Tài liệu Xác định thành phần loài và một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Ký sinh trùng Y học Mã số: 62 72 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại HỌC VIỆN QUÂN Y Cán bộ hƣớng dẫn khoa hoc: 1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực 2. PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thanh Hòa Cơ quan: Viện CNSH, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Đoàn Huy Hậu Cơ quan: Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng vào hồi ……..giờ, ngày……..tháng……năm…… Có thể tìm thấy luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) ở người và động vật do Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây ra. Đây là bệnh nhiệt đới bị lãng quên, lây truyền từ động vật sang người thông qua đường thực phẩm. Trong 25 năm qua, toàn thế giới có khoảng 17 triệu người mắc bệnh và 180 triệu người sống trong vùng nguy cơ nhiễm SLGL. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL. F. hepatica và F. gigantica có thể được phân biệt dựa vào hình thái nhưng phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế. Dạng trung gian (Fasciola sp.) với hình thái và kiểu gen hỗn hợp của F. hepatica và F. gigantica, xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm Việt Nam, rất khó xác định loài bằng hình thái. Vì vậy, ở những nơi tồn tại dạng trung gian, trong giám định loài SLGL, bên cạnh phương pháp hình thái học, ứng dụng sinh học phân tử là rất cần thiết. Hiện nay, dữ liệu hình thái và phân tử của SLGL ở Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu về hình thái và phân tử của SLGL là rất cần thiết. Đó là lý do chúng tôi tiến hành đề tài “ t v ts s t s t t . 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phương pháp hình thái học. 2. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam. 3. Tính khoa học, tính mới và tính thực tiễn của đề tài - Bằng việc kết hợp hình thái học và sinh học phân tử với cả gen nhân và gen ty thể để nhận dạng, xác định loài SLGL thập tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam nên các kết quả giám định loài khách quan, chính xác, tin cậy. - Đề tài đã chỉ ra được SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về hình thái và di truyền với F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. cùng tồn tại ở cả 3 khu vực địa lý và các vật chủ khác nhau. - Bước đầu chỉ ra được tần suất của F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. ở Việt Nam mà trước đó chưa nghiên cứu nào công bố. - Cung cấp dữ liệu ban đầu, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu những khác biệt về bệnh học, đáp ứng miễn dịch… ở vật chủ nhiễm F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. 4. Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (36 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (29 trang); Kết quả nghiên cứu (43 trang); Bàn luận (36 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); 40 bảng số liệu, 29 hình và 146 tài liệu tham khảo. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sán lá gan lớn Fasciola spp. và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) 1.1.1. Đặc điểm sinh học của Fasciola spp. - Các loài sán lá gan lớn và phân bố của chúng Sán lá gan lớn (SLGL) thuộc ngành giun dẹt, lớp sán lá, giống Fasciola. Hiện tại, giống Fasciola gồm có 4 loài: F. hepatica (Linnaeus, 1758), F. gigantica (Cobbold, 1855), F. nyanzae (Leiper, 1910) và F. jacksoni (Cobbold, 1869). Trong đó, F. hepatica và F. gigantica là 2 loài gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. F. hepatica phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, trong khi F. gigantica phân bố chủ yếu ở khu vực có khí hậu nhiệt đới như Châu Á, Châu Phi. - Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn Hì t sán trườ t : F. hepatica trưởng thành có kích thước 8 - 15 x 20 – 30 mm. F. gigantica khá giống F. hepatica, tuy nhiên chiều dài có thể tới 75 mm. F. gigantica thường thon và dài, trong khi F. hepatica thường ngắn và rộng. Hì t trứ : Trứng F. hepatica rất giống với trứng của F. gigantica. Trứng F. hepatica (150 x 90 μm) nhỏ hơn trứng của F. gigantica (200 x 100 μm). - Vòng đời sinh học: Vòng đời của SLGL rất đặc biệt trong lớp sán lá. Chúng chỉ có 1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống. Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính. Hình 1.2. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn - Các yếu tố ảnh hƣởng tới vòng đời của sán lá gan lớn Sự phát triển các giai đoạn vòng đời của SLGL phù thuộc rất nhiều vào các điều kiện môi trường và vật chủ trung gian. Trung gian truyền bệnh SLGL là các loài ốc thuộc họ Lymnaeidae. Sự phân bố của các loài ốc là vật chủ trung gian hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL. Ở Việt Nam, 2 loài ốc nước ngọt Lymaea viridis và Lymaea swinhoei được xác định là vật chủ trung gian chủ yếu của SLGL. 3 - Quá trình sinh sản, vấn đề lai và chuyển gen ở sán lá gan lớn Theo K. Cwilinski và CS (2016), SLGL 3 hình thức sinh sản: tự giao phối, giao phối chéo và sinh sản vô tính. Các hình thức sinh sản này gặp cả ở trong tự nhiên và trên thực nghiệm. Ở một số quốc gia như Nhật Bản, Việt