Tài liệu Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THANH QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN THUỘC HỌ ENTEROBACTERIACEAE GÂY BỆNH Ở NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THANH QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN THUỘC HỌ ENTEROBACTERIACEAE GÂY BỆNH Ở NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI Chuyên ngành Mã số : Di truyền học : 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Ngô Tất Trung TS. Đinh Nho Thái Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Ngô Tất Trung – Khoa Sinh học phân tử và TS. Đinh Nho Thái – Bộ môn Di truyền học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Hữu Song, TS. Bs. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và lãnh đạo Khoa đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày tháng năm 2015 Học viên Đào Thanh Quyên MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người .................................................................................................... 3 1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới.......................................................................................... 3 1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam 7 1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. .. 8 1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli ............................................................................... 8 1.2.2. Klebsiella pneumoniae ................................................................................... 9 1.2.3. Salmonella sp ............................................................................................... 10 1.2.4. Proteus mirabilis .......................................................................................... 12 1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece ................................. 12 1.3.Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh ........................................... 13 1.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn .................................. 13 1.3.2. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn........................... 14 1.3.2.1.Kỹ thuật PCR ............................................................................................. 14 1.3.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi) .......................................................... 16 1.3.3. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN người .............................. 17 1.3.3.1. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết .................................................................................. 17 1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi khuẩn …………………………………………………………………………….18 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 20 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 20 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................................ 21 2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm ............................................................................... 21 2.3.2. Các máy và thiết bị chính ............................................................................. 21 2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 22 2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi ............................. 23 2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu ....................... 26 2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm ....................................................... 27 2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ ...... 28 2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi....................................................................... 28 2.4.8. Giải trình tự gen .......................................................................................... 30 2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi ....................................... 31 2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê............................................ 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 34 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN ..................................................................................................... 34 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh................................................... 34 3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ ............................................ 34 3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh ......................................................... 35 3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae ................................................................................................ 36 3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella ....... 