Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Xác định bệnh nhân tái nhiễm và tái phát helicobacter pylori sau quá trình điều ...

Tài liệu Xác định bệnh nhân tái nhiễm và tái phát helicobacter pylori sau quá trình điều trị

.PDF
59
527
68

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----♦♦♦----- VŨ ĐỨC NAM XÁC ĐỊNH BỆNH NHÂN TÁI NHIỄM VÀ TÁI PHÁT HELICOBACTER PYLORI SAU QUÁ TRÌNH ĐIỀU TRỊ Chuyên ngành : Vi sinh Mã số : 60 42 01 03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh HÀ NỘI-2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh, nghiên cứu viên phòng Công nghệ Gen động vật- Viện Công nghệ Sinh học. Người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc tại phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em phòng Công nghệ Gen Động vật, các anh chị bệnh Viện E đã tận tình chỉ bảo, động viên và cho tôi những lời khuyên qúi giá trong công việc cũng như trong cuộc sống. Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học. Tôi xin cảm ơn cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh Thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thân, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc. Hà Nội ngày 31 tháng 12 năm 2014 Học viên cao học KS. Vũ Đức Nam Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 1.1. Một số vấn đề về H. pylori ....................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 3 1.1.3. Dịch tễ học và phương thức lây truyền ................................................... 5 1.1.4. Các phương pháp chẩn đoán H. pylori.................................................... 5 1.1.4.1. Các phương pháp không can thiệp ....................................................... 5 1.1.4.2. Các phương pháp can thiệp .................................................................. 9 1.2. Vấn đề điều trị trừ H. pylori .................................................................. 12 1.2.1. Các thuốc sử dụng để điều trị tiệt trừ H. pylori .................................... 12 1.2.2. Phác đồ kết hợp ba thuốc EAC trong điều trị H. pylori ........................ 13 1.3. Nguyên nhân thất bại điều trị ............................................................... 14 1.3.1. Đề kháng kháng sinh ............................................................................. 14 1.3.2. Tuân thủ điều trị .................................................................................... 16 1.4. Vấn đề chẩn đoán H. pylori kháng thuốc ............................................. 16 1.5. Một số vấn đề về loét dạ dày ................................................................. 17 1.5.1. Khái niệm .............................................................................................. 17 1.5.2. Nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh ............................................................ 17 1.5.3. Giải phẫu bệnh lý của loét dạ dày ......................................................... 18 1.5.4. Triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm của bệnh loét dạ dày .................. 19 1.5.4.1. Triệu chứng lâm sàng ......................................................................... 19 1.5.4.2. Triệu chứng cận lâm sàng [18], [19] .................................................. 19 1.5.5. Tiến triển và biến chứng ....................................................................... 20 1.5.6. Điều trị................................................................................................... 20 1.5.6.1. Điều trị nội khoa................................................................................. 20 1.5.6.2. Điều trị ngoại khoa ............................................................................. 22 1.6. Tình hình nghiên cứu H. pylori ở Việt Nam và trên thế giới ............. 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 25 2.1. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................... 