Nam và Hàn Quốc, dạng trung gian Fasciola sp. với các các thể mang kiểu gen pha trộn của 2 loài hoặc các cá thể lai với gen nhân của loài này còn gen ty thể của loài kia đã được xác định (còn gọi là các cá thể chuyển gen). Dạng trung gian cũng được ghi nhận gây bệnh ở cả người và động vật. 1.1.2. Triệu chứng, chẩn đoán bệnh do Fasciola spp. - Triệu chứng lâm sàng: Các triệu chứng của bệnh do SLGL ở người thường xuất hiện sau khi bị nhiễm ấu trùng 2 tuần và phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh. Bệnh được chia làm 4 thời kỳ: ủ bệnh, toàn phát, tiềm tàng và mạn tính. Thời kỳ toàn phát với những biểu hiện rõ ràng nên bệnh nhân thường đi khám và được phát hiện bệnh. Thời kỳ này kéo dài 2 - 4 tháng với các triệu chứng cơ năng thường gặp là: sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, nổi mề đay, gan lách to… - Đặc điểm cận lâm sàng: Các xét nghiệm có giá trị chẩn đoán là: tăng bách cầu ái toan trên 5 %, có khi lên đến 83 %; Siêu âm gan thấy tổn thương hình tổ ong. Xét nghiệm ELISA máu dương tính với kháng thể kháng sán lá gan; Tìm trứng có giá trị chẩn đoán quyết định nhưng tỷ lệ dương tính rất thấp (< 5 %). 1.2. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở ngƣời và động vật - Trên thế giới: Nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ rất phổ biến trên toàn thế giới, tỷ lệ nhiễm trung bình từ 30 % đến 50 %. Ở người, theo Mas-Coma S. và CS (2004), trên toàn thế giới có khoảng 2,4 đến 17 triệu người có nguy cơ nhiễm SLGL, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL. - Ở Việt Nam: Theo một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu, bò dao động trong khoảng từ 30 đến 60%. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu thường cao hơn ở bò và mùa mưa tỷ lệ nhiễm thường cao hơn mùa khô. Ở người, theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008), tính đến tháng 3 năm 2008 số bệnh nhân nhiễm SLGL là > 5.000 người. Còn theo Nguyễn Văn Đề và CS (2012), tính đến năm 2012, bệnh SLGL ở Việt Nam lưu hành ở ít nhất 52 tỉnh/thành với số người mắc > 20.000 người. 1.3. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola spp. 1.3.1. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp. 2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là hình thái học và sinh học phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử gen ty thể và gen nhân tế bào. * Phƣơng pháp hình thái học Theo Periago và CS (2008), dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), SLGL được phân loại thành: nhóm giống với F. hepatica (1,65 - 2,76), nhóm giống F. gigantica (3,43 - 5,50) và nhóm Fasciola sp. (2,77 - 3,42). Theo Srimuzipo P. và CS (2000), dựa vào chiều dài SLGL được chia làm 3 nhóm: nhóm nhỏ (< 25 mm), nhóm trung bình (25 - 35 mm) và nhóm lớn (> 35 mm). 4 * Phƣơng pháp sinh học phân tử RFLP-PCR và giải trình tự là các công cụ thường được lựa chọn. Các chỉ thị cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể, các vùng giao gen ITS1, ITS2 và 28S thuộc hệ gen nhân thường được sử dụng. Simsek và CS (2011) đã sử dụng gen cox1 và các enzyme RsaI và AluI để phân biệt F. gigantica và F. hepatica. Ichikawa M và CS (2010) sử dụng vùng gen chứa đoạn giao gen ITS1 và enzyme RsaI để phân biệt F. hepatica, F. gigantica và dạng trung gian. Dạng trung gian được xác định có nhiều bất thường cả về hình thái và phân tử theo hướng phù hợp với cả 2 loài nên khó có thể xếp loại là F. hepatica hay F. gigantica. Vì thế, Mas-Coma và CS (2009) cho rằng, nếu chỉ dựa vào một trong 2 hệ gen nhân hoặc hệ gen ty thể để giám định loài SLGL sẽ không chính xác mà cần kết hợp cả 2 hệ gen. 1.3.2. Tính đa hình di truyền di truyền ở sán lá gan lớn - Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen ty thể: Tính đến hết năm 2016, đã có 5 hệ gen ty thể hoàn thiện của SLGL được giải mã và công bố trên ngân hàng gen. Chiều dài toàn bộ hệ gen ty thể của Fasciola sp. là 14453 bp, F. hepatica 14462 bp và F. gigantica 14478 bp, bao gồm 12 gen, 2 vùng mã hóa rRNA, 22 vùng mã hóa tRNA, một vùng không mã hóa và một số tiểu phần khác. - Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen nhân tế bào: Các vùng giao gen ITS-1 (khoảng 430 bp) và ITS2 (khoảng 360 bp) là những chỉ thị phân tử quan trọng để xác định loài SLGL. Trên đoạn ITS-2, F. hepatica và F. gigantica có 6 vị trí khác biệt và một trong số đó bị khuyết ở F. gigantica. Trên đoạn ITS-1, F. gigantica có 5 vị trí khác biệt so với F. hepatica. Dạng trung gian của SLGL có trình tự ITS-1, ITS-2 giao thoa, pha trộn của cả F. hepatica và F. gigantica. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam Trước đây, bằng phương pháp giám định hình thái học, một số tác giả cho rằng F. hepatica và F. gigantica đều có mặt ở Viêt Nam. Tuy nhiên, với sự hỗ trợ của sinh học phân tử hầu hết các nghiên cứu sau này cho rằng SLGL ở Việt Nam là F. gigantica và dạng trung gian. Các nghiên cứu sinh học phân tử chủ yếu lựa chọn gen nad1 hoặc cox1 thuộc hệ gen ty thể và ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân. Do ở Việt Nam tồn tại các cá thể dạng trung gian (bao gồm các cá thể lai) nên một số nghiên cứu chỉ sử dụng đơn thuần hệ gen ty thể hoặc hệ gen nhân có thể đã kết luận chưa thực sự đầy đủ, cụ thể về thành phần loài của SLGL. Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu - Nghiên cứu hình thái: 316 cá thể SLGL trưởng thành thu từ trâu, bò, dê, cừu và 01 cá thể SLGL thu từ người. - Nghiên cứu xác định loài và phân tích đặc điểm phân tử: gen cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 thuộc hệ gen nhân. 5 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu * Địa điểm thu thập mẫu: Miền Bắc (4 tỉnh): Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Điện Biên; Miền Trung-Tây Nguyên (gọi tắt là Miền Trung, 6 tỉnh): Nghệ An, Quảng Nam, ĐắkLắk, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận; Miền Nam (4 tỉnh): Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Tháp, Cần Thơ; * Địa điểm phân tích hình thái và phân tử: Học viện Quân y, Hà Nội; 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2013 đến 1/2017 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích dựa trên kết quả các đặc điểm hình thái và phân tử của SLGL. 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 2.2.2.1. Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái - Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái được tính theo công thức Z2 . SD2 1   /2 n , tham khảo giá trị tỷ số chiều dài/chiều rộng trong nghiên cứu của 2 ( ) Wannasan A và CS (2014) ở quần thể SLGL tại Thái Lan tính được n = 211. Thực tế, tổng số 317 cá thể SLGL toàn vẹn được đo đạc các chỉ số hình thái. - Chọn mẫu và thu thập mẫu SLGL: mỗi cá thể vật chủ trâu, bò, dê, cừu thu thập ngẫu nhiên từ 2 đến 20 con SLGL. Các mẫu sán được thu thập là các cá thể sán có hình thái toàn vẹn. Trong đó, Miền Bắc 121 cá thể, Miền Trung 137 cá thể và Miền Nam 59 cá thể; 126 cá thể sán thu từ 15 cá thể bò, 178 sán từ 16 cá thể trâu, 6 sán từ 2 cá thể dê, 6 sán từ 2 cá thể cừu và 1 cá thể sán thu từ người. - Ghi nhãn mẫu SLGL: mẫu sán được dán nhãn và ký hiệu với 4 thông tin: năm thu thập, vật chủ, địa điểm thu thập và thứ tự mẫu ở địa điểm đó. Ví dụ: mẫu 15Tr-HN1, thu thập năm 2015 từ trâu (Tr = trâu; B = Bò; C = cừu; D = Dê) tại Hà Nội. Đây là cá thể SLGL đầu tiên được ghi mẫu năm 2015 tại Hà Nội. 2.2.2.2. Cỡ mẫu giám định loài và phân tích đặc điểm sinh học phân tử - Cỡ mẫu giám định loài + Số lượng SLGL: 224 cá thể sán ở động vật và 01 ở người. SLGL ở động vật được lựa chọn sao cho thuộc cả 3 khu vực địa lý và ở các vật chủ khác nhau. + Chọn mẫu giám định loài bằng sinh học phân tử: Mỗi cá thể vật chủ tiến hành giám định loài không quá 10 con sán. Số lượng sán ở mỗi loại vật chủ như sau: bò 106 cá thể, trâu 108 cá thể sán, dê 6 cá thể, cừu 4 cá thể và người 1 cá thể. - Cỡ mẫu xác định các đặc điểm phân tử: 17 trình tự gen cox1, 8 trình tự gen nad1, 16 trình tự ITS1 và 16 trình tự ITS2. Cụ thể trong Bảng 2.1: Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự TT Ký hiệu 1 2 3 15Tr-HN1 15Tr-VP1 SLGL-N Năm thu thập 2015 2015 2010 Nơi thu thập Hà Nội Vĩnh Phúc Hà Nội Gen đƣợc giải trình tự Vật chủ cox1 nad1 ITS1 ITS2 Trâu X X X X Trâu X X X X X Ngƣời X X X 6 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 10B-HN1.8 10B-HN1.9 15Tr-NA5 10B-NA1.2 09B-QN1.1 15Tr-KH1 16D-NT1 16D-NT2 16C-NT1 16C-NT2 09B-TN1.1 14B-CT2 15Tr-ĐT1 15Tr-ĐT2 2010 2010 2015 2010 2009 2015 2016 2016 2016 2016 2009 2014 2015 2015 Hà Nội Hà Nội Nghệ An Nghệ An Quảng Nam Khánh Hòa Ninh Thuận Ninh Thuận Ninh Thuận Ninh Thuận Tây Ninh Cần Thơ Đồng Tháp Đồng Tháp Bò Bò Trâu Bò Bò Trâu Dê Dê Cừu Cừu Bò Bò Trâu Trâu X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.2.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái - Các chỉ số/chỉ tiêu hình thái được khảo sát, xác định: chiều dài cơ thể (BL), chiều rộng cơ thể (BW), tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân (VS-P) - Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Vật liệu bảo quản và làm tiêu bản sán, vật liệu đo đạc kích thước sán. - Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Kỹ thuật làm tiêu bản sán lá gan lớn bằng thuốc nhuộm Carmin; Xác định các chỉ số hình thái theo phương pháp của Periago và CS (2006, 2008). - Phân nhóm sán lá gan lớn theo hình thái: theo Srimuzipo và CS (2000) dựa vào chiều dài và theo Periago và CS (2008) dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng. 2.2.4. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong giám định loài, phân tích các đặc điểm phân tử 2.2.4.1. Các chỉ số/chỉ tiêu nghiên cứu về sinh học phân tử: kích thước sản phẩm PCR; số lượng, kích thước các mảnh cắt giới hạn; tỷ lệ tương đồng nucleotide; số nucleotide (nu), acid amin (aa) sai khác; tỷ lệ các nucleotide A, T, G, C... 2.2.4.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu - Hóa chất, sinh phẩm Bảng 2.2. Các mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng Gen đích Cox1 Nad1 ITS1 ITS2 Tên Sản Trình tự Nguồn mồi phẩm JB3 5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’ Bowles và 450bp CS, 1992 JB4.5 5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’ Ita10 5′-AAGGATGTTGCTTTGTCGTGG-3′ Itagaki và 630bp CS, 2005 Ita2 5′-GGAGTACGGTTACATTCACA-3′ ITS1-F 5′-TTGCGCTGATTACGTCCCTG-3’ Itagaki và 680bp CS, 2005 ITS1-R 5′-TTGGCTGCGCTCTTCATCGAC-3′ ITS2-F 5’-TGTGTCGATGAAGAGCGCAG-3’ Itagaki và 550bp CS, 2005 ITS2-R 5’-TGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3’ 7 Các sinh phẩm chạy PCR; Các enzyme RsaI, AluI, MspI, KpnI (Thermo, Mỹ); Các hóa chất chạy điện di và tách chiết ADN. - Các thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gồm: buồng mix PCR, máy PCR, máy ly tâm lạnh, máy vortex, máy điện di, máy chụp gel… 2.2.4.3. Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu - Kỹ thuật tách chiết và kiểm tra nồng độ ADN tổng số từ SLGL trưởng thành. - Khuyếch đại gen của SLGL bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl được thực hiện với chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 94 oC/10 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ [94 oC/30 giây, 53oC với gen cox1, 55 oC/45 giây với các gen khác, 72 oC trong 40 giây], sau đó là 1 chu kỳ 72 oC/10 phút và cuối cùng 1 chu kỳ 4 oC. - Cắt giới hạn sản phẩm PCR (RFLP): Tổng thể tích cắt giới hạn là 16 μl, gồm: 5 μl sản phẩm PCR, 1 μl enzyme giới hạn, 1 μl đệm 10X, 9 μl H2O. Hỗn dịch được ủ ở 37 oC có lắc trong 2 - 12 giờ rồi ghi hình trên máy UVP (Canada). - Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn trên gel Agarose - Đọc và phân tích trình tự bằng máy ABI 3130xl Gentic Analyzer. 2.2.4.4. Phân loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật PCR-RFLP - Phân loại SLGL theo Simsek S. và CS (2011) dựa vào kết quả PCR-RFLP với cặp mồi JB3, JB4.5 và các enzyme RsaI, AluI như dưới đây. Bảng 2.3. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 và kích thƣớc các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI, AluI Loài sán F. hepatica F. gigantica Sản phẩm PCR với Sản phẩm cắt giới mồi JB3, JB4.5 (bp) hạn với RsaI (bp) 450 450 450 180, 270 Sản phẩm cắt giới hạn với AluI (bp) 340, 110 450 - Phân loại SLGL theo Ichikawa M. và CS (2010) dựa vào kết quả PCR-RFLP với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R và enzyme RsaI như dưới đây. Bảng 2.4. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R và kích thƣớc các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI Loài sán F. hepatica Fasciola sp. F. gigantica Sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R (bp) 680 680 680 Sản phẩm cắt giới hạn với RsaI (bp) 360, 100, 60 360, 170, 100, 60 360, 170, 60 - Cá thể được xác định là F. hepatica hoặc F. gigantica nếu cả chỉ thị phân tử hệ gen ty thể và hệ gen nhân của cá thể đó đều thuộc 1 loài. - Cá thể dạng trung gian được phân loại làm 2 nhóm theo K. Cwiklinski và CS (2016), bao gồm: Nhóm các các thể có kiểu gen hỗn hợp (hệ gen nhân có dạng tổ hợp của 2 loài F. hepatica và F. gigantica) và nhóm các cá thể lai (cá thể có hệ gen nhân thuộc loài này còn hệ gen ty thể thuộc loài kia). 2.2.4.5. Xác định đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn dựa vào sự đa hình của kiểu gen đơn bội (haplotype): Kiểu gen đơn bôi của các gen nghiên cứu được xác định dựa vào so sánh với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen. 8 2.3. Đạo đức và y đức trong nghiên cứu: Các vấn đề nghiên cứu được Hội đồng khoa học và Hội đồng y đức của Viện SR - KST - CT Trung ương thông qua và cho phép tiến hành. Nghiên cứu bảo đảm vấn đề đạo đức và y đức trong nghiên cứu y sinh học, tuân thủ các nguyên tắc bảo mật thông tin của đối tượng nghiên cứu. Các số liệu, dữ liệu nghiên cứu đảm bảo đầy đủ, khách quan, trung thực. 2.4. Xử lý và phân tích kết quả nghiên cứu 2.4.1. Xử lý số liệu hình thái: Số liệu hình thái được đo đạc, tính toán và phân loại dựa vào kích thước chiều dài theo Srimuzipo và CS (2000) và tỷ số chiều dài/chiều rộng theo Periago và CS (2008). 2.4.2. Xử lý số liệu về sinh học phân tử: Trình tự các mẫu được so sánh và phân tích trên ngân hàng gene, cây phả hệ và phân tích trình tự trên các phần mềm Maga 6, mức độ tương đồng và thành phần các nu A, C, G, T trên đoạn gen được tính toán bằng công cụ nucleotide composition của phần mềm Bioedit. Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại SLGL vào hình thái học 3.1.1. Xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn 3.1.1.1. Kết quả x ts ỉs ì t s - Đối với sán lá gan lớn thu thập từ động vật Trong 316 cá thể SLGL thu ở động vật có 120 cá thể ở Miền Bắc (37,97 %), 137 cá thể ở Miền Trung (43,36 %) và 59 cá thể ở Miền Nam (18,67 %). a b Hình 3.2. Chiều dài SLGL thu từ Điện Biên và Bắc Giang năm 2010 (a: Mẫu SLGL ở bò Điện Biên; b: mẫu SLGL ở bò Bắc Giang) Bảng 3.1. Một số chỉ số hình thái của SLGL tại các khu vực nghiên cứu Chỉ số hình thể (mm) BL BW BL/BW VS-P Giá trị Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Miền Bắc ( n= 120 ) 16,00 - 36,00 26,55 ± 3,70 6,00 - 12,00 9,87 ± 1,15 1,73 - 4,46 2,72 ± 0,46 14,50 - 33,00 23,38 ± 3,50 Miền Trung (n = 137) 13,00 - 46,00 26,78 ± 5,02 6,50 - 15,00 9,21 ± 1,32 1,69 - 6,57 2,95 ± 0,63 12,00 - 43,50 24,13 ± 4,96 Miền Nam (n = 59) 18,00 - 45,00 30,96 ± 6,96 5,00 - 13,00 9,05 ± 1,91 1,58 - 5,83 3,51 ± 0,86 16,00 - 42,00 28,21 ± 6,81 Chung (n=316) 13,00 - 46,00 27,47 ± 5,27 5,00 - 15,00 9,43 ± 1,43 1,58 - 6,57 2,97 ± 0,68 12,00 - 43,50 24,61 ± 5,18 9 