Tài liệu Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật lc msms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LUYẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LUYẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Nguyễn Tường Vy 2. Ths. NCS Cao Công Khánh HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ về mọi mặt từ các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Nguyễn Tường Vy – Phó Trưởng Phòng SĐH- ĐH Dược Hà Nội Th.S NCS Cao Công Khánh – Viện KN ATVSTPQG đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này. Đồng thời tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Kiểm Nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã luôn sẵn lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2014 Tác giả Bùi Thị Luyến MỤC LỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Đặt vấn đề ..................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN...........................................................................................1 1.1. Vài nét về Quinolon.............................................................................................3 1.1.1. Cấu tạo chung.....................................................................................................3 1.1.2. Phân loại ............................................................................................................3 1.1.3. Cơ chế tác dụng..................................................................................................3 1.1.4. Tác dụng phụ ................................................................................................... 3 1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu ................................................................4 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký ...............................................................................................................................5 1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ............................................12 1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ................................................12 1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước ..................13 1.3.3. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước...................14 1.3.4. Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm .........................16 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài .......................................................................20 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất................................................................................20 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ...............................................................................................20 2.2.2. Thuốc thử, hóa chất ..........................................................................................20 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .............................................................20 2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện LC-MS/MS ..............................................................20 2.3.2. Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu ...................................................22 2.3.3. Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng..........................................................24 2.3.4. Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá ............................................24 2.4. Tính toán kết quả, xử lí số liệu .........................................................................25 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS ..................................27 3.1.1. Xác định các thông số của detector khối phổ (MS ............................................27 3.1.2. Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon ...............28 3.2. Xác định kỹ thuật xử lý mẫu.............................................................................29 3.2.1. Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu .................................29 3.2.2. Quy trình làm sạch và làm giàu mẫu qua SPE...................................................31 3.2.3. Quy trình xử lí mẫu được lựa chọn ...................................................................33 3.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng .............................................................34 3.3.1. Tính thích hợp của hệ thống ............................................................................34 3.3.2. Độ đặc hiệu/độ chọn lọc ..................................................................................35 3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .................................................................35 3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................................39 3.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp.........................................................39 3.4. Phân tích trên mẫu thực nghiệm ......................................................................44 Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật ............................................................................46 4.1.1. Các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS............................................46 4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu .........................................................................................47 4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng...................................................................47 Kết luận ...................................................................................................................50 Kiến nghị .................................................................................