25 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................. 25 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 26 2.3.1. Hóa chất, thiết bị máy móc ................................................................... 26 2.3.2. Địa điểm thực hiện nghiên cứu ............................................................. 27 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 27 2.4.1. Khám lâm sàng ...................................................................................... 27 2.4.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm ...................................................................... 28 2.4.3. Đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh .................................................. 28 2.4.3.1 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của H. pylori ........................ 28 2.4.3.2 Đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh ................................................ 29 2.4.4. Nuôi cấy chủng vi khuẩn ..................................................................... 29 2.4.5. Tách chiết DNA từ sinh thiết bệnh nhân............................................... 30 2.4.6. Định lượng DNA bằng quang phổ kế ................................................... 30 2.4.7. Phương pháp điện di trên gel Agarose .................................................. 31 2.4.8 Phương Pháp PCR ................................................................................. 32 2.4.9. Phân tích trình tự đoạn gen 23S rARN ................................................. 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................. 34 3.1. Đặc điểm chung của các bệnh nhân ..................................................... 34 3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới ....................................................................... 34 3.1.2. Hình ảnh chụp nội soi dạ dày của các bệnh nhân ................................. 34 3.2. Tách chiết DNA sinh thiết ..................................................................... 35 3.3. Khuếch đại đoạn gen 23S rARN của H. pylori bằng PCR ............... 36 3.4. Xác định tái phát và tái nhiễm H. pylori ở các bệnh nhân ................. 38 3.5. Xác định tình trạng nhiễm H.pylori của các bệnh nhân trƣớc và sau điều trị kháng sinh .................................................................................. 39 3.5.1. Đặt kháng sinh đồ.................................................................................. 39 3.5.1.1 Kháng sinh đồ sử dụng thanh E-test trên đĩa thạch nuôi vi khuẩn .... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.5.1.2. Xác định khả năng kháng Amoxicilin và Clarithromycin .................. 39 3.5.1.3 Xác định tái phát và tái nhiễm của các chủng H.pylori sau điều trị kháng sinh ....................................................................................................... 40 KẾT LUẬN .................................................................................................... 45 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT (Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành) Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Deoxyribonucleic acid Axit đeoxyribonucleic Kb Kilo base 1000 cặp bazơ OD Optical Density Giá trị mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic DNA Phần mềm cho sinh học phân tử DNASTAR TAE Tris - Acetic acid - Ethylen Diamin Tetra Acetic TBE Tris - Borate - Ethylen Diamin Tetra Acetic TE Tris - Ethylen Diamin Tetra Acetic Tm Temperature melt Nhiệt độ biến tính R Resistant Kháng S Susceptible Nhạy cảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC BẢNG Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm ................................................... 26 Bảng 2.2. Trình tự mồi 23S rARN .................................................................. 26 Bảng 2.3. Máy móc thiết bị sử dụng cho thí nghiệm ...................................... 