SLGL có chiều dài trung bình 27,47 ± 5,27 mm (13,00 - 46,00 mm). Chiều rộng 9,43 ± 1,43 mm (5,00 - 15,00 mm). Tỷ số chiều dài/chiều rộng 2,97 ± 0,68 (1,58 6,57). Khoảng cách giác bụng - cuối thân 24,61 ± 5,18 mm (12,00 - 43,50 mm). Bảng 3.2. Một số chỉ số hình thái của SLGL của các vật chủ khác nhau Chỉ số (mm) Giá trị Min - Max X ± SD Min - Max BW X ± SD Min - Max BL/BW X ± SD Min - Max VS-P X ± SD BL Bò (n = 126) 18,00 - 45,00 29,24 ± 5,68 5,00 - 13,00 9,62 ± 1,57 1,96 - 5,83 3,12 ± 0,81 15,50 - 42,00 26,06 ± 5,77 Trâu (n = 178) 13,00 - 41,00 25,97 ± 3,92 5,50 - 12,00 9,35 ± 1,19 1,58 - 4,43 2,81 ± 0,46 12,00 - 37,00 23,29 ± 3,74 Dê (n = 6) 19,00 - 46,00 33,00 ± 11,02 6,50 - 15,00 8,75 ± 3,19 2,53 - 6,57 3,96 ± 1,56 17,00 - 43,50 30,83 ± 10,71 Cừu (n = 6) 21,00 - 43,00 29,50 ± 8,75 6,0 - 10,5 8,33 ± 1,97 3,13 - 4,10 3,52 ± 0,38 19,00 - 41,00 27,08 ± 9,02 Chung (n=316) 13,00 - 46,00 27,47 ± 5,27 5,00 - 15,00 9,43 ± 1,43 1,58 - 6,57 2,97 ± 0,68 12,00 - 43,50 24,61 ± 5,18 Chiều dài của SLGL ở dê lớn nhất 33,00 ± 11,02 mm, thấp nhất ở trâu 25,97 ± 3,92 mm. Chiều dài/chiều rộng của SLGL ở dê cao nhất, với 3,96 ± 1,56. d Hình 3.3. Kích thƣớc SLGL thu từ dê (a), cừu (b), trâu (c) tại Ninh Thuận và Nghệ An (2015) và con SLGL thu từ ngƣời (d) - Đối với mẫu SLGL thu ở ngƣời: chiều dài 30,50 mm, chiều rộng 9,50 mm, chiều dài/chiều rộng 3,21 và khoảng cách giác bụng – cuối thân 26,50 mm. Quan sát trong tử cung của mẫu sán này không thấy trứng. - So sánh hình thái của F. gigantica và Fasciola sp. ở Việt Nam Bảng 3.7. So sánh hình thái của F. gigantica và Fasciola sp. ở Việt Nam Chỉ số hình thể (mm) BL BW BL/BW VS-P Giá trị Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Loài SLGL F. gigantica1 Fasciola sp.2 (n = 183) (n = 41) 13,00 - 46,00 16,50 - 45,00 13,00 - 46,00 27,94 ± 5,65 28,17 ± 5,31 26,87 ± 6,94 5,00 - 15,00 5,00 - 13,00 6,50 - 15,00 9,44 ± 1,52 9,35 ± 1,48 9,83 ± 1,64 1,58 - 6,57 1,58 - 5,83 1,69 - 6,57 3,03 ± 0,76 3,08 ± 0,73 2,77 ± 0,81 12,00 - 43,50 15,50 - 42,00 12,00 - 43,50 25,05 ± 5,63 25,29 ± 5,33 23,98 ± 6,77 Chung (n = 224) p P1,2 > 0,05 P1,2 > 0,05 P1,2 < 0,05 P1,2 > 0,05 10 Các chỉ số chiều dài, chiều rộng và khoảng cách giác bụng – cuối thân ở F. gigantica lớn hơn ở Fasciola sp. nhưng không có ý nghĩa thống kê. Chiều dài/chiều rộng ở F. gigantica lớn hơn một cách có ý nghĩa so với Fasciola sp. 3.1.2. Phân loại SLGL dựa vào một số chỉ số hình thái Bảng 3.8. Phân nhóm SLGL tại các khu vực địa lý theo chiều dài cơ thể Nhóm SLGL Nhỏ Trung bình Lớn Cộng Khu vực địa lý (SL, tỷ lệ %) Miền Bắc Miền Trung Miền Nam 34 (28,33) 80 (36,50) 9 (15,25) 85 (70,83) 77 (56,20) 35 (59,32) 1 (0,84) 10 (7,30) 15 (25,43) 120 (100) 137 (100) 59 (100) Chung (SL, tỷ lệ %) 93 (29,43) 197 (62,34) 26 (8,23) 316 (100) Ở cả 3 khu vực, SLGL chủ yếu thuộc nhóm có kích thước trung bình (197 mẫu, 62,34 %). Nhóm kích thước nhỏ chiếm 29,4 3%, lớn chiếm 8,23 %. Bảng 3.9. Phân nhóm SLGL thu thập ở động vật dựa vào chiều dài cơ thể Nhóm SLGL Nhỏ Trung bình Lớn Cộng Vật chủ (SL, tỷ lệ %) Bò Trâu Dê 22 (17,46) 66 (37,08) 2 86 (68,25) 109 (61,24) 0 18 (14,29) 3 (1,68) 4 126 (100) 178 (100) 6 Cừu 3 2 1 6 Chung (SL, tỷ lệ %) 93 (29,43) 197 (62,34) 26 (8,23) 316 (100) Đa số SLGL thu thập ở trâu, bò có hình thái nhỏ và trung bình với 98,32 % và 85,71 %. Ở dê, 4/6 cá thể thuộc nhóm lớn và 2/6 thuộc nhóm nhỏ, không cá thể nào thuộc nhóm trung bình. Ở cừu 3/6 cá thể thuộc nhỏ, 2/6 thuộc nhóm trung bình và chỉ 1 cá thể thuộc nhóm lớn. Bảng 3.11. Phân nhóm SLGL theo tỷ số chiều dài/chiều rộng Phân nhóm sán F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigentica-like Cộng Khu vực địa lý (SL, tỷ lệ %) Miền Bắc Miền Trung Miền Nam 67 (55,83) 64 (46,71) 9 (15,26) 47 (39,17) 50 (36,50) 25 (42,37) 6 (5,00) 23 (16,79) 25 (42,37) 120 (100) 137 (100) 59 (100) Chung (SL, tỷ lệ %) 140 (44,30) 122 (38,61) 54 (17,09) 316 (100) Theo tỷ số chiều dài/ chiều rộng có 140 cá thể (44,30 %) thuộc nhóm giống với F. hepatica, 54 cá thể (17,09 %) giống với F. gigentica, còn lại 122 cá thể (38,61 %) thuộc nhóm giống với Fasciola sp. 3.2. Xác định loài và phân tích một số đặc điểm phân tử SLGL ở Việt Nam 3.2.1. Kết quả xác định loài và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam 3.2.1.1. Kết quả k uế e , s bằ PCR-RFLP dự v ỉt e ty t cox1 và các enzyme RsaI, AluI Tất cả các mẫu ADN tổng số của SLGL đều được khuếch đại thành công bằng cặp mồi JB3, JB4.5 cho band khoảng 450 bp. + Với enzyme RsaI: 215/225 (95,56 %) mẫu PCR bị cắt với RsaI, trong đó có mẫu SLGL thu ở người, 10 mẫu PCR còn lại (4,44 %) không bị cắt. 11 1 2 Hình 3.6 (1) và Hình 3.7 (2). Sản phẩm PCR (với các mồi JB3, JB4.5) và các mảnh cắt giới hạn bằng enzyme RsaI và AluI của một số mẫu SLGL Hình 3.6a: giếng 1-7: sản phẩm PCR; M: thang DNA chuẩn 50bp; Hình 3.6b: giếng 1-7 sản phẩm cắt giới hạn; giếng M: thang DNA chuẩn 50bp. Hình 3.7a: giếng 1-4: sản phẩm cắt với RsaI, M: thang DNA 50bp; Hình 3.7b: giếng 1-4: sản phẩm cắt với AluI, M: thang DNA 50bp; giếng 5: chứng âm + Với enzyme AluI: Cả 225 mẫu sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzyme AluI, phù hợp với F. gigantica. - Kết quả thẩm định một số cá thể SLGL dựa vào so sánh trình tự nucleotide đoạn gen cox1 với ngân hàng gen So sánh trình tự nucleotide chứa 1 phần gen cox1 với ngân hàng gen cho thấy, cả 17 trình tự đều phù hợp với F. gigantica. Đoạn gen cox1 này có 5 nhóm kiểu gen đơn bội, đa số thuộc nhóm H8-CO1.FgVN (11 trình tự: 15Tr-HN1, 15TrVP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2 và SLGL-N); còn lại thuộc nhóm H9-CO1.FgVN (1 trình tự, 15Tr-KH1); H5-CO1.FgVN (1 trình tự, 09B-TN1.1); H4-CO1.FgVN (1 trình tự, 15Tr-NA5) và H3-CO1.FgVN (3 trình tự, 15Tr-DT1, 09B-QN1.1, 14B-CT2). - Kết quả phân tích quan hệ phả hệ của SLGL Việt Nam dựa vào chỉ thị cox1 a b Hình 3.8 (a) và Hình 3.10 (b). Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn gen cox1 (447 bp) và gen nad1 (535bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại 12 3.2.1.2. Kết quả s bằ dự v ỉt e ty t d1 Đối với đoạn gen nad1, cả 8 mẫu đều có trình tự phù hợp với F. gigantica. Trên đoạn gen này có 2 kiểu gen đơn bội, nhóm H1-ND1.FgVN với 7 trình tự 15Tr-HN, 15Tr-VP1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16D-NT1, 16C-NT1 và SLGL-N. 01 trình tự thuộc nhóm H5-ND1.FgVN (15Tr-NA5). 3.2.1.3. Kết quả k uế e , s bằ PCR-RFLP dự v ỉt e ITS1 v e zy e Rs I - Kết quả khếch đại gen ITS-1 Với cặp mồi ITS1-F và ITS1-R, toàn bộ 225 mẫu DNA của SLGL đều được nhân gen thành công. Tất cả cho band kết quả có cùng kích thước khoảng 680 bp. - Kết quả phân loại loài SLGL bằng phƣơng pháp PCR-RFLP dựa vào chỉ thị gen nhân ITS-1 và enzyme RsaI Hình 3.11. Minh họa sản phẩm PCR và cắt giới hạn với RsaI đoạn gen 680bp Trong 225 cá thể sán được phân tích, có 184 cá thể thuộc nhóm F. gigantica (81,78 %), 41 cá thể thuộc nhóm Fasciola sp. (18,22 %). Bảng 3.16. Phân bố loài SLGL theo khu vực địa lý Loài SLGL Miền Bắc Miền Trung Miền Nam Tổng F. gigantica (n, %) Fasciola sp.(n, %) 67 (76,14) 21 (23,86) 68 (80,95) 16 (19,05) 49 (92,45) 4 (7,55) 184 (81,78) 41 (18,22) Tổng (n, %) 88 (100,0) 84 (100,0) 53 (100,0) 225 (100,0) Cả Miền Bắc, Miền Trung và Miền Nam đều tồn tại các cá thể SLGL dạng trung gian (Fasciola sp.). Tần suất xuất hiện các cá thể trung gian ở khu vực Miền Bắc cao nhất (23,86 %) và thấp nhất ở khu vực Miền Nam (7,55 %). Bảng 3.17. Phân bố loài SLGL theo vật chủ Loài SLGL Bò Trâu Dê Cừu Người Tổng F. gigantica (n, %) Fasciola sp. (n, %) 88 (83,02) 18 (16,98) 90 (83,33) 18 (16,67) 3 3 2 2 1 0 184 (81,78) 41 (18,22) Tổng (n, %) 106 (100,0) 108 (100,0) 6 4 1 225 (100,0) SLGL ở cả 4 loài động vật trâu, bò, dê, cừu đều tồn tại các cá thể trung gian. Cá thể SLGL ở người là loài F. gigantica. 13 Bảng 3.18. Phân bố loài theo nhóm kích thƣớc chiều dài SLGL Nhóm kích thƣớc F. gigantica (n, %) Nhỏ 43 (68,25) Trung bình 123 (88,49) Lớn 18 (78,26) 184 (81,78) Tổng Fasciola sp. (n, %) 20 (31,75) 16 (11,51) 5 (21,74) 41 (18,22) Tổng (n, %) 63 (100,0) 139 (100,0) 23 (100,0) 225 (100,0) SLGL ở cả 3 nhóm kích thước đều tồn tại các cá thể có kiểu gen dạng trung gian (Fasciola sp.). Tần suất xuất hiện các cá thể trung gian ở nhóm SLGL có kích thước nhỏ cao nhất (31,75 %) và thấp nhất ở nhóm SLGL có kích thước trung bình (11,51 %). - Kết quả phân loại SLGL bằng dựa vào chỉ thị gen nhân ITS-1 Dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS1, 2 trình tự phù hợp với F. hepatica, 11 trình tự phù hợp với F. gigantica và 3 trình tự thuộc kiểu trung gian. 11 trình tự thuộc nhóm H0-ITS1.FgVN là SLGL-N, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2, 10BHN1.8, 09B-QN1.1, 09B-TN1.1, 14B-CT2, 15Tr-VP1, 15Tr-NA5, và 15Tr-DT1. Có 1 trình tự thuộc nhóm H1-ITS1.FgVN là 15Tr-HN1, 1 thuộc nhóm H2ITS1.FgVN là 16D-NT1 và 1 thuộc nhóm H3-ITS1.FgVN là 10B-NA1.2. Có 2 trình tự thuộc nhóm H5-ITS1.FgVN là 10B-HN1.9 và 15Tr-DT2. - Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng SLGL của Việt Nam dựa vào chỉ thị gen ITS-1 100 F.g_AB514855.1(ITS1Zambia) F.g_AB207142.1(ITS1Zambia) FasVN4-ITS1(16Cuu-NT1) FasVN3-ITS1(16D-NT2) FasVN1-ITS1(SLGL-N) AB514853.1_F.g(ITS1-Thailand) FasVN5-ITS1(16Cuu-NT2) FasVN06-ITS1(10B-HN1.8) FasVN08-ITS1(09B-QN1.1) FasVN10-ITS1(09B-TN1.1) FasVN11-ITS1(14B-CT2) 62 FasVN13-ITS1(15Tr-VP1) FasVN14-ITS1(15Tr-NA5) F.g_AB207143.1(ITS1Indonesia) F.g_AB207144.1(ITS1Thailand) F.g_AB385614.1(ITS1Vietnam) F.g_AB514854.1(ITS1Thailand) 72 F.g_AB514857.1(ITS1Vietnam) F.g_KC476171.1(ITS1Bangladesh) F.g_LC076127.1(ITS1Egypt) F.sp_AB207146.1(ITS1Japan) 76 F.sp_AB211238.1(ITS1Korea) KF425321.1_F.g(ITS1-Egypt) 90 FasVN15-ITS1(15Tr-DT1) FasVN12-ITS1(15Tr-HN1) 92 35 FasVN2-ITS1(16D-NT1) FasVN09-ITS1(10B-NA1.2) AB514866.1_F.sp(ITS1-Japan) F.g_KC424482.1(ITS1Bangladesh) AB514847.1_F.h(ITS1-Uruguay) 62 FasVN07-ITS1(10B-HN1.9) FasVN16-ITS1(15Tr-DT2) F.h_AB207140.1(ITS1Australia) F.h_AB207141.1(ITS1Ireland) 29 F.h_LC076147.1(ITS1Egypt) F.h_LC076196.1(ITS1Egypt) F.sp_AB207145.1(ITS1Japan) F.sp_AB385611.1(ITS1Vietnam) F.sp_AB514861.1(ITS1China) 41 F.h_KJ689325.1(ITS1Peru) F.h_KJ689333.1(ITS1Peru) F.h_GQ231546.1(ITS2Tunissi) AF040935.1_P.westermani(ITS1-Malaysia) 0.05 Hình 3.12. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS1 (432 bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại 14 Hình trên chỉ ra rằng, các cá thể 15Tr-DT2 và 10B-HN1.9 có quan hệ gần gũi với F. hepatica (AB514847.1, Uruguay) và Fasciola sp. (AB514866.1, Nhật Bản). Còn lại có quan hệ gần gũi với F. gigantica (AB514853.1, Thái Lan). 3.2.1.4. Kết quả s bằ ỉt e ITS-2 - Kết quả khuếch đại đoạn gen ITS-2 và phân nhóm SLGL Kết quả nhân đoạn giao gen ITS2 bằng cặp mồi ITS2-F và ITS2-R cho thấy, toàn bộ ADN của 225 cá thể đều cho kết quả PCR với band kích thước 540 bp khi điện di trên gel agarose 2 %. Dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS2, có 2 trình tự phù hợp với F. gigantica. Có 3 kiểu gen đơn bội ở trình tự này là H0-ITS2.FgVN (6 trình tự), H1ITS2.FgVN (5 trình tự) và H6-ITS2.FgVN (2 trình tự). Không có trình tự của cá thể nào thuộc các nhóm H2, H3, H4 và H5-ITS2.FgVN. - Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng SLGL của Việt Nam dựa vào chỉ thị gen ITS-2 Hình 3.14. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS2 (360 bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại Hình trên cho thấy, 11 cá thể 15Tr-NA5, SLGL-N, 14B-CT2, 09B-TN1.1, 09B-QN1.1 và 15Tr-ĐT1… có quan hệ gần gũi với F. gigantica. 02 cá thể SLGL 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2 có quan hệ gần gũi với F. hepatica và Fasciola sp. 3 trình tự ITS2 còn lại không hoàn thiện, có bất thường ở nucleotide số 435. Kết quả phân tích PCR-RFLP với gen nhân và gen ty thể không có mẫu SLGL nào thuộc nhóm F. hepatica thuần chủng. Với chỉ thị gen cox1, các mẫu SLGL đều phù hợp với F. gigantica. Tuy nhiên, bằng chỉ thị ITS1 chi ra có 41/225 15 (18,22 %) cá thể thuộc nhóm SLGL trung gian (Fasciola sp.), còn lại 184/225 (81,78 %) cá thể thuộc nhóm F. gigantica. Bảng 3.21. Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài bằng PCR-RFLP của SLGL thu từ động vật Phân loại theo BL/BW F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like Tổng số Kết quả phân loại bằng PCR-RFLP (n, %) F. gigantica Fasciola sp. 67 (36,61) 25 (60,98) 75 (40,98) 11 (26,83) 44 (22,41) 5 (12,19) 183 (100,0) 41 (100,0) Tổng số (n, %) 92 (41,07) 86 (38,39) 46 (20,54) 224 (100) Bảng 3.22. Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài bằng PCR-RFLP của các mẫu đƣợc so sánh trình trình tự Tên mẫu 15Tr-HN1 15Tr-VP1 15Tr-KH1 15Tr-NA5 15Tr-DT1 15Tr-DT2 10B-HN1.8 10B-HN1.9 09B-QN1.1 10B-NA1.2 09B-TN1.1 14B-CT2 16D-NT1 16D-NT2 16C-NT1 16C-NT2 SLGL-N Chỉ số hình thái BL/ BL BW BW 23,0 11,0 2,09 26,0 10,0 2,60 30,5 10,0 3,05 30,5 11,0 2,77 36,5 12,0 3,04 35,0 9,0 3,89 26,0 11,0 2,36 25,0 10,5 2,38 29,0 7,0 4,14 29,5 11,0 2,68 40,0 13,0 3,08 24,0 6,0 4,0 19,0 7,0 2,71 20,0 6,5 3,08 21,0 6,5 3,23 22,0 6,0 3,67 30,5 9,5 3,21 Phân nhóm theo tỷ lệ BL/BW F. hepatica-like F. hepatica-like Fasciola sp.-like Fasciola sp.-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like F. hepatica-like F. hepatica-like F. gigantica-like F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like F. hepatica-like Fasciola sp.-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like - Phân nhóm theo BL Nhỏ Trung bình Trung bình Trung bình Lớn Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Trung bình Kết luận loài theo SHPT Fasciola sp., trộn lẫn F. gigantica Fasciola sp., trộn lẫn F. gigantica F. gigantica Fasciola sp., lai F. gigantica Fasciola sp., lai F. gigantica Fasciola sp., trộn lẫn F. gigantica F. gigantica Fasciola sp., trộn lẫn F. gigantica F. gigantica F. gigantica F. gigantica Các kết quả phân loại SLGL theo hình thái và phân tử cho thấy, phân loại hình thái không tương đồng với phân loại bằng sinh học phân tử. 3.2.2. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử 3.2.2.1. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử chỉ thị gen cox1 Kết quả so sánh trên ngân hàng gen cho thấy, cả 17 mẫu đều có tỷ lệ tương đồng cao với SLGL. Các trình tự tương đồng cao hơn với F. gigantica và Fasciola sp. (tỷ lệ tương đồng trung bình > 98 %), tương đồng thấp hơn với F. hepatica (tỷ lệ tương đồng trung bình thấp < 94 %). So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen cox1 giữa SLGL Việt Nam và F. gigantica (KF543342.1, Trung Quốc) cho thấy, có 11 vị trí xuất hiện sai khác nhưng số nucleotide sai khác tối đa ở từng chủng không quá 6. Số nucleotide sai khác cụ thể 16 của từng chủng SLGL Việt Nam so với chủng Fasciola sp. (KF543343.1, China) cũng không quá 6. Tuy nhiên, so với chủng F. hepatica (AF216697.1, Australia) số nucleotide sai khác > 25. Hình 3.16. Minh họa 1 số vị trí có sai khác nucleotide gen cox1 của 17 mẫu SLGL ở Việt Nam so với SLGL trên thế giới Nucleotide số 67, 75, 93 và 117 của F. hepatica (AF216697.1-Autralia) có sự khác biệt so với F. gigantica (KF543342.1, Trung Quốc) và Fasciola sp. (KF543343.1, China) cũng như so với SLGL ở Việt Nam. Riêng 2 chủng 15TrNA5 và 09B-TN1.1 không có vị trí cắt của 2 enzyme RsaI (GTAC) và AluI (AGCT). Nucleotide A ở vị trí 189 thay bằng G giống như ở F. hepatica (AF216697.1-Autralia, M93388.1). Tất cả các mẫu SLGL ở nghiên cứu này đều không có vị trí nhận diện cắt của AluI (AGCT), vị trí này lại xuất hiện ở F. hepatica (AF216697.1, Autralia). 3.2.2.2. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử chỉ thị gen nad1 Tỷ lệ tương đồng đoạn gen nad1 của SLGL ở nghiên cứu này với các loài SLGL đã được khẳng định và công bố trên ngân hàng gen như sau: so với F. gigantica (AB385616.1, Việt Nam) tỷ lệ tương đồng là 99,4 %; so với Fasciola sp. (AB536756.1, Việt Nam), mẫu 15Tr-NA5 có tỷ lệ tương đồng 98,5 %, các mẫu còn lại tương đồng 99,6 %; so với F. hepatica (AB477361.1, Trung Quốc) tỷ lệ tương đồng của SLGL Việt Nam đều < 91,4 %. Có 6 vị trí nucleotide xuất hiện sai khác giữa các chủng SLGL trong nghiên cứu này so với chủng F. gigantica (AB385616.1, Vietnam). Chủng SLGL phân lập từ người (SLGL-N), 15Tr-VP1, 15Tr-HN1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16DNT1 và 16C-NT1 có 3 vị trí sai khác, các sai khác này dẫn tới 1 sai khác về acid amin ở vị trí số 38 so với F. gigantica (AB385616.1, Vietnam) nhưng tương đồng hoàn toàn so với Fasciola sp. (AB536756.1, Việt Nam). Riêng chủng 15Tr-NA5 có 4 vị trí sai khác nucleotide, nhưng cũng chỉ dẫn đến 1 sự sai khác so với F. gigantica (AB385616.1, Vietnam) ở vị trí acid amin số 79. 3.2.2.3. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử đoạn giao gen ITS-1 Kết quả phân tích cho thấy, đoạn ITS1 của hầu hết các chủng SLGL trong nghiên cứu này có tỷ lệ tương đồng > 99,0 % giữa các chủng với nhau và với Fasciola trên thế giới. 14/16 chủng SLGL Việt Nam có tỷ lệ tương đồng với F. gigantica cao hơn với F. hepatica. 2/16 chủng (10B-HN1.9 và 15Tr-DT2) có kết quả ngược lại, tương đồng với F. hepatica cao hơn với F. gigantica. 17 Bảng 3.28. Các vị trí có sai khác về nucleotide của SLGL Việt Nam và SLGL thế giới của đoạn giao gen ITS1 Loài/Chủng SLGL F. gigantica F. gigantica F. gigantica F. gigantica F. gigantica F. gigantica F. hepatica F. hepatica F. hepatica F. hepatica F. hepatica Fasciola sp. Fasciola sp. Fasciola sp. SLGL_N 16D-NT1 16D-NT2 16C-NT1 16C-NT2 10B-HN1.8 10B-HN1.9 09B-QN1.1 10B-NA1.2 09B-TN1.1 14B-CT2 15Tr-HN1 15Tr-VP1 15Tr-NA5 15Tr-DT1 15Tr-DT2 Vị trí biến đổi nu trên trình tự đoạn giao gen ITS1 24 114 208 286 306 T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T C A C T C C A C T C C A C T C C A C T C C A C T C T T T A T C A C T C C A C T C T T T A T Y T T W T T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T C A C T C T T T A T Y T T T C T T T A T T T T A T Y T T A T T T T A T T T T A T T T T A T C A C T C Mã số Quốc gia AB514853.1 AB207143.1 KC476171.1 AB514855.1 AB514857.1 KF425321.1 AB514847.1 AB207140.1 AB207141.1 KJ689325.1 LC076147.1 AB211238.1 AB385611.1 AB514861.1 Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Nghiên cứu này Thailand Indonesia Bangladesh Zambia Vietnam Egypt Uruguay Australia Ireland Peru Egypt Korea Vietnam China Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam So sánh tương đồng nucleotide của đoạn giao gen ITS1 cho thấy, hầu hết các chủng SLGL trong nghiên cứu này sai khác không quá 2 nucleotide so với SLGL F. gigantica trên ngân hàng gen. Tuy nhiên, riêng 2 mẫu 10B-HN1.9 và 15Tr-DT2 có 5 vị trí nucleotide có sai khác với F. gigantica. Các sai khác này biến đổi theo hướng phù hợp với F. hepatica và Fasciola sp. 3.2.2.4. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử đoạn giao gen ITS-2 Kết quả phân tích chỉ ra rằng, ngoại trừ các cá thể 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2, các các thể SLGL trong nghiên cứu này đều có tỷ lệ tương đồng với F. gigantica 18 (KF543340.1, China) đạt trên 99.7%. Riêng 2 cá thể 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2 tương đồng với F. gigantica chỉ 98,3% nhưng với F. hepatica là 100%. Hình 3.20. Minh họa các vị trị có sai khác nucleotide trên đoạn giao gen ITS2 của SLGL ở Việt Nam so với SLGL thế giới Hình trên cho thấy, một số vị trí của 2 cá thể 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2 biến đổi theo hướng giống với F. hepatica như vị trí 207 và 231 C chuyển thành T, vị trí 270 và 276 T chuyển thành C, vị trí 334 A thành G. Ngoài ra 10B-HN1.9 và 15Tr-ĐT2 có nu T được chèn thêm vào ở vị trí 327 làm cho vị trí này giống với F. hepatica. Trong khi các mẫu khác và ở sán F. gigantica không có vị trí này. Bảng 3.30. Các vị trí sai khác nucleotide của đoạn giao gen ITS2 giữa SLGL Việt Loài/Chủng SLGL F. gigantica Fasciola sp. F. hepatica 09B-TN1.1 14B-CT2 09B-QN1.1 10B-HN1.8 10B-HN1.9 SLGL-N 15Tr-NA5 15Tr-DT1 15Tr-DT2 15Tr-VP1 16D-NT2 16c-NT1 16c-NT2 Nam và thế giới Vị trí có sai khác về nucleotide 207 218 231 270 276 327 334 C T T C C C C T C C C T C C C C T T T T T T C T T T T T C C C C C T T C C C C T C C C T C C C C T C C T T T T C T T T C T T T T T C C T T T T C T T T C T T T T T T T T - A G G A A A A G A A A G A A A A Mã số Quốc gia KF543340.1 Trung Quốc KF543341.1 Trung Quốc AB973396.1 Ireland Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Nghiên cứu này Việt Nam Bảng trên cho thấy, có 7 vị trí xuất hiện sai khác trên đoạn ITS-2 của các chủng SLGL Việt Nam so với F. gigantica (KF543340.1, China). Các chủng 10B-HN1.9 và 15Tr-DT2 có 6 sai khác, các sai khác này theo hướng biến đổi giống với Fasciola sp. và F. hepatica. Các chủng còn lại không có sai khác so với F. gigantica (KF543340.1, China).