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt HPLC Tiếng Anh High Performance Liquid Tiếng Việt Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography LC-MS/MS Liquid Chromatograph Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối Tandem Mass Spectrometer phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng SPE CE Solid phase extraction Capillary electrophoresis Chiết pha rắn ESI Electrospray ionization EU European Union Điện di mao quản Ion hóa phun điện tử Liên minh Châu Âu Atmospheric pressure chemical APCI AOAC IS ion hoá hoá học áp suất khí ionization quyển Association of Official Analytical. Hiệp hội các nhà hoá phân tích Chemists Internal Standard Nội chuẩn Mẫu PT Mẫu phân tích TL Thịt lợn TG Thịt gà C01 Cá 01 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Ppb Part per billion Phần tỷ Ppm Part per million Phần triệu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu……………………………………………………….…………...…15 Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản..………………………………...…………………………………...….………….16 Bảng 3.1. Thông số chung của detector khối phổ…………...........................………..27 Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon………………………...…………………27 Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry……………….…...……….28 Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột Xbridge………...……………….....…..28 Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin……....29 Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin….....30 Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin......…30 Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin.…...….30 Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin………......……….31 Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Ciprofloxacin……...….……..32 Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Enrofloxacin………...………32 Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Flumequin..…………...……..33 Bảng 3.13. Kết quả phân tích tính thích hợp của hệ thống………..…………………..34 Bảng 3.14: Kết quả phân tích dãy chuẩn Norfloxacin………………….……………..36 Bảng 3.15: Kết quả phân tích dãy chuẩn Ciprofloxacin………………...……………37 Bảng 3.16: Kết quả phân tích dãy chuẩn Enrofloxacin………..…………………...…37 Bảng 3.17: Kết quả phân tích dãy chuẩn Flumequin…………………………….……38 Bảng 3.18: LOD và LOQ của các chất phân tích tính trên nền mẫu thịt………...……39 Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Norfloxacin………..……40 Bảng 3.20: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Ciprofloxacin……..…….40 Bảng 3.21: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Enrofloxacin………...….41 Bảng 3.22: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Flumequin..……….…….41 Bảng 3.23: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18 của Norfloxacin…….………..42 Bảng 3.24: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Ciprofloxacin…………42 Bảng 3.25: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Enrofloxacin…….…….41 Bảng 3.26: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Flumequin.……..…….41 Bảng 3.27 : Kết quả phân tích 20 mẫu thịt gà (đơn vị là µg/kg)……...…………..…44 Bảng 3.28: Kết quả phân tích 20 mẫu thịt lợn (đơn vị là µg/kg)………………..….....44 Bảng 3.29: Kết quả phân tích 20 mẫu cá nước ngọt (đơn vị là µg/kg)…………….....44 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon ..………………………………… …….3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin ………………..……………………...4 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ……….………….…….……..……….5 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin ….……………………………………..5 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin …….……………………………………5 Hình 3.1: Sắc ký đồ thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích norfloxacin……..29 Hình 3.2: Sắc ký đồ thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin…………………32 Hình 3.3: Sắc ký đồ khi phân tích tính thích hợp của hệ thống………………..….35 Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn của Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phải)……….36 Hình 3.5: Sắc ký đồ khi xây dựng đường chuẩn của norfloxacin…………………….37 Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn của Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phải)…..……..38 Hình 3.7: sắc ký đồ của norfloxacin khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB …………….....40 Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu thực tế có (hoặc không có) norfloxacin………………..45 ĐẶT VẤN ĐỀ An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức khoẻ con người. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ. Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên, do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường xuất nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới và sức khỏe người tiêu dùng. Quinolon có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi để chữa bệnh cho người, gia cầm và thủy sản trong công nghiệp. Trong quá trình nuôi dưỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lượng Quinolon còn lại trong thịt gia cầm hay thủy sản. Điều này sẽ gây rất nhiều mối nguy hiểm. Đặc biệt là gây ra hiện tượng kháng thuốc của một số vi khuẩn như: Salmonella, Campylobacter spp, Escherichia coli,... Hậu quả là giảm hiệu quả của Quinolon đối với các chủng vi khuẩn trên, gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho con người. Để bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng, ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong nguồn thực phẩm khi cung cấp cho con người vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định hướng của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EC in 1996” [23] , trong đó quy định rõ hàm lượng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại thuốc, ví dụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Mỹ, Hoa kỳ và các nước Bắc Mỹ đã 1 cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon. Bộ Thủy sản đã ra quyết định số 07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy định danh mục 17 loại kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Quinolon [10] và Quyết định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trường Bắc Mỹ và Hoa Kỳ [11]. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC-MS/MS”, với 2 mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin , flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC-MS/MS. 2. Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một số loại thực phẩm (Thịt, cá) trên thị trường Hà Nội. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về Quinolon [5] 1.1.1. Cấu tạo chung Đôi khi ở vị trí 8 là N. Vậy đa số chúng là dẫn chất của acid 1,4-dihydro-4oxo-quinolein-3-carboxylic. O COOH R1 4 5 3 6 7 1 8 2 N R2 R Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon 1.1.2. Phân loại - Quinolon thế hệ I: Gồm các chất không gắn F (trừ flumequin), hiện nay hầu như chỉ dùng acid nalidixic. - Quinolon thế hệ II: Được dùng từ năm 1985, gồm các chất có gắn F (ít nhất là ở vị trí 6) hay các fluoroquinolon có phổ rộng trên cả vi khuẩn gram (-) và gram (+), với hoạt tính mạnh: + Tác dụng trên cả vi khuẩn gram (-) đã kháng acid nalidixic, trực khuẩn mủ xanh, nhiều vi khuẩn gram (-) khó trị khác. + Trên các vi khuẩn gram (+) thì đặc biệt là tụ cầu vàng, S.epidermitis đã kháng gentamycin, liên cầu, cầu khuẩn ruột (Enterococus) và các vi khuẩn kỵ khí. + Trên các vi khuẩn phát triển trong tế bào, và một số loại vi khuẩn đặc biệt nguy hiểm (như Legionella, Chlamydia, Ureoplasma, Mycoplasma, các vi khuẩn kháng alcol...) 1.1.3. Cơ chế tác dụng Theo một hoặc hai cơ chế sau và đều cho tác dụng diệt khuẩn: - Ức chế ADN-gyrase, là enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid nhân. - Tạo phức với kim loại hóa trị hai của các protein chứa các kim loại này, đồng thời phức đó ion hóa thành ion phức có hoạt tính cao với các enzym chuyển hóa 1.1.4. Tác dụng phụ Tác dụng phụ của thuốc chủ yếu là lên dạ dày - ruột, thần kinh trung ương và da. - Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hoá 3 - Da: Nổi ban, ngứa, viêm tĩnh mạch nông. - Cơ xương: Ðau ở các khớp, sưng khớp. Ðau cơ, viêm gân (gân gót) và mô bao quanh. Có một vài trường hợp bị đứt gân, đặc biệt là ở người cao tuổi khi dùng phối hợp với corticosteroid. - Thần kinh trung ương: Cơn co giật, lú lẫn, rối loạn tâm thần, hoang tưởng, mất ngủ, trầm cảm, loạn cảm ngoại vi, rối loạn thị giác kể cả ảo giác, rối loạn thính giác, ù tai, rối loạn vị giác và khứu giác, tăng áp lực nội sọ. - Da: Hội chứng da - niêm mạc, viêm mạch, hội chứng Lyell, ban đỏ da thành nốt, ban đỏ đa dạng tiết dịch. - Gan: Ðã có báo cáo về một vài trường hợp bị hoại tử tế bào gan, viêm gan, vàng da ứ mật. - Tiết niệu - sinh dục: Có tinh thể niệu khi nước tiểu kiềm tính, đái ra máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ. - Khác: Nhạy cảm với ánh sáng khi phơi nắng, phù thanh quản hoặc phù phổi, khó thở, co thắt phế quản. 1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu Ciprofloxacin Tên gọi: 1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-3-quinolinecarboxylic acid HN Công thức hóa học: C17H18FN3 O3 N N Trọng lượng phân tử: 331.35 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 318-3200 C F COOH O Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylen chlorid. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 6.0 và 8.8 Enrofloxacin Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dương và gram âm. 4 Tên gọi: acid 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo3-quinolinecarboxylic. Công thức hóa học: C19H22FN3O3 H3C N N Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 219-2210C N F COOH O Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9 Norfloxacin Tên gọi: acid 1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4-dihydroquinolin-3-carboxylic Công thức hóa học C16H18FN3O3 Trọng lượng phân tử: 319,3 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm, nhạy cảm với ánh sáng. Rất khó tan trong nước, khó tan trong aceton và ethanol 96%. Flumequin H CH 3 Tên gọi: acid 9-Fluoro-5-methyl-1-oxo-6, N 7-dihydro-1H,5H-benzoquinolizin-2-carboxylic Công thức hóa học: C14H12FNO3 F COOH O Trọng lượng phân tử: 261,3 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin Tính chất: Bột trắng, không tan trong nước, ít tan trong methylen chlorid, rất ít tan trong methanol, dễ tan trong kiềm 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký [2], [7] Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh). Dung dịch các chất 5 phân tích khi vào cột sẽ được hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được đưa ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ. 1.2.1. Kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với phổ khối lượng (MS) Trong nhiều quá trình phân tích, các hợp chất quan tâm thường nằm trong một hỗn hợp phức tạp, và vai trò của kỹ thuật sắc ký là thiết lập sự tách các thành phần của hỗn hợp, cho phép định tính hoặc định lượng chúng. Về mặt định tính, nhược điểm chính của kỹ thuật sắc ký trong quá trình tách là không có khả năng cung cấp thông tin về định tính một cách rõ ràng cho các hợp phần mẫu, thậm chí cả trong trường hợp chúng được tách hoàn toàn khỏi nhau. Việc định tính được dựa trên cơ sở so sánh các đặc tính lưu giữ, mà đơn giản nhất là thời gian lưu của một chất chưa biết với các chất so sánh được xác định trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Tuy nhiên, trên thực tế rất nhiều trường hợp thậm chí có cùng các đặc tính lưu giữ của cấu tử chưa biết và vật liệu so sánh, trong giới hạn sai số thực nghiệm, định tính, người phân tích cũng không thể kết luận một cách tuyệt đối hai hợp chất này là giống nhau. Mặc dù các điều kiện sắc ký tương đối mở rộng cho các nhà phân tích, nhưng không phải lúc nào cũng có thể thực hiện được quá trình tách tất cả các cấu tử của một hỗn hợp mẫu và