27 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 33 Bảng 3.1. Độ sạch và nồng độ DNA của một số mẫu ................................... 36 Bảng 3.2. Kết quả khuếch đại gen 23S rARN từ DNA sinh thiết bệnh của các bệnh nhân trước nhiễm H. pylori và sau khi điều trị kháng sinh Cla & Amo .................................................................................... 37 Bảng 3.3. Các chủng H.pylori sau điều trị kháng sinh Cla và Amox ............. 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC HÌNH Hình 1.1 : Hình ảnh điển hình của Helicobacter pylori. .................................. 3 Hình 2. Vị trí tác dụng của một số thuốc ........................................................ 21 Hình 2.1. Hệ thống bình nuôi cấy kị khí ......................................................... 29 Hình 3.1. Ảnh chụp nội soi dạ dày xuất huyết của 17 bệnh nhân ................... 35 Hình 3.2. Ảnh điện di DNA tổng số .............................................................. 35 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR ............................................................. 37 Hình 3.4. Đột biến A2143G trong các chủng H. pylori trước điều trị kháng sinh ................................................................................................ 39 Hình 3.5: Đặt E-Test kháng sinh Clarithromycin và Amoxicilin .................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, Helicobacter pylori (H. pylori) đã được khẳng định là một trong những tác nhân chủ yếu gây các bệnh viêm loét dạ dày, hành tá tràng và ung thư dạ dày ở người. Theo ý kiến của một số nhà khoa học, nhiễm H. pylori ở đường tiêu hóa có thể được xem là bình thường, vì hơn một nửa nhân loại nhiễm H. pylori. Tại các nước nghèo tỉ lệ người dân bị nhiễm trùng còn cao hơn. Ví dụ, tại Việt Nam và Trung Quốc. con số này lên đến 75%. Về mặt bệnh học, khoảng 80% số người bị nhiễm H. pylori không thể hiện triệu chứng hoặc biến chứng, khoảng 10 - 15% người phát triển loét dạ dày tá tràng và chỉ 1 - 3% bệnh nhân bị ung thư dạ dày sau nhiều năm nhiễm khuẩn Về mặt dịch tễ học. H. pylori lây truyền chủ yếu qua đường ăn uống, nước bọt, dịch tiêu hóa, phân… nên nguy cơ lây giữa các thành viên trong gia đình rất cao. Vì thế, cần chú ý sử dụng nguồn nước sạch, tuân theo những nguyên tắc vệ sinh như ăn chín, uống sôi, rửa tay sạch sẽ trước khi ăn để phòng ngừa các bệnh do nhiễm khuẩn dạ dày. Hiện nay, liệu pháp kháng sinh được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh tiêu hóa liên quan đến nhiễm H. pylori- loài vi sinh vật gây bệnh đa dạng về mặt di truyền. Ở các nước đang phát triển, việc điều trị bệnh bằng liệu pháp càng ngày càng khó khăn, phần do vi khuẩn trở nên kháng thuốc, phần do điều kiện sống và vệ sinh cộng đồng. Hiện tượng tái nhiễm do các chủng vi khuẩn H. pylori mới và tái phát do các chủng H. pylori tương tự như chủng H. pylori trước khi điều trị là nguyên nhân thất bại của điều trị, Ở các nước phát triển, sự có mặt của của H. pylori sau điều trị kháng sinh thường gắn liền với tái phát, trong khi đó ở các nước đang pháp triển, tình hình có thể khác hơn, phụ thuộc nhiều vào điều kiên kinh tế và xã hội. Ở Peru, nước có hoàn cảnh kinh tế và xã hội thấp, tỷ lệ tái nhiễm được xác định là cao. Ở Việt Nam, chưa có công trình nghiên cứu nào đề cặp đến vấn đề tái nhiễm và tái phát HP ở các bệnh nhân sau điều trị kháng sinh.Xuất phát từ 1 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu“Xác định bệnh nhân tái nhiễm và tái phát Helicobacter pylori sau quá trình điều trị” kháng sinh Clarithromycin (Cla) và Amoxicillin (Amo) với mục đích tìm hiểu nguyên nhân tái phát và tái nhiễm H.pylori ở các bệnh nhân Tính kháng thuốc Cla của các chủng H. pylori được xác định bằng phân tích đoạn gen 23S rARN không qua giai đoạn nuôi cấy vi khuẩn mà sử dụng DNA bệnh phẩm. 2 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số vấn đề về H. pylori 1.1.1. Lịch sử phát hiện