .... 83 Bảng 3.3. Các thông số của các mẫu hạt nano silica kích thước khác nhau .... 87 Bảng 3.4. Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt nano silica với kích thước khác nhau ................................................................ 91 Bảng 3.5. Độ phân cực huỳnh quang của RB trong nước, trong ethanol và các 93 hạt nano kích thước khác nhau.......................................................................... Bảng 3.6. Tổng hợp kích thước và hệ số khuếch tán của hạt đo bằng các phương pháp khác nhau .................................................................................... 95 Bảng 3.7. Kết quả đo DLS của các mẫu với hợp chất FITC@APTES với lượng ethanol pha loãng khác nhau .................................................................. 101 Bảng 3.8. Kết quả đo DLS và TEM của các mẫu hạt nano silica chứa FITC với các kích thước khác nhau chế tạo bằng phương pháp Stober..................... 105 Bảng 3.9. Các thông số của phổ hấp thụ và huỳnh quang................................ 107 Bảng 3.10. Kết quả đo DLS và thế Zeta của các hạt nano silica có nhóm chức NH2 được chế tạo bằng phương pháp Stober .................................................... 108 Bảng 3.11. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm chức NH2 ............................................................................................................ 108 Bảng 3.12. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica được dập tắt nhóm OH trên bề mặt ........................................................................................ 109 Bảng 3.13. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm chức COOH ....................................................................................................... 111 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc phân tử màu RB và R6G .................................................... 10 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của chất màu FITC .............................................. 11 Hình 1.3. Cấu trúc mức năng lượng và chuyển dời quang học của phân tử màu .................................................................................................................... 12 Hình 1.4. Phổ hấp thụ và huỳnh quang của RB................................................ 13 Hình 1.5. Sự phụ thuộc của hiệu suất huỳnh quang vào nồng độ .................... 16 Hình 1.6. Các cách phổ biến kết hợp tâm màu vào các hạt nano silica và latex 19 Hình 1.7. Sự phát xạ huỳnh quang của các hạt nano silica chứa các loại tâm màu khác nhau ................................................................................................... 19 Hình 1.8. Các hệ micelle: Hệ micelle thuận (a) và Hệ micelle đảo (b) ........... 21 Hình 1.9. Ảnh SEM của các mẫu hạt silica đơn phân tán với các kích thước khác nhau ........................................................................................................... 22 Hình 1.10. Tính chất của RuBpy pha trong hạt nano silica ............................. 24 Hình 1.11. Biểu diễn thế Zeta của một hạt ....................................................... 25 Hình 1.12. Các cách thường tiếp hợp phân tử sinh học với hạt nano .............. 28 Hình 1.13. Các cách gắn kết đồng hóa trị thông thường giữa phân tử sinh học và hạt nano.................................................................................................. 29 Hình 1.14. Mô tả cách gắn kết đặc hiệu của hạt nano silica với vi khuẩn lao Mycobacterium .................................................................................................. 29 Hình 1.15. Hình ảnh các vi khuẩn E. coli ......................................................... 31 Hình 1.16. Mô tả thí nghiệm đánh dấu DNA xem kẽ dựa vào gắn kết sinh học với hạt nano silica ............................................................................................. 32 Hình 1.17. Giản đồ phân tích đa kênh bằng hạt nano silica chứa hai loại tâm màu với tỷ lệ nồng độ hai tâm màu khác nhau .................................................. 33 Hình 1.18. Nguyên tắc hoạt động của máy đếm dòng tế bào (flow cytometry) 35 Hình 1.19. Cấu trúc của một phân tử kháng thể............................................... 38 Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của các chất precursor và hoạt động bề mặt ....... 42 Hình 2.2. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu RB có các nhóm chức NH2, NH2+OH ................................................................................................... 43 Hình 2.3. Sơ đồ phản ứng loại bỏ nhóm OH trên bề mặt hạt NH2+OH .......... 44 Hình 2.4. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica có các nhóm chức –OH và –SH ........ 44 Hình 2.5. Phương trình phản ứng tạo nhóm –SH trên bề mặt hạt nano .......... 45 Hình 2.6. Cấu trúc phân tử SH – PEG – COOH .............................................. 45 Hình 2.7. Sơ đồ minh họa quá trình bọc BSA lên hạt nano silica .................... 46 Hình 2.8. Phương trình phản ứng tạo liên kết amide ....................................... 48 Hình 2.9. Mô hình quá trình bọc SA bằng cách trực tiếp (a) và gián tiếp (b) . 48 Hình 2.10. Cấu trúc hóa học của TEOS (a), FITC (b) ..................................... 50 Hình 2.11. Phản ứng giữa FITC và APTES ..................................................... 51 Hình 2.12. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp micelle đảo ......................................................................................................... 52 Hình 2.13. Phản ứng đồng trùng hợp của FITC@APTES với TEOS để tạo liên kết hóa trị của chất màu trong hạt silica.................................................... 52 Hình 2.14. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp Stober ................................................................................................................. 53 Hình 2.15. Phản ứng tạo nhóm chức NH2 trên bề mặt hạt nano ...................... 54 Hình 2.16. Cấu trúc hóa học của Disodium 3- [dihydroxy(oxido)silyl]propanoate (a) và phản ứng tạo nhóm chức COOH trên bề mặt hạt nano (b) .................................................................................... 55 Hình 2.17. Các trạng thái năng lượng của phân tử hai nguyên tử.................... 59 Hình 2.18. Phổ hấp thụ của RB và R6G ........................................................... 65 Hình 2.19. Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian .................................................................................................................... 68 Hình 2.20. Sơ đồ nguyên lý hệ đếm Flow cell.................................................... 71 Hình 3.1. Ảnh TEM của hạt nano SiO2-NH2&OH (a), SiO2-NH2 (b), SiO2COOH (c), SiO2-OH (d) và SiO2-SH (e)……………………………………………. 74 Hình 3.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-NH2&OH..................... 74 Hình 3.3. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-NH2............................... 75 Hình 3.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của HS-PEG-COOH……………………... 76 Hình 3.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-COOH........................... 76 Hình 3.6. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO2-OH……………… 77 Hình 3.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO2-SH……………… 77 Hình 3.8. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica với các nhóm chức khác nhau............................................................................ 80 Hình 3.9. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica với các nhóm chức khác nhau.......................................................... 80 Hình 3.10. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và Γr/Γnr (b)………………………………………………………………………………………… 82 Hình 3.11. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có nhóm chức khác nhau……………………………………………………………………………………… 84 Hình 3.12. Phân bố kích thước hạt theo cường độ của phương pháp DLS: SiO2-NH2&OH (a), SiO2-NH2 (b), SiO2-COOH (c), SiO2-SH (d)……………….. 85 Hình 3.13. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica với các kích thước khác nhau............................................................................ 88 Hình 3.14. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica với các kích thước khác nhau.......................................................... 88 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nền silica lên cường độ huỳnh quang và HSLT các mẫu...................................................................................................................... 90 Hình 3.16. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và Γr/Γnr (b)……………………………………………………………………………………….. 92 Hình 3.17. Cường độ huỳnh quang theo các hướng của chất màu RB trong nước (a), dung môi ethanol (b) và trong các hạt nano kích thước khác nhau (c, d, e, f)……………………………………………………………………………….. 92 Hình 3.18. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có kích thước khác nhau……………………………………………………………………………………… 94 Hình 3.19. Kích thước các mẫu theo các phương pháp đo khác nhau…………. 95 Hình 3.20. a) Ảnh SEM của các hạt nano silica SiOH2-OH trước khi bọc BSA 96 b) Ảnh TEM của các hạt nano silica SiOH2-OH sau khi bọc BSA…. Hình 3.21. a) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong nước b) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong PBS………….. 96 Hình 3.22. a) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong nước b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong PBS…… 97 Hình 3.23. a) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong nước b) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong PBS Hình 3.24. Ảnh SEM của SiO2-OH@SA@BSA.................................................. 97 98 Hình 3.25. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của SiO2-OH bọc SA trong nước…………………………………………………………………….. 99 Hình 3.26. a) Phổ huỳnh quang của SiO2-OH bọc SA trong PBS b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO2-OH bọc SA trong PBS… 99 Hình 3.27. Phổ hấp thụ (a), hấp thụ chuẩn hóa (b) của chất màu FITC tự do và FITC@APTES. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ của FITC@APTES vào lượng ethanol (c)………………………………………………………………………………. 101 Hình 3.28. Ảnh TEM của các hạt nano SiO2@FITC với FITC@APTES pha trong môi trường ethanol bão hòa (a) và pha loãng 10 lần (b)………………… 102 Hình 3.29. Phổ hấp thụ chuẩn hóa của phân tử FITC tự do, hợp chất FITC@APTES trong ethanol và FITC trong các hạt nano silica………………. 103 Hình 3.30. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và trong các hạt nano silica……………………………………………………………… 103 Hình 3.31. Phổ huỳnh quang của hợp chất FITC@APTES với lượng ethanol khác nhau………………………………………………………………………………. 103 Hình 3.32. Ảnh TEM của các hạt nano SiO2@FITC theo phương pháp Stober................................................................................................................... 104 Hình 3.33. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của hợp chất FITC@APTES trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau……………………………………………………………………………….. 106 Hình 3.34. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau…………………………. 106 Hình 3.35. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu trong môi trường Tris…………………………………………………………………. 110 Hình 3.36. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu hạt nano có nhóm chức năng COOH với lượng DDOS khác nhau……………... 112 Hình 4.1. Hình ảnh các tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7……………………….. 118 Hình 4.2. Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn đánh dấu bằng hạt nano silica pha RB với các nồng độ vi khuẩn khác nhau……………………………….. 119 Hình 4.3. a) Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 với nồng độ khác nhau đánh dấu bằng hạt nano silica chứa tâm màu RB b) Đường cường độ huỳnh quang theo số lượng vi khuẩn (đường màu đỏ) và đường fit (màu xanh, Y = 0,008.X)………………………………………………….. 120 Hình 4.4. So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp đếm khuẩn lạc (trái) và phương pháp phổ huỳnh quang (phải)………………………. 121 Hình 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiRB@HER2 (A) và với SiRB@BSA B).................................................................................... 122 Hình 4.6. Ảnh huỳnh quang tế bào HeLa sống ủ với phức hệ SiRB@HER2 (A) và với SiRB@BSA (B)......................................................................................... 122 Hình 4.7. Ảnh huỳnh quang tế bào KLP4 cố định ủ với phức hệ SiRB@HER. 123 Hình 4.8. Ảnh huỳnh quang kết hợp tế bào KPL4 và Hela cố định ủ với phức hệ SiRB@HER2, nhuộm kháng thể 2-M488………………………………............. 123 Hình 4.9. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ với phức hệ SiRB@HER2 ở 4 khoảng thời gian khác nhau………………………………………………………….. 124 Hình 4.10. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1………………………………….. 125 Hình 4.11. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1………………………………….. 125