điều này có thể ảnh hưởng đến độ đúng, độ chính xác trong quá trình phân tích định lượng của các chất cần quan tâm. Khả năng của thiết bị sắc ký - khối phổ trên thực tế phụ thuộc vào phổ khối lượng của nhiều chất mà các chất này đã có đầy đủ các phổ (thư viện phổ). Điều này cho phép việc nhận dạng chúng một cách dễ dàng với độ tin cậy cao, mặc dù nhiều khi không hoàn toàn như vậy. Nếu chất phân tích nằm trong một phần của hỗn hợp 6 thì phổ khối lượng nhận được sẽ chứa các ion từ tất cả các chất có mặt. Trong trường hợp đặc biệt, nếu chất phân tích là một hỗn hợp của các thành phần lượng nhỏ thì việc nhận dạng sẽ trở nên khó khăn và dường như không thể. Sự kết hợp khả năng tách của phương pháp sắc ký cho phép các chất tinh khiết được đưa vào máy phổ khối. Khả năng nhận dạng của máy phổ khối rất rõ ràng, vì thế có thuận lợi và đặc biệt cho các chất tương tự nhau hoặc giống hệt nhau về các đặc trưng lưu, nhưng có phổ khối lượng hoàn toàn khác nhau và có thể phân biệt được các chất này. Ngoài ra, phổ khối lượng còn cho phép định lượng với độ chính xác phụ thuộc vào mức độ phức tạp của hỗn hợp mẫu và bản chất của mỗi thành phần trong hỗn hợp. Công việc này nếu chỉ riêng phép sắc ký thôi thì không thể thực hiện được. Phương pháp sắc ký - Là phương pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu. - Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lưu. - Cho phép phân tích định tính và định lượng. - Phân lập và tinh chế chất. Phương pháp phổ khối lượng - Là phương pháp nhận dạng các lượng mẫu nhỏ. - Cung cấp phổ khối lượng của các hỗn hợp phức tạp. Sự kết hợp của HPLC và phổ khối lượng vì thế cho phép nhận dạng rõ ràng và xác định số lượng của các hợp chất mà phương pháp sắc ký không phân tích đầy đủ được. 1.2.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng - khối phổ Một máy sắc ký lỏng khối phổ bao gồm 3 bộ phận chính (hình 1.1). - Thiết bị sắc ký lỏng (LC, Liquid Chromatography): thông thường sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography), hiện đại hơn là máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography) - Bộ kết nối (Interface): có nhiệm vụ loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hoá của máy phổ khối. Đây là bộ phận rất quan trọng và là chìa khoá của phương pháp LC-MS. 7 - Thiết bị phổ khối lượng (MS, Mass Spectrometry). Máy tính điều khiển và phân tích số liệu Dung môi Bơm chân không Bộ tiêm mẫu Bơm cao áp Cột sắc ký Sắc ký lỏng Bộ kết nối Nguồn ion Bộ kết nối Bộ phân tích khối Bộ phát hiện Khối phổ Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ Bộ phận kết nối (interface) ở đây đóng vai trò quan trọng vì nó là kỹ thuật chìa khoá của một máy sắc ký lỏng - khối phổ. Chức năng của bộ kết nối là loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hóa của máy khối phổ. Bộ kết nối bao gồm nhiều loại khác nhau và ra đời ở các thời điểm khác nhau như: - Bộ kết nối băng chuyền (Moving Belt Interface): 1977. - Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (DLI, Direct Liquid Introduction Interface): 1980 - Bộ kết nối phun nhiệt (Thermospray Interface): 1983 - Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA, Continuous Flow Fast Atom Bombardment Interface): 1985/1986. - Bộ kết nối ion hoá hoá học áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric-Pressure Chemical Ionization Interface): 1986. - Bộ kết nối ion hóa phun điện (ESI, Electrospray Ionization Interface): 1988. 1.2.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) Phương pháp phổ khối lượng là một trong những phương pháp phân tích công cụ quan trọng. Phổ khối lượng cung cấp các thông tin về phân tích định tính, định lượng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ và hữu cơ. a. Nguyên tắc chung của phương pháp Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà thành ion phân tử mang điện tích 8 dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử mang năng lượng cao: Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại các ion mang điện tích +2 hoặc ion âm (-). Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 ev. Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc hoặc các phân tử trung hoà nhỏ hơn: Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắnphá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Ion phân tử và các ion mảnh là các phần tử có khối lượng. Nếu gọi khối lượng của một ion là m và điện tích của nó là e thì tỷ số z=m/e được gọi là số khối. Hiển nhiên các ion có khối lượng là m, 2m, 3m… và điện tích tương ứng bằng e, 2e, 3e, … có số khối z bằng nhau. Ion phân tử có số khối ký hiệu là M+.. b. Thiết bị khối phổ Thiết bị phổ khối đầu tiên được chế tạo bởi J. Thomspon (1912) và F. W. Aston (1919). Thiết bị hoàn thiện được chế tạo năm 1932. 9 1.2.4. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí: - Làm sạch mẫu một cách chọn lọc. - Tăng nồng độ lên nhiều lần. - Lượng mẫu không cần nhiều. - Lượng dung môi cần ít. - Độ thu hồi cao, không gây nhiễu. - Đơn giản, nhanh, giá thành thấp. Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất. a. Chiết lỏng - lỏng Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết lỏng lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số. 10 KA = [Ahc ] [An ] KA: hằng số phân bố [Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ. [An]: nồng độ của chất A trong pha nước. b. Chiết pha rắn SPE Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu). Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm. Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn: Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột. Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp phụ chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp. Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu. Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút. Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích. Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút. 11