Helicobacter pylori được phát hiện bởi John Robin Warren và Barry Marshall vào năm 1982. Lúc đầu vi khuẩn này được đặt tên là Campylobacter pylori, sau các nghiên cứu tiếp theo đến năm 1989, H. pylori trở thành tên gọi chính thức được thế giới công nhận [1], [15]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học H. pylori là một vi khuẩn Gram âm hình cong hoặc xoắn có lông roi và chỉ cư trú ở biểu mô kiểu dạ dày. Vi khuẩn này có thể nuôi cấy được trên thạch sô cô la hoặc thạch máu cừu trong môi trường vi ái khí (5-10% O2) [1], [15]. Các lông của H. pylori ở một đầu tận cùng có dạng hình đĩa, cấu trúc này không gặp ở bất kỳ loại Campylobacter khác. Nhờ vào các lông này mà H. pylori có thể di chuyển nhanh chóng trong lớp chất nhầy đặc. Phần còn lại của bề mặt H. pylori nhẵn Hình 1.1 : Hình ảnh điển hình của Helicobacter pylori. 3 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 H. pylori có thể có dạng hình cầu với nhiều kích thước khác nhau. Các tác giả cho đó là thể thoái hóa coccoid, một số lại cho rằng đó là thể đề kháng thường thấy sau khi vi khuẩn được điều trị bằng một số kháng sinh. Ở dạng hình cầu, H. pylori có thể tồn tại lâu hơn trong các môi trường không thuận lợi. Vi khuẩn sống được trong môi trường acid của dạ dày nhờ sự hoạt động của men urease phân huỷ ure tạo amoniac và bicarbonate cũng nhưc một vi môi trường kiềm bao quanh vi khuẩn trong lớp chất nhầy niêm mạc. Từ vị trí cư trú này H. pylori gây phản ứng viêm niêm mạc, khởi đầu là tổn thương cấp tính thâm nhiễm bạch cầu trung tính, trong một vài tuần tiếp theo phản ứng viêm sẽ dần trở thành mạn tính với sự thâm nhiễm chiếm ưu thế của lympho bào, tế bào đơn nhân lớn, tương bào. Nhiễm H. pylori cấp tính gây tổn thương tế bào bìa và giảm acid dịch vị với triệu chứng buồn nôn,, tiếp sau đó là tình trạng nhiễm mạn tính không có triệu chứng. Bài tiết acid dịch vị tiếp tục duy trì ở mức thấp kéo dài hàng tháng cho tới khi cơ thể người bệnh loại trừ được phần lớn vi khuẩn ở vùng thân dạ dày. Tình trạng tiến triển của nhiễm khuẩn xuất hiện khi H. pylori gây ra tổn thương viêm mạn tính khu trú ở phần xa của dạ dày (hang vị) và tá tràng. Giai đoạn này chức năng tế bào bìa ở vùng thân vị đã được phục hồi do đó bài tiết acid trở về bình thường hoặc thậm chí ở mức cao nên người bệnh rất dễ bị loét dạ dày - tá tràng. Tuy nhiên, thực tế cho thấy tất cả những bệnh nhân nhiễm khuẩn có bằng chứng MBH của viêm loét dạ dày - tá tràng mạn tính đều có thể hồi phục tổn thương sau khi tiệt trừ vi khuẩn. Một số bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính do H. pylori lan dần từ hang vị lên thân vị dẫn đến viêm dạ dày toàn bộ. Viêm dạ dày toàn bộ, viêm teo niêm mạc và dị sản ruột dẫn đến giảm acid dịch vị. Tình trạng này làm giảm nguy cơ loét dạ dày nhưng nguy cơ ung thư dạ dày tăng cao. 4 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 1.1.3. Dịch tễ học và phƣơng thức lây truyền Nhiễm khuẩn H. pylori xuất hiện phổ biến trên thế giới, nhưng tần suất nhiễm rất khác nhau giữa các quốc gia và giữa các bộ phận dân cư trong cùng một quốc gia. Tần suất nhiễm H. pylori liên quan chặt chẽ với điều kiện kinh tế xã hội với tỷ lệ nhiễm cao ở các nước kém phát triển [43]. Ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm khoảng 65,6% trong đó nhóm tuổi trên 40 nhiễm cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm tuổi dưới 40 [56]. Vi khuẩn nhiễm vào cơ thể qua đường miệng và lan truyền chủ yếu giữa các thành viên gia đình từ khi còn nhỏ. Sự lan truyền vi khuẩn từ người sang người ở các nước công nghiệp phát triển thường là do tiếp xúc với chất nôn, nước bọt hoặc phân của người nhiễm, ngoài ra nhiễm khuẩn qua nguồn nước cũng là một con đường truyền bệnh khác mà chủ yếu gặp ở các nước đang phát triển. Cho đến nay vẫn chưa có bằng chứng cho việc nhiễm khuẩn từ động vật, mặc dù H. pylori đã được tìm thấy ở một số loại linh trưởng và cả ở những động vật khác nhưng rất hiếm. Nhiễm H. pylori ở người