37 3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K. pneumoniae ........................................................................................................... 38 3.1.3.4. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis........... 39 3.1.3.5. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E. coli......................... 40 3.1.4. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae... 42 3.1.5.Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh ................... 43 3.1.6. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn dương ……………………………………………………………………………….44 3.1.6.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương .................. 44 3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘’LÀM GIÀU’’ ADN VI KHUẨN ........................................................................................ 47 3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau ...................................................................... 47 3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường so với phương pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩn .................................... 48 3.2.3. Kết quả realtime PCR định lượng nồng độ ADN so sánh các phương pháp tách chiết.………………………………………………………………………………..50 3.2.3.1. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp tách ADN không qua xử lý. ................................................................................... 50 3.2.3.2. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp sử dụng kit thương mại MolYsis............................................................................... 50 3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung môi phá bạch cầu ................................................................................................... 52 3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT ................................................................ 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 55 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR ............................................... 15 Hình 2. Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ưu hóa PCR đa mồi ................ 22 Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người ................ 23 Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh24 Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh ................................................................................................................ 26 Hình.6.Kết quả PCR các mồi đơn trên ADN mẫu được tách chiết từ mẫu chuẩn dương trong điều kiện PCR chuẩn ......................................................................... 35 Hình.7. Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trưng cho họ Enterobacteriaceae ............................................................................................... 36 Hình 8. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella sp ....... 37 Hình 9. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn K. pneumoniae ..... 38 Hình 10. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Proteus mirabilis 39 Hình 11. Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trưng cho vi khuẩn E. coli .... 41 Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn ..................................................................................................................... 42 Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae ............................................................................................... 43 Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh khác ....................................................................................................................... 45 Hình 15. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dương…………………………………………………………………………….46 Hình16. Kết quả realtime PCR mồi betaglobin định lượng nồng độ ADN ............. 50 Hình 17: Hiệu quả loại ADN người (thông qua tồn dư beta globin) giữa các Kit (SHPT108@dehuman ADN), Kit MolYsis ............................................................ 51 Hình.18. Kết quả PCR mồi đơn E. coli-SuidA trên ADN được xử lý bằng dung môi SHPT108@dehumanDNA..................................................................................... 52 Hình. 19. Sơ đồ so sánh kết quả PCR đa mồi và cấy máu ...................................... 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á)................................................................................................................................4 Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .................................... 21 Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 21 Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh ...................................................................................................................... 