trưởng thành luôn luôn là tình trạng mạn tính và sẽ không bị loại bỏ nếu không được điều trị đặc hiệu. Trái lại, quá trình đào thải tự nhiên vi khuẩn rất thường gặp ở trẻ nhỏ và được trợ giúp thêm bởi việc sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh lý khác trong thời kỳ niên thiếu. Ở các nước phát triển, tỷ lệ nhiễm mới H. pylori đã giảm đáng kể trong vài thập niên gần đây. Do đó có thể thấy tần suất nhiễm H. pylori tăng theo tuổi chủ yếu là do tác động của quần thể, phản ánh sự lây truyền tập trung vào thời kỳ niên thiếu của các cá thể trong quần thể. 1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán H. pylori 1.1.4.1. Các phƣơng pháp không can thiệp * Nghiệm pháp thở C13 hoặc C14 Nghiệm pháp thở, cũng giống như phương pháp Urease, dựa vào đặc tính của H. pylori tiết men urease. Có hai loại nghiệm pháp thở: C14 phóng xạ và C13 không phóng xạ. Khi có sự hiện diện men urease của H. pylori trong dạ dày, viên thuốc có chứa ure được đánh dấu bằng các đồng vị cácbon (C13 5 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 hoặcC14) sẽ được thủy phân giải phóng ra khí CO2 và thở ra ngoài. Khí CO2 được đánh dấu này sẽ được phát hiện trong các mẫu thở bằng dò xạ lấp lánh (scintillation) ở máy nghiệm pháp thở C14 và bằng phổ kế khối (mass spectrometer) ở máy nghiệm pháp thở C13 [27]. Nghiệm pháp thở C13 ngày nay được coi là phương pháp chẩn đoán H. pylori tiêu chuẩn vàng cả trước và sau điều trị diệt trừ H. pylori [42]. Phương pháp chẩn đoán này đã được đánh giá, được chuẩn hoá quốc tế và độ chính xác của nghiệm pháp này cao hơn các phương pháp chẩn đoán khác. Nhiều trung tâm trên thế giới đã báo cáo nghiệm pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên 95% [4], [34], [52]. C13 là một dạng tự nhiên ổn định của nguyên tố cácbon, vì vậy nghiệm pháp thở C13 không liên quan đến phóng xạ. Đây là một yếu tố quan trọng để bệnh nhân lựa chọn và phương pháp chẩn đoán này đặc biệt thích hợp cho trẻ em và phụ nữ đang độ tuổi sinh đẻ. Hơn thế nữa, phương pháp này an toàn, không phải lo đến vấn đề vận chuyển, loại bỏ các mẫu bệnh phẩm có nhiễm phóng xạ. Phương pháp lấy mẫu thở đơn giản và có thể thực hiện từ xa, sau đó vận chuyển đến nơi có máy để phân tích. Khác với nghiệm pháp thở C13, nghiệm pháp thở C14 không có các quy trình chuẩn và không phải tất cả các quy trình đều được đánh giá chất lượng. Phương pháp chẩn đoán này thay đổi theo liều và công thức của đồng vị phóng xạ, phương pháp lấy mẫu thở, sử dụng thức ăn hoặc dung dịch có chứa urê phóng xạ, sử dụng mẫu baseline, thời gian đo lượng 14 CO2 cao nhất và mức chuẩn để cho là kết quả dương tính. Trên thực tế lâm sàng, cần phải đánh giá độ chính xác của phương pháp này trước khi đưa vào sử dụng. Phương pháp lấy mẫu thở này hơi phức tạp và nghiệm pháp thở C14 có liên quan đến lượng nhỏ chất phóng xạ nên chống chỉ định với trẻ em và phụ nữ đang tuổi sinh đẻ. Nếu bệnh nhân được lựa chọn thì nghiệm pháp thở C13 không phóng xạ vẫn là phương pháp tốt hơn. Nghiệm pháp thở, khác với các phương pháp chẩn đoán H. pylori dựa vào sinh thiết, không bị ảnh hưởng của vấn đề sai số do lấy mẫu bởi vì đồng 6 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 vị cácbon phân bổ đều trên toàn bộ bề mặt của niêm mạc dạ dày. Ở các nước châu Âu, do giá thành nội soi đắt (100 USD ở Úc và 500 USD ở Mỹ), nên nghiệm pháp thở rẻ tiền hơn nhiều so với nội soi (chỉ mất 3 đến 5 USD cho một lần thử nghiệm). Ở Việt Nam, nghiệm pháp thở chưa được áp dụng có thể vì tiền đầu tư vào máy thở cao và giá thành của nghiệm pháp thở cũng cao tương đương như nội soi, trong khi đó nội soi không chỉ giúp chẩn đoán H. pylori mà còn chẩn đoán chính xác bệnh lý dạ dày tá tràng, có thể phát hiện ung thư dạ dày, một bệnh khá phổ biến ở nước ta. * Phƣơng pháp huyết thanh học: - Phƣơng pháp ELISA Các phương pháp huyết thanh học đều dựa vào các kháng thể kháng H. pylori, phần lớn xác định bằng kỹ thuật ELISA. Vấn đề nhiễm H. pylori trên lâm sàng chủ yếu là nhiễm mạn tính bởi nhiễm cấp tính có thể xảy ra ở thời niên thiếu và rất ít khi gặp ở người trưởng thành. Các kháng thể IgM, IgA, IgG được sử dụng trong các phương pháp huyết thanh học. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này thay đổi tùy thuộc vào kháng nguyên được sử dụng và mức độ có phản ứng chéo. Phát hiện kháng thể IgM chỉ được 8-10% số người bị nhiễm, chủ yếu ở trẻ em. Độ nhạy của phương pháp ELISA dựa trên phát hiện kháng thể IgA dao động từ 65% đến 85% []. Phương pháp ELISA dựa trên cả hai kháng thể IgA và IgG cũng không cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn khi dựa vào kháng thể IgG đơn độc [57]. Độ nhạy trung bình khoảng 80% [57]. Trên thị trường có nhiều bộ Kits khác nhau (khoảng trên 20 bộ) ví dụ như Helisal, Pyloriset, FlexureHP, PlexPackHP. Các bộ Kits này cho phép làm các xét nghiệm đơn giản từ máu toàn phần và có thể sử dụng ngay trên bàn của bác sỹ phòng khám. Phương pháp huyết thanh học có giá thành thấp và là phương pháp lý tưởng cho các nghiên cứu điều tra dịch tễ [4], [46]. Tuy việc sử dụng phương pháp chẩn đoán này ở những bệnh nhân trẻ tuổi (< 45 tuổi) có hội chứng dạ dày, có thể giảm bớt gánh nặng cho nội soi, nhưng vì độ chính xác của phương pháp này có hạn nên có thể có khó khăn khi quyết định 7 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 điều trị hay không ở từng trường hợp cụ thể. Phương pháp này cũng không có giá trị để theo dõi kết quả tiệt trừ H. pylori vì nồng độ kháng thể giảm xuống chậm sau điều trị (ít nhất là 6 tháng) - Phƣơng pháp thấm miễn dịch (immunoblot): Là phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch chống lại những kháng nguyên khác nhau của H. pylori. Kháng nguyên của vi khuẩn được phân tích bằng phương pháp điện di và được chuyển đến một màng nitrocellulose, sau đó được tiếp xúc với huyết thanh thử nghiệm mang kháng thể đặc hiệu. Căn cứ vào những vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể này có thể chẩn đoán những trường hợp dương tính với H. pylori. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn phương pháp ELISA nên có thể sử dụng khi kết quả ELISA nghi ngờ. Tuy vậy phương pháp này phức tạp nên chưa được áp dụng rộng [15]. * Phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên trong phân Phương pháp miễn dịch enzym phát hiện kháng nguyên H. pylori trong phân (EIA: Antigen Enzyme Immunoassay) được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trên lâm sàng từ những năm cuối của thập kỷ 90 [38], Phương pháp này rất thuận lợi cho các nghiên cứu dịch tễ học, nhất là ở trẻ em khi mà các phương pháp chẩn đoán thông qua nội soi và lấy máu gặp khó khăn [51]. Phương pháp này đặc biệt có giá trị khi cần nghiên cứu H. pylori ở trẻ em mới sinh và những năm đầu đời, khi chẩn đoán huyết thanh khó có thể phân biệt các kháng thể là của con hay từ mẹ sang con vẫn còn tồn tại. Độ chính xác của phương pháp này đạt trên 90% cả trước và sau điều trị [4], [38], [46], [47],. Những số liệu gần đây nhất cho thấy HpSA (H. pylori Stool Antogen) là phương pháp chẩn đoán H. pylori không can thiệp, chính xác, đơn giản, rẻ tiền, có thể sử dụng tốt cả trước và sau điều trị diệt trừ H. pylori. Phương pháp này có thể trở thành phương pháp chẩn đoán H. pylori lựa chọn trên lâm sàng cho nhiều mục đích nghiên cứu, từ các nghiên cứu dịch tễ đến các nghiên cứu nhi khoa, từ chiến lược sàng lọc trước nội soi đến việc theo dõi kết quả sau điều trị diệt trừ H. pylori [51]. 8 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 1.1.4.2. Các phƣơng pháp can thiệp * Nghiệm pháp Urease test nhanh Nguyên tắc cơ bản của urease test nhanh dựa vào đặc tính tiết men urease của H. pylori. Men này phân hủy urê, giải phóng hai phân tử amoniac và một phân tử carbondioxid. Mảnh sinh thiết được đặt vào lớp thạch có chứa urê và chất chỉ thị màu ở nhiệt độ phòng. Amoniac tự do được giải phóng sẽ làm tăng pH của môi trường và làm đổi màu của môi trường từ vàng sang đỏ trong vòng 1 giờ đầu. Độ đặc hiệu của test này cao và độ nhạy dao động từ 80 đến 95% [4], Một số yếu tố như mật độ vi khuẩn thấp, niêm mạc loạn sản ruột, sử dụng kháng sinh và PPIs trong thời gian gần ngày soi có thể gây ra phản ứng âm tính giả. Nếu đọc kết quả của test này chậm hơn 24 giờ cũng có thể có kết quả âm tính giả do một số loại khuẩn ở miệng hoặc ở ruột non cũng có thể sản xuất ra urê. Một số test urease nhanh sản xuất theo công nghệ sẵn có trên thị trường như CLO test ở Úc [40] hoặc Pyloritek sản xuất tại Hoa kỳ. Pyloritek cho kết quả nhanh hơn CLO test nhưng lại có nhược điểm bảo quản khó hơn do rất nhạy cảm với nhiệt độ cao. Test urease nhanh là test rất tiện lợi bởi nó cho kết quả chẩn đoán H. pylori nhanh ngay sau khi soi và là phương pháp có giá thành thấp. * Phƣơng pháp mô bệnh học Chẩn đoán mô bệnh học mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày là một trong những phương pháp chẩn đoán H. pylori thông dụng và đáng tin cậy nhất. Mảnh sinh thiết thường được lấy ở vùng hang vị, cách ống môn vị 1 đến 2 cm hoặc ở thân vị phía bờ cong lớn. Thường lấy ít nhất 2 mảnh sinh thiết vì H. pylori nằm rải rác ở hang vị dạ dày. Một số tác giả lấy sinh thiết cả ở hang vị và thân vị bởi vì đôi khi bệnh nhân sau dùng PPIs H. pylori có xu hướng chuyển đến định cư tại thân vị mà không còn tồn tại ở hang vị nữa. H. pylori được xác định qua cách nhuộm tiêu bản bằng Hematoxilin và Eosin [36]. Khi chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm chuẩn này gặp khó khăn, nhất là khi mật độ vi khuẩn thấp, có thể sử dụng thêm phương pháp nhuộm Giemsa cải tiến, 9 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 Cresyl tím violet nhanh hoặc nhuộm Warthin Starry, cho phép nhìn thấy vi khuẩn rõ hơn [24]. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này khoảng 9095% đối với người nhiều kinh nghiệm [4], [24], [36], Tuy nhiên kết quả của phương pháp chẩn đoán này có thể dao động đáng kể phụ thuộc vào kinh nghiệm của các nhà GPBL [36]. Phương pháp mô miễn dịch dựa vào các kháng thể đơn dòng, đa dòng hoặc phương pháp lai (hybridization) có thể được sử dụng để phân biệt H. pylori với các loại xoắn khuẩn khác như H. heilmannii, tuy các phương pháp này ít được sử dụng. Tính ưu việt chính của phương pháp mô bệnh học là nó luôn có sẵn ở các bệnh viện và cùng một lúc có thể chẩn đoán H. pylori và các tổn thương niêm mạc. Nhìn chung, phương pháp chẩn đoán này đáng tin cậy, sẵn có ở nhiều cơ sở y tế, nhưng tương đối đắt tiền, mất nhiều công sức và thời gian, đồng thời phụ thuộc vào người đọc kết quả. * Phƣơng pháp tế bào - nhuộm gram và soi kính hiển vi Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản, giá thành thấp, có thể thực hiện ở tất cả các phòng thí nghiệm. Mảnh sinh thiết được quệt trực tiếp lên lam kính, cố định và nhuộm gram. H. pylori được xác định là loại khuẩn gram âm, hình gậy cong hoặc chữ S đặc trưng. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn các phương pháp khác nên thường được sử dụng như một phương pháp bổ trợ cho phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn. * Phƣơng pháp nuôi cấy H. pylori là một trong những vi khuẩn khó nuôi cấy do mọc chậm và có đặc tính kị khí. H. pylori mọc ở điều kiện vi hiếu khí với tỷ lệ O2 là 5% và khí CO2 là 5-10%, trên môi trường thạch máu. Nuôi cấy H. pylori kéo dài 3 đến 5 ngày, nuôi cấy tốt nhất ở nhiệt độ 370C. Tất cả các chủng H. pylori mọc ở điều kiện nhiệt độ từ 33-400C và ở môi trường nuôi cấy có pH dao động 5,58,5 [24], [26]. Khuẩn lạc H. pylori có hình dạng hạt đầu đinh nhỏ, màu xám, trong suốt. Phân loại H. pylori dựa vào các đặc tính hình thái và sinh hoá như có các men urease, oxidase, catalase và glutamyl transpeptidase. Mục đích 10 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 chính của việc nuôi cấy H. pylori trên thực tế lâm sàng là để xác định độ nhạy cảm của H. pylori đối với thuốc kháng sinh. Độ đặc hiệu của phương pháp này rất cao 100%, tuy nhiên độ nhạy thấp hơn dao động từ 