25 Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp .................................. 32 Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứu .......................... 34 Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác ..................................... 44 Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn E.coli ..................................................................................................................... 48 Bảng 9. Kết quả đo OD các ADN tách chiết từ mẫu máu có vi khuẩn sử dụng các phương pháp tách chiết .......................................................................................... 49 Bảng 10. So sánh kết quả nuôi cấy và PCR đa mồi trên mẫu nhiễm khuẩn huyết………………………………………………………………………………….. 53 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic aldA Aldehyde dehydrogenase A Bộ mồi EPKS Gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E. coli, Proteus mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella. sp bp base pair dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DTCS Dye Terminator Cycle Sequencing EBV Epstain BarrEpptabar virus HBV Hepatis B virus HSV Herpes simplex Virus kDa Kilodalton M100 Ladder marker 100 M50 Ladder Marker 50 bp MCLB1 Manmanlian cellular lysis Buffer 1 NKH Nhiễm khuẩn huyết OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Pol polymerase SD Standard Deviation Se Độ nhạy Sp Độ đặc hiệu X Giá trị trung bình ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm trùng là một bệnh lý thường gặp, trong đó nhiễm trùng đường máu (nhiễm khuẩn huyết) gây biến chứng và nguy cơ tử vong cao nhất. Có nhiều căn nguyên khác nhau gây ra bệnh lý nhiễm trùng như vi khuẩn, kí sinh trùng và nấm. Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn trong đó nhiều nhất là các loài thuộc họ Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella. sp và Staphylococcus aureus. Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn là cần thiết cho việc chỉ định đúng kháng sinh trong điều trị. Cho đến nay cấy khuẩn vẫn là phương pháp được áp dụng thường quy trong chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng. Tuy nhiên phương pháp kinh điển này đang thể hiện một số điểm yếu trong chẩn đoán, đó là i) thời gian cấy khuẩn dài (từ 18-72h). Trong khoảng thời gian này tình trạng của bệnh nhân có thể chuyển sang một pha mới nguy hiểm hơn, ii) các quy trình cấy khuẩn không được tối ưu cho nuôi cấy mọi vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn yếm khí cộng thêm việc xử lý kháng sinh phổ rộng trước đó cũng gây áp lực áp chế sự hình thành khuẩn lạc sau nuôi cấy, iii) Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết đòi hỏi một lượng máu lớn sẽ là thách thức đối với bệnh nhân nhi sơ sinh hoặc người cao tuổi. Do đó, việc triển khai những kỹ thuật chẩn đoán mới bổ trợ cho phương pháp cấy khuẩn kinh điển là điều cần làm. Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) không còn là điều mới mẻ trong sinh học phân tử, tuy nhiên ứng dụng của nó trong chẩn đoán, đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng vẫn dừng ở mức tiềm năng là vì: i)Mỗi một phản ứng PCR chỉ xác định được 01 loài vi sinh vật, trong khi đó nếu số cặp mồi quá nhiều trong một phản ứng (PCR đa mồi) chúng có thể triệt tiêu lẫn nhau làm giảm độ nhạy kỹ thuật của phản ứng. ii) Các chất ức chế vốn có trong bệnh phẩm hoặc bản thân lượng dư thừa ADN người trong bệnh phẩm cũng là những tác nhân kìm hãm phản ứng PCR; iii) Ngoài ra, do tính chất bảo tồn tiến hóa giữa các loài, một tỷ lệ nhất định các vật chất di truyền của vi khuẩn sẽ được bảo tồn và có trình tự gần giống một phần bộ gen của sinh vật bậc cao (trong đó có con 1 người) vì thế nếu đoạn mồi được thiết kế hướng vào các khu vực bảo tồn này, hiện tượng bắt chéo của mồi vào ADN gen người sẽ diễn ra gây nên dương tính giả. Để giảm thiểu các nguy cơ nói trên, trong nhiều trường hợp việc tách và loại bỏ ADN người trước khi thực hiện phản ứng PCR là cần thiết. Vì vậy trong khuôn khổ luận văn này tôi tiến hành tối ưu hóa các tham số nhằm xây dựng một quy trình PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae. Quy trình không chỉ hướng tới thiết lập phản ứng PCR đa mồi phát hiện đặc hiệu cho các vi sinh vật thuộc họ này mà còn cần thiết lập một phương pháp loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn ở mức độ chấp nhận được. Do vậy để nâng cao chất lượng chẩn đoán các mầm bệnh vi sinh gây bệnh, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi” với các mục tiêu như sau: a) Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp, Proteus mirabilis) gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi và thiết lập công nghệ loại bỏ ADN người. b) Bước đầu đánh giá giá trị của PCR đa mồi trong phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây nhiễm khuẩn huyết trong thực hành tại Bệnh viện 108. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người 1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những bệnh lý được quan tâm bởi tỷ lệ mắc bệnh, tử vong cao. Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do các vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Triệu chứng lâm sàng của NKH không đặc hiệu và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ. Các marker sinh học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đánh giá mức độ nặng của tình trạng viêm, phân biệt tác nhân là vi khuẩn, góp phần giúp thầy thuốc chẩn đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn “giờ vàng”, rút ngắn thời gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân. NKH có xu hướng gia tăng và do các nguyên nhân xác định. Trong đó, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là nguyên nhân phổ biến dẫn tới NKH hay sôc nhiễm khuẩn [30]. Nhìn chung, nhiễm trùng đường hô hấp chiếm khoảng một nửa số ca NKH. Ngoài ra, còn có các nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ổ bụng. Với các nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên quyết trong điều trị khỏi bệnh cho bệnh nhân. Nghiên cứu của Houck PM ở những bệnh nhân viêm phổi và bệnh nhân NKH chỉ ra rằng việc sử dụng kháng sinh chậm trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ dẫn tới tử vong tăng lên đáng kể. Đặc biệt với nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trễ [21]. Song song với việc sử dụng kháng sinh sớm thì việc lựa chọn kháng sinh thích hợp cũng rất quan trọng. Cùng với đó, việc điều trị kháng sinh hiện nay nếu chờ đợi dựa vào kết quả cấy máu thì quá lâu nên nhiều khi các bác sỹ lâm sàng buộc phải điều trị bệnh nhân theo kinh nghiệm tích lũy. Như vậy mặt tích cực là sử dụng kháng sinh sớm nhưng lại trở nên gặp khó khăn trong việc lựa chọn sử dụng kháng sinh thích hợp để điều trị. Do vậy, nhờ sự phát triển của nền sinh học phân tử hiện đại, 3 những kỹ thuật tiên tiến nhất để phát hiện vi khuẩn gây NKH được đề xuất đáp ứng nhu cầu chẩn đoán nhanh tác nhân vi sinh gây bệnh. Tỷ lệ NKH thay đổi theo từng quốc gia, theo mùa, theo từng cơ quan xâm nhập và tùy từng đối tượng bệnh nhân. Vào những thập niên 1970 tại Mỹ hàng năm xảy ra khoảng 164000 ca NKH/năm. Tuy nhiên 15 năm gần đây đã có 750000 ca NKH/năm, số ca tử vong tăng từ 18500 ca lên 31000 ca NKH/năm chiếm khoảng 2% số bệnh nhân nhập viện và chiếm 75% các trường hợp nằm ở khoa Hồi sức tích cực [40]; Một nghiên cứu tại Hàn Quốc thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Gram âm trên tổng số ca NKH là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn Gram dương. Người ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi khuẩn kỵ khí là 0,6%. Tần suất bắt gặp các mầm bệnh ở các khu vực là khác nhau. Khi phân tích trên từng khu vực người ta thấy Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae là phổ biến nhất ở Châu Phi, trong khi đó Klebsiella gặp tỷ lệ cao nhất ở Đông Nam Á, đồng thời tỷ lệ kháng thuốc gặp nhiều nhất ở Klebsiella [41]. Một nghiên cứu đa trung tâm tại Hàn Quốc gần đây cho thấy trong số 1192 bệnh nhân NKH là người lớn được điều trị tại 22 đơn vị hồi sức cấp cứu từ 2005 đến 2009 thì có 740 (62,1%) bệnh nhân bị shock nhiễm khuẩn. Trong đó có 422 (35,4%) bệnh nhân xác định được vi khuẩn trong máu, tỷ lệ tử vong là 28% [32]. Về tỷ lệ phân bố các mầm bệnh phụ thuộc vào vùng địa lý, đặc điểm, điều kiện kinh tế, xã hội. Trong nghiên cứu tại Hàn Quốc, một nước phát triển thấy tỷ lệ vi khuẩn gram âm là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn gram dương. Người ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi khuẩn kỵ khí là 0,6%. Các vi khuẩn nhiễm nhiều nhất là Escherichia coli (22,1%), tiếp theo là Klebsiella sp (12,6%) và Staphylococcus aureus (8,4%) [32]. Nghiên cứu của Deen và cộng sự về sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 là báo cáo tổng hợp của 17 nghiên cứu khác nhau tại khu vực Nam và Đông Nam Châu Á lại cho thấy tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất là loài Salmonella enteric serotype Typhi với 532/1798 tổng số ca dương tính (chiếm 30%) ở người lớn và 432/1723 tổng số ca dương tính (chiếm 25%) ở trẻ em. Ngoài ra, các 4 mầm bệnh vi sinh khuẩn khác thường gặp ở người lớn như S. aureus, E. coli và nhóm vi khuẩn Gram âm khác. Vi khuẩn thường gặp ở trẻ em như S. pneumoniae, H. influenzae. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1 dưới đây: Bảng 2. Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á) [12] Tính chung Người lớn Trẻ em (n; %) (n; %) (n; %) Enterobacteriaceae Gram âm 2132 (60,6) 1392 (77,4) 740 (42,9) S enterica serotype Typhi 964 (27,4) 532 (29,6) 432 (25,1) Non-typhoidal Salmonella 170 (4,8) 148 (8,2) 22 (1,3) Escherichia coli 240 (6,8) 215 (12,0) 25 (1,5) Klebsiella sp 156 (4,4) 137 (7,6) 19 (1,1) Enterobacter sp 29 (0,8) 26 (1,4) 3 (0,2) Proteus sp 10 (0,3) 8 (0,4) 2 (0,1) Citrobacter sp 8 (0,2) 8 (0,4) 0 (0) Shigella sp 3 (0,1) 1 (0,1) 2 (0,1) Other Enterobacteriaceae 11 (0,3) 5 (0,3) 6 (0,3) Haemophilus influenzae 144 (4,1) 0 (0) 144 (8,4) Acinetobacter sp 18 (0,5) 6 (0,3) 12 (0,7) Burkholderia pseudomallei 15 (0,4) 13 (0,7) 2 (0,1) Pseudomonas sp 209 (5,9) 183 (10,2) 26 (1,5) Neisseria sp 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3) Aeromonas hydrophilia 6 (0,2) 5 (0,3) 1 (0,1) Salmonella enteric Non-Salmonella Enterobacteriaceae Các VK Gram âm khác, 5 Tính chung Người lớn Trẻ em (n; %) (n; %) (n; %) Moraxella catarrhalis 24 (0,7) 0 (0) 24 (1,4) Các Gram âm khác 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3) 111 (3,2) 103 (5,7) 8 (0,5) 626 (17,8) 305 (17,0) 321 (18,6) Staphylococcus aureus 298 (8,5) 227 (12,6) 71 (4,1) Streptococcus pneumoniae 235 (6,7) 15 (0,8) 220 (12,8) Group A streptococcus (S pyogens) 12 (0,3) 3 (0,2) 9 (0,5) Group B streptococcus (S agalactiae) 1 (<0·1) 1 (0,1) 0 (0) Enterococcus spp (group D streptococcus) 24 (0,7) 22 (1,2) 2 (0,1) Other streptococci 27 (0,8) 10 (0,6) 17 (1,0) Các Gram dương khác 17 (0,5) 16 (0,9) 1 (0,1) Không xác định 12 (0,3) 11 (0,6) 1 (0,1) 43 (1,2) 43 (2,4) 0 (0) Cryptococcus spp 33 (0,9) 33 (1,8) 0 (0) Candida spp 2 (0,1) 2 (0,1) 0 (0) Histoplasma capsulatum 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0) Penicillium marneffei 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0) 57 (1,6) 57 (3,2) 0 (0) 27 (0,8) 27 (1,5) 0 (0) Mycobacterium avium complex 24 (0,7) 24 (1,3) 0 (0) Other mycobacteria 6 (0,2) 6 (0,3) 0 (0) 663 (18,8) 1 (0,1) 662 (38,4) Không xác định Gram dương Nấm Mycobacteria Mycobacterium tuberculosis complex Nguyên nhân khác 6 Như vậy, các nghiên cứu trên cũng đã phản ánh rõ ràng về tần suất xuất hiện các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm cao hơn nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là họ vi khuẩn Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp, Proteus spp, Salmonella sp và Enterobacteriaceae khác là những tác nhân hàng đầu gây bệnh lý NKH. 1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên vi sinh vật gây bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như viêm tiết niệu, nhiễm trùng vết mổ, NKH. Nhìn chung các vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng, tuy nhiên các loài vi khuẩn thường gặp gây bệnh được thống kê vẫn phổ biến nhất là các loài thuộc họ Enterobacteriaceae. Tác giả Trần Thị Ngọc Anh năm 2007, tại Viện Nhi Đồng 2 phân lập được 2738 chủng vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Vi khuẩn thường gặp nhất là: E. coli (14,6%), K. pneumoniae (11,7%), S. aureus (11,4%), P. aeruginosa (5,1%), S. pneumoniae (3,7%), Enterococci (4%), Acinetobacter baumanii (2,4%). Trong đó, hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được có tính kháng với nhóm kháng sinh betalactam, kháng và nhạy với carbapenem, tỷ lệ tụ cầu vàng kháng methiciline là 33,5% trong tổng số các chủng vi khuẩn phân lập được [1]... Do vậy, trong thực hành lâm sàng, việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh nhanh chóng và xác định tính kháng kháng sinh sẽ trở nên hữu ích và cần thiết cho các bác sĩ trong việc điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân. Thống kê của chương trình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của vi khuẩn năm 1996 thu được 1082 chủng từ các đơn vị tham gia trên toàn quốc chỉ ra rằng tỷ lệ NKH chiếm 21,6% trong số các loại bệnh phẩm thu được [7]. Phạm Văn Ca nghiên cứu trong thời gian 5 năm tại Bệnh viện Bạch Mai (1989-1993), tỷ lệ bệnh nhân cấy máu dương tính là 11,8 % ; Phạm Hùng Vân và cộng sự trong kết quả nghiên cứu từ 16 bệnh viện trên toàn quốc thu được 1602 chủng từ nhiều nguồn bệnh phẩm khác nhau trong đó có 188 bệnh phẩm máu chiếm tỷ lệ 11.7% [3]; Nghiên cứu của 7 Nguyễn Thanh Liêm và cs tại Bệnh viện Nhi đồng I từ năm 1999 đến 2004 nhóm vi khuẩn gây bệnh Gram âm chiếm tới (61.3%), trong đó hàng đầu là Klebsiella spp (44%), E. coli (19%) [4]. Một nghiên cứu về các căn nguyên gây NKH tại Bệnh viện TƯQĐ 108 do tác giả Bùi Thanh Thuyết trên 8.134 mẫu máu từ năm 2010 đến năm 2013 có 952 mẫu cấy máu dương tính (chiếm 11,7%). Trong đó, các vi khuẩn thường gặp là E. coli (25,84%), K. pneumoniae (15,02%), P. aeruginosa (9,87%)...và hầu hết các vi khuẩn này là vi khuẩn đa kháng thuốc, chúng kháng lại với đa số các kháng sinh thường dùng trong bệnh viện [6]. Như vậy, không chỉ ở trên thế giới mà cả ở Việt Nam, dịch tễ học các căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất, mức độ gây hại lớn vẫn tập trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Điều này cho thấy, trong thực hành lâm sàng tại Bệnh viện, việc chẩn đoán xác định chính xác và nhanh chóng chúng là việc làm rất cần thiết. 1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. Enterobacteriaceae là các chi vi khuẩn đường ruột Gram âm có hình que, chiều dài điển hình từ 1 μm đến 5 μm kị khí không nghiêm ngặt, lên men đường thành acid lactic. Hầu hết chúng khử nitrat thành nitrit, ngoại trừ một số vi khuẩn như Photorhabdus. Trong lâm sàng vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Salmonella sp chiếm trên 90% số các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae đã được nhận diện. 1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli Vi khuẩn E. coli được Theodor Escherich tìm ra năm 1885 và mang tên chính thức là Escherichia coli năm 1919. Vi khuẩn E. coli thường sống trong ruột. Đây là trực khuẩn Gram âm điển hình với kích thước trung bình từ 2-3 µm x 0.5 µm, có lông quanh thân nên di động được, không có bào tử, có một tỷ lệ nhỏ các chủng có vỏ. Vừa ưa khí, vừa kỵ khí, dễ nuôi, phát triển dễ dàng trên các môi trường thông thường mọc được ở nhiệt độ từ 5 đến 400C, thuận lợi ở 370C, pH thích 8 hợp 7,0 đến 7,2, nhưng vẫn phát triển ở pH 5,5 đến 8,0. Trên môi trường thạch thường sau 8-10 giờ nuôi cấy đã có thể nhìn thấy khuẩn lạc riêng rẽ qua kính phóng đại. Khuẩn lạc to dần, tròn, lồi, hơi phồng, đường kính 1,5mm, mặt nhẵn, bờ đều [37]. Vi khuẩn E. coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột. Tuy nhiên, trong những điều kiện thuận lợ, chính E. coli lại là căn nguyên gây nhiều bệnh nguy hiểm như các hội chứng viêm đường ruột và các bệnh cấp tính nguy hiểm như viêm màng não, viêm van tim, NKH. Ở Việt Nam, NKH do E. coli luôn là vấn đề quan trọng và khả năng vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh (trong đó có các kháng sinh có hoạt lực mạnh) là một khó khăn thực sự trong quá trình điều trị [24]. Các chủng E. coli gây NKH do chúng có đặc tính sau: có hoạt tính tan máu (Hemolysin); có khả năng tạo Colixin V; có khả năng gây độc của kháng nguyên K tạo cho vi khuẩn xâm nhập sâu hơn và lan rộng hơn; có khả năng kết dính hồng cầu cũng như nhiều tế bào có khả năng miễn dịch làm giảm khả năng hoạt động bình thường của chúng, chính vì vậy sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển nhanh và mạnh hơn [28]. Các yếu tố độc lực chủ yếu làm cho vi khuẩn này có khả năng xâm nhập vào máu trong điều kiện và hoàn cảnh thuận lợi. Trong 20 năm gần đây phần lớn các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy E. coli là vi khuẩn thường gặp nhất trong NKH do vi khuẩn Gram âm. Theo tác giả Canada cho biết tỷ lệ NKH do E. coli ở Canada là 52,5%. ở Pháp khoảng 20%, và ở Mỹ khoảng từ 12 đến 25 %, tỷ lệ nhiễm trùng do vi khuẩn này tùy thuộc vào mắc phải ở cộng đồng hay nhiễm trùng bệnh viện[26]. 1.2.2. Klebsiella pneumoniae Klebsiella là một trong những chi quan trọng của họ vi khuẩn đường ruột, được đặt theo tên nhà vi khuẩn người Đức, Edwin Klebs (1834-1913). Trong chi này thì loài quan trọng nhất và cũng là đại diện điển hình của chi này là Klebsiella pneumoniae. Đây là trực khuẩn Gram âm, thường đứng thành đôi, không di động, 9 có vỏ polysacharide đặc trưng. Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ. K. pneumoniae sống kị khí tùy ý: mọc dễ dàng và nhanh trên các môi trường nuôi cấy thông thường[24]. Các tính chất hóa sinh của loài vi khuẩn này khá đa dạng. Klebsiella pneumoniae chủ yếu gây bệnh cơ hội, ở cộng đồng hoặc trong bệnh viện - là một căn nguyên gây viêm phổi và thường gặp ở trẻ sơ sinh, tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị sớm [5], [37]. Ngoài ra nó còn có khả năng gây NKH, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, nhiễm khuẩn đường tiết niệu,…Theo các tác giả Mỹ cho thấy Klebsiella spp đóng vai trò quan trọng trong NKH cả bệnh viện và cộng đồng chiếm tỷ lệ 4- 17% trong các trường hợp NKH nói chung. Tỷ lệ tử vong do Klebsiella sp cao từ 20-60 % tùy đối tượng và địa phương khác nhau. Theo Hang J.B cho thấy tỷ lệ Klebsiella spp gây NKH ở Nauy từ 4,1đến 8,5 %. Nguồn lây vi khuẩn này chủ yếu từ đường ruột hoặc có thể xâm nhập theo các đường khác nhau như dụng cụ phẫu thuật, ống dẫn lưu, ống thông tiểu. Klebsiella bám vào niêm mạc đường hô hấp, đường tiết niệu nhờ fimbriae và một số kết dính có khả năng ức chế manose.Vi khuẩn này có khả năng xâm nhập vào mô hoặc tuần hoàn gây ra tình trạng bệnh nghiêm trọng. Một điều đáng lưu ý, song song với cơ chế gây độc thì vi khuẩn này còn có sự đề kháng kháng sinh mạnh, đặc biệt là đối với những bệnh nhân sử dụng kháng sinh không phù hợp [5]. 1.2.3. Salmonella sp Salmonella là một trong những tác nhân hàng đầu gây bệnh ở đường ruột ở các nước. Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình dài khoảng 2-3 µm và rộng khoảng 0,5-1,0 µm. Chi này hiếu khí tùy tiện, phát triển được trên môi trường nuôi cấy thông thường, không lên men lactose, lên men đường glucose thường sinh hơi… Salmonella là một trong những chi quan trọng nhất thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Đến nay hơn 2500 type huyết thanh Salmonella đã được xác định. Những Salmonella gây bệnh ở người thường được xếp thành hai loại: các Salmonella gây 10