60% đến 90% phụ thuộc vào kinh nghiệm từng nơi [36]. Phương pháp này mất nhiều công sức nhưng là phương pháp thiết yếu để nghiên cứu loại khuẩn này và để làm kháng sinh đồ phục vụ cho vấn đề điều trị. Chủng H. pylori có thể bảo quản ở điều kiện 10% glycerol canh thang nuôi dưỡng (Nutrient Broth N2, Oxoid CM 67) ở nhiệt độ -700C hoặc trong nitơ lỏng (-1960C). Với phương pháp bảo quản này H. pylori có thể tồn tại sau 5 năm với tính ổn định và hoạt động sống hoàn hảo. * Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR) Đây là phương pháp khuếch đại chọn lọc một đoạn gen đích thành vô vàn bản sao để sau đó có thể phát hiện được. Đoạn gen đích này còn gọi là cặp mồi phải đặc trưng cho vi khuẩn. Việc chọn cặp mồi là hết sức quan trọng cho phương pháp chẩn đoán này. Một số gen đặc hiệu của H. pylori đã được lựa chọn khuyếch đại trong các phản ứng PCR như ureA, ureC, 16S rARN [15]. Ở Việt Nam các biến thể của gen HP1125 mang các trình tự gen khác nhau do đột biến trên các chủng H. pylori [10]. Phương pháp chẩn đoán này có thể thực hiện với mẫu bệnh phẩm là chủng H. pylori phân lập được hoặc trực tiếp từ mảnh sinh thiết. Mẫu bệnh phẩm được phân tích, giải phóng ra đoạn DNA đích. Sau đó quá trình khuếch đại gen được thực hiện nhờ cặp mồi gồm hai đoạn DNA đơn trái chiều nhau cùng với các chất xúc tác phản ứng tổng hợp của men Tag polymerase. Quá trình khuếch đại gen được thực hiện bằng 30-40 chu kỳ nhiệt và qua 3 giai đoạn khác nhau: giai đoạn tách các nucleotide (denaturation), giai đoạn bắt cặp (annealing) và giai đoạn kéo dài (elongation). Sau khi đã thu được sản phẩm khuếch đại khoảng trên 109 bản sao từ đoạn DNA đích ban đầu, gen này sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di trên thạch agarose 0,8%. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy phương pháp này có độ nhạy cao từ 91-97% [38], [49], [50]. Kỹ thuật này 11 Luận văn thạc sỹ Vũ Đức Nam – K16 cũng rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng H. pylori kháng thuốc thông qua việc xác định gen kháng thuốc [15], [37], [39]. So với phương pháp cấy khuẩn để xác định tính nhạy cảm của kháng sinh thì PCR cho kết quả nhanh và chính xác, dễ áp dụng trong thực hành lâm sàng hơn so với phương pháp nuôi cấy do nó có thể xác định gen kháng thuốc trực tiếp trên mảnh sinh thiết từ dạ dày [45], [54]. 1.2. Vấn đề điều trị trừH. pylori Gần 20 năm sau khi hình thành phác đồ chuẩn 3 thuốc dựa trên Clarithromycin để điều trị tiệt trừ H. pylori nhưng hiệu quả điều trị vẫn đang còn là một thách thức lớn ở nhiều quốc gia trên thế giới [28], [30],. 1.2.1. Các thuốc sử dụng để điều trị tiệt trừ H. pylori * Cở sở điều trị H. pylori là vi khuẩn gram âm tồn tại ở môi trường có nồng độ axit cao của dạ dày, do vậy việc lựa chọn kháng sinh thích hợp là quan trọng nhất để tiêu diệt loại vi khuẩn này. Chỉ có một số kháng sinh nhất định có thể hoạt động ở điều kiện pH thấp như ở dạ dày. Trong số các thuốc đạt hiệu quả diệt H. pylori tốt phải kể đến Amoxicillin, Clarithromycin, Metronidazole, Tetracyclin (có tác dụng toàn thân) và muối Bismuth và Furazolidone (có tác dụng tại chỗ trong lòng dạ dày). Ngoài kháng sinh ra, một số thuốc giảm tiết axit cũng được sử dụng kết hợp với để điều trị diệt H. pylori. * Tác động hiệp đồng của các thuốc trong các phác đồ diệt H. pylori Trên thực tế lâm sàng, người ta thấy rằng kết hợp kháng sinh với một thuốc ức chế tiết axit cho tỷ lệ diệt H. pylori rất cao. Một số kháng sinh không có tác dụng diệt khuẩn ở môi trường có pH thấp, mà chỉ phát huy tác dụng ở điều kiện pH gần bằng 5. Vì vậy muốn cho kháng sinh hoạt động tối ưu thì phải dùng kết hợp với một thuốc giảm tiết axit mạnh như PPIs để nâng pH dạ dày lên cao và kéo dài. Có rất nhiều nghiên cứu về tác động hiệp đồng giữa các kháng sinh và PPIs. Omeprazole với liều 20mg/ngày trong vòng 16-18 giờ có thể tăng pH lên 3, với liều 40mg/ngày chia 2 lần cách nhau 12 giờ sẽ 12
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan