Tài liệu Tổng hợp và nghiên cứu tính tương thích sinh học khả năng tạo mô xương của vật liệu composit poly (d, l) lactic axithydroxyapatit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Thanh Hoài TỔNG HỢP VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH TƢƠNG THÍCH SINH HỌC KHẢ NĂNG TẠO MÔ XƢƠNG CỦA VẬT LIỆU COMPOSIT POLY (D, L) LACTIC AXIT/HYDROXYAPATIT Chuyên ngành: Mã số : Hóa lí thuyết và Hóa lí 62440119 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Nguyễn Kim Ngà 2. PGS.TS. Hồ Phú Hà Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Kim Ngà và PGS.TS. Hồ Phú Hà. Hầu hết các số liệu, kết quả trong luận án là nội dung từ các bài báo đã và sắp được xuất bản của tôi và các thành viên của tập thể khoa học. Các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trần Thanh Hoài LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Kim Ngà và PGS.TS. Hồ Phú Hà đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành bản luận án. Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ và khích lệ của các cán bộ đồng nghiệp trong và ngoài bộ môn Hóa lý, Hóa Vô cơ-đại cương, Viện Kỹ thuật Hóa học, ĐH Bách Khoa Hà Nội. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Kỹ thuật Hóa học, ĐH Bách Khoa Hà Nội đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã động viên, khuyến khích tôi trong quá trình làm luận án Tác giả Trần Thanh Hoài MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU..................................................................................................................................... 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................................... 2 1.1. Xƣơng và các phƣơng pháp cấy ghép xƣơng ........................................................... 4 1.2. Các vật liệu chế tạo khuôn định dạng ....................................................................... 9 1.2.1. Polyme phân hủy sinh học ....................................................................................... 10 1.2.2. Vật liệu vô cơ có hoạt tính sinh học ........................................................................ 14 1.2.3. Composit.................................................................................................................. 16 1.3. Phƣơng pháp tổng hợp bột HAp ............................................................................. 20 1.4. Phƣơng pháp chế tạo khuôn định dạng composit .................................................. 28 1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học của vật liệu ..................................... 33 1.5.1. Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo apatit của vật liệu trong dung dịch SBF ... 33 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu sự phát triển, bám dính và di trú của tế bào trên vật liệu …………………………………………………………………………………….34 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM .............................................................................................. 38 2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................................. 38 2.1.1. Hóa chất ................................................................................................................... 38 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 39 2.2. Tổng hợp bột HAp ........................................................................................................ 39 2.2.1. Tồng hợp bột HAp sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 ....................................... 39 2.2.2. Tồng hợp bột HAp sử dụng chất hoạt động bề mặt CTAB ..................................... 40 2.3. Tổng hợp composit HAp/PDLLA ............................................................................... 41 2.3.1. Tổng hợp composit HAp/PDLLA với dung môi là 1,4-dioxan............................... 41 2.3.2. Tổng hợp composit HAp/PDLLA với dung môi là chloroform .............................. 42 2.4. Các phƣơng pháp xác định đặc trƣng ........................................................................ 43 2.4.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) ........................................................................ 43 2.4.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) .................................................................... 43 2.4.3. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) ................................................................ 43 2.4.4. Phương pháp EDS ................................................................................................... 44 2.4.5. Phương pháp đẳng nhiệt hấp phụ nitơ ..................................................................... 44 2.4.6. Phương pháp đo độ xốp của khuôn định dạng ........................................................ 45 2.5. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính của vật liệu ..................................................... 45 2.5.1. Xác định hoạt tính sinh học của bột nano HAp ....................................................... 45 2.5.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo apatit của khuôn định dạng ....................... 47 2.5.4. Phương pháp kiểm tra khả năng phát triển, bám dính của tế bào trên khuôn định dạng….. ............................................................................................................................. 47 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................... 50 3.1. Các kết quả nghiên cứu đặc trƣng, thành phần bột HAp tổng hợp ........................ 50 3.1.1. Các kết quả đặc trưng bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123............................................................................................... 50 3.1.2. Các kết quả đặc trưng bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt CTAB ............................................................................................ 65 3.2. Các kết quả nghiên cứu các đặc trƣng, hoạt tính và tính tƣơng thích sinh học của khuôn định dạng composit HAp/PDLLA .......................................................................... 75 3.2.1. Các kết quả nghiên cứu đối với khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi 1, 4-dioxan .................................................................................................. 75 3.2.2. Các kết quả nghiên cứu đối với khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi chloroform ................................................................................................... 92 KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 100 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN……………………...101 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………...102 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………………….113 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1. Các chữ viết tắt BMP Protein kích thích gen tạo xương- Bone morphogenetic protein CTAB Cetyltrimethyllammonium bromide DAPI 4’, 6-diamidino-2-phenylindol DCPA Dicalcium phosphate EDS Phổ tán sắc năng lượng tia X - Energy-dispersive X-ray spectroscopy FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier - Fourier Transform Infrared Spectroscopy HAp: Hydroxyapatit HT-PPFhm Poly(propylen fumarate) cao phân tử với nhóm hydroxy ở cuối chuỗi PDLLA Poly (D, L) lactic axit PLA Polylactic axit PLGA Poly(lactic-co-glycolic) axit PGA Poly(glycolic axít) PCL Poly(caprolactone) TTCP Tetracalcium phosphate SEM Hiển vi điện tử quét - Scanning Electron Microscopy SBF Dung dịch mô phỏng dịch cơ thể người – Simulated Body Fluid XRD Nhiễu xạ tia X - X-Ray Diffraction β-TCP β-tricalcium phosphate 2. Các ký hiệu P123: Pluronic co-polyme PEO20-PPO70-PEO20 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1.Các loại vật liệu dùng trongchữa trị tái tạo xương [119] ............................................. 5 Hình 1.2. Các nguyên tắc chung của kỹ thuật mô[87, 88] .......................................................... 6 Hình 1.3. Sự polyme hóa tạo polyme (D,L) lactic axit [48] ..................................................... 11 Hình 1.4. Mối quan hệ giữa độ nhớt của dung dịch PDLLA và khối lượng phân tử [56] ........ 12 Hình 1.5. Mô hình cấu trúc tinh thể HAp [70]......................................................................... 15 Hình 1.6. Các hình thái tinh thể HAp có thể tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt ............. 22 Hình 1.7. Ảnh hưởng của chế độ nhiệt đến hình thái hạt HAp [112] ....................................... 24 Hình 1.8. Sự kết tinh trong quá trình thủy nhiệt bao gồm bước hình thành mầm và bước phát triển mầm thanh tinh thể [36] .................................................................................................... 25 Hình 1.9. Ảnh SEM của bột HAp tổng hợp với thời gian thủy nhiệt khác nhau ở 200oC: 24 giờ (a), 48 giờ(b), 72 giờ (c)[21]...................................................................................................... 25 Hình 1.10. Ảnh hưởng của kích thước hạt tạo lỗ parafin đến kích thước lỗ xốp của khuôn định dạng polyme PLLA: .................................................................................................................. 30 Hình 1.11. Nguyên tắc của phương pháp AlamarBlue ............................................................. 35 Hình 1.12. Nguyên tắc của kính hiển vi laze đồng tiêu ............................................................ 36 Hình 1.13. Hình ảnh tế bào gan chuột qua kính hiển vi laze đồng tiêu .................................... 37 Hình 2.1. Quy trình tổng hợp bột HAp có sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 ..................... 40 Hình 2.2. Quy trình tổng hợp bột HAp có sử dụng chất hoạt động bề mặt CTAB .................. 41 Hình 2.3. Quy trình tổng hợp khuôn định dạng composit HAp/PDLLA ................................. 42 Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm in-vitro thử hoạt tính của khuôn định dạng ............................ 48 Hình 3.1. Các ảnh SEM của các mẫu bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với các nồng độ chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0 g P123, (b) 1 g P123, (c) 2 g P123, (d) 3 g P123 ........................................................................................................................................ 51 Hình 3.2. Sự phân bố kích thước hạt nano HAp trong bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với các nồng độ chất hoạt động bề mặt P123 là 2 g ................................................. 52 Hình 3.3. Giản đồ XRD của mẫu bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123: (a) 0P123, (b) 1P123 và (c) 2P123 .................................... 53 Hình 3.4. Phổ FTIR của bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0P123, (b) 1P123, (c) 2P123 ................................ 53 Hình 3.5. Phổ EDS của bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123là 2 g .............................................................................................. 54 Hình 3.6. Đường đẳng nhiệt hấp phụ và nhả hấp phụ nitơ của các mẫu bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0P123, (b) 1P123, (c) 2P123 ..................................................................................................... 56 Hình 3.7. Đường phân bố kích thước lỗ trên hạt nano HAp của các mẫu tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau ...................... 56 Hình 3.8. Ảnh SEM của mẫu HAp tổng hợp không qua xử lý nhiệt ........................................ 57 Hình 3.9. Cơ chế có thể xảy ra trong quá trình tạo nano HAp: (a) không có mặt chất hoạt động bề mặt P123, (b) Có mặt chất hoạt động bề mặt P123 .............................................................. 58 Hình 3.10. Hình ảnh SEM (với độ phóng 1000 và 10,000 lần) của màng composit HAp/PDLLA được tổng hợp từ các mẫu nano HAp khác nhau: (a1), (a2) mẫu F-0P, (b1), (b2) mẫu F-1P, (c1), (c2) mẫu F-2P .................................................................................................. 59 Hình 3.11. Ảnh SEM (với độ phóng đại 250 và 25,000 lần) của màng HAp/PDLLA sau khi ngâm trong SBF 1 và 7 ngày ..................................................................................................... 62 Hình 3.12. Phân tích EDS của mẫu F-2P sau khi ngâm trong dung dịch SBF: (a) sau 1 ngày ngâm, (b) sau 7 ngày ngâm........................................................................................................ 63 Hình 3.13. Ảnh SEM của các mẫu bột HAp được tổng hợp với các hàm lượng khác nhau của chất hoạt động bề mặt CTAB .................................................................................................... 66 Hình 3.14. Ảnh SEM của các mẫu bột HAp được tổng hợp với hàm lượng CTAB 0,64 gam và các khoảng thời gian thủy nhiệt khác nhau 6 giờ (a), 12 giờ (b), 18 giờ (c) ............................. 67 Hình 3.15. Khảo sát sự phân bố chiều dài hạt nano HAp tổng hợp với 0,64 g CTAB và thủy nhiệt trong 12 giờ ...................................................................................................................... 68 Hình 3.16. Phổ EDS của mẫu nano HAp tổng hợp với 0,64 g CTAB và thủy nhiệt trong 12 giờ .............................................................................................................................................. 68 Hình 3.17. Phổ FTIR của các mẫu HAp tổng hợp với hàm lượng CTAB khác nhau: 4,64 g (a), 1,64 g (b), 0,64g (c) ................................................................................................................... 70 Hình 3.18. Giản đồ XRD của các mẫu HAp tổng hợp với hàm lượng CTAB khác nhau: 0,64 g (a), 1,64 g (b), 4,64 g (a) ............................................................................................................ 70 Hình 3.19. Cơ chế có thể xảy ra trong quá trình tạo nano HAp: (a) Khi có mặt chất hoạt động bề mặt CTAB, (b) Sự kết tụ của các hạt mixen dưới tác động của nhiệt độ ............................. 71 Hình 3.20. Ảnh SEM của màng HAp/PDLLA (được phủ bột HAp có thời gian thủy nhiệt 12 giờ) trước và sau khi ngâm trong SBF 3 và 7 ngày: a, c, f là độ phóng đại 1000 lần; b, d, g, e, h là độ phóng đại 5000, 10000, 20000, 50000 lần........................................................................ 74 Hình 3.21. Ảnh khuôn định dạng composit HAp/PDLLA được tổng hợp bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt sử dụng dung môi 1,4-dioxan: (a) mẫu S3 có tỷ lệ HAp là 20%, (b) mẫu S4 có tỷ lệ HAp là 30% ............................................................................................................. 75 Hình 3.22. Ảnh mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA (mẫu S3) với độ phân giải cao 200 px và 100 px ....................................................................................................................... 76 Hình 3.23. Ảnh SEM của khuôn định dạng được tổng hợp với các tỷ lệ HAp khác nhau: (a1, a2) mẫu S1, (b1, b2) mẫu S2, (c1, c2) mẫu S3, (d1, d2) mẫu S4 với độ phóng đại 200 và 2000 lần .............................................................................................................................................. 77 Hình 3.24. Sự phân bố kích thước lỗ của các mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA . 79 Hình 3.25. Phổ FTIR của các mẫu: (a) mẫu bột HAp, (b) mẫu S3, (c) mẫu S4, (d) mẫu S1 ... 80 Hình 3.26. Mô hình liên kết hydro giữa nhóm OH của HAp và nhóm CO của PDLLA ......... 81 Hình 3.27. Phổ EDS của mẫu S4 .............................................................................................. 81 Hình 3.28. Ảnh SEM của mẫu khuôn định dạng S3, S4 sau khi ngâm trong SBF 5 và 7 ngày: a1, a3, b1 là độ phóng đại 5000 lần, a2, a4, b2 là độ phóng đại 50000 lần ............................... 83 Hình 3.29. Ảnh SEM (độ phóng đại 10000 và 15000 lần) của mẫu S1, S2 sau khi ngâm trong SBF 5 và 7 ngày ........................................................................................................................ 84 Hình 3.30. Phổ EDS của mẫu khuôn định dạng S3 sau 5 ngày ngâm trong SBF ..................... 85 Hình 3.31. Cơ chế hình thành lớp apatit giống xương trên khuôn định dạng composit Hap/PDLLA trong dung dịch SBF (quá trình hình thành từ a đến f)[64]. ................................ 86 Hình 3.32. Khả năng phát triển của tế bào MG63 trong môi trường chứa các mẫu khuôn định dạng được tổng hợp với dung môi 1,4-dioxan (S1, S2, S3 và S4) sau 3, 5 và 7 ngày .............. 88 Hình 3.33. Sự bám dính và phát triển của tế bào MG63 trên khuôn định dạng (S1, S2, S3 và S4) sau 5 và 7 ngày .................................................................................................................... 90 Hình 3.34. Ảnh SEM của các mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA được tổng hợp với dung môi chloroform (F1, F2 và F3): a1, b1, c1 là ảnh với độ phóng đại X 200; a2, b2, c2 là ảnh với độ phóng đại X500.................................................................................................... 93 Hình 3.35. Giản đồ XRD của mẫu khuôn định dạng PDLLA và HAp/PDLLA sử dụng dung môi chloroform .......................................................................................................................... 94 Hình 3.36. Đồ thị so sánh độ xốp và kích thước lỗ của các khuôn định dạng tổng hợp sử dụng dung môi chloroform với tỷ lệ HAp khác nhau ......................................................................... 95 Hình 3.37. Khả năng tồn tại phát triển của tế bào MG63 trong môi trường có các khuôn định dạng được tổng hợp với dung môi chloroform (F1, F2 và F3) sau 3, 5 và 7 ngày .................... 97 Hình 3.38. Sự bám dính và phát triển của tế bào MG63 trên khuôn định dạng (F1, F2 và F4) sau 5 và 7 ngày .......................................................................................................................... 98 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần của xương [65] ........................................................................................ 4 Bảng 1.2. Tính chất của polyme (D,L) lactic axit [56] ............................................................. 11 Bảng 1.3. Một số composit tạo khuôn định dạng đã được nghiên cứu ..................................... 18 Bảng 1.4. Một số composit HAp/polyme đã được chế tạo ....................................................... 19 Bảng 1.5. Ưu nhược điểm của một số phương pháp tổng hợp HAp ......................................... 27 Bảng 1.6. Tổng hợp một số phương pháp sử dụng để tạo khuôn định dạng............................. 32 Bảng 2.1. Thành phần trong 1000 ml SBF có pH = 7,4 [69] .................................................... 46 Bảng 3.1. Một số đặc điểm của các mẫu bột HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123.............................................................................................. 51 Bảng 3.2. Thành phần các nguyên tố trong mẫu bột HAp (2P123) .......................................... 55 Bảng 3.3. Tỷ lệ Ca/P trong các mẫu bột HAp được tổng hợp với hàm lượng P123 khác nhau55 Bảng 3.4. Đặc trưng bề mặt của các mẫu bột nano HAp tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau ................................................... 56 Bảng 3.5. Tỉ lệ Ca/P của các mẫu sau khi ngâm trong SBF ..................................................... 63 Bảng 3.6. So sánh khả năng tạo khoáng của mẫu HAp tổng hợp trong luận án với các mẫu HAp đã được công bố ................................................................................................................ 64 Bảng 3.7. Một số đặc trưng và hình thái học của các mẫu bột HAp tổng hợp với các hàm lượng khác nhau của chất hoạt động bề mặt CTAB .................................................................. 66 Bảng 3.8. Tỷ lệ các nguyên tố trong mẫu nano HAp tổng hợp với 0,64 g CTAB và thủy nhiệt trong 12 h ................................................................................................................................... 69 Bảng 3.9. Tỷ lệ Ca/P của các mẫu nano HAp tổng hợp với hàm lượng CTAB khác nhau ...... 69 Bảng 3.10. So sánh hình thái hạt nano HAp của hai mẫu 2P123 và CT(12) ............................ 75 Bảng 3.11. Thành phần và kích thước lỗ xốp của các mẫu khuôn định dạng ........................... 78 Bảng 3.12. Độ xốp của các mẫu khuôn định dạng tổng hợp với dung môi 1,4-dioxan ............ 82 Bảng 3.13. Thành phần các nguyên tố trong lớp apatit trên mẫu S3 sau khi ngâm trong SBF 86 Bảng 3.14. So sánh khả năng tạo apatit của mẫu khuôn định dạng tổng hợp được với các vật liệu khác đã công bố .................................................................................................................. 88 Bảng 3.15. Thành phần và kích thước lỗ xốp của các mẫu khuôn định dạng tổng hợp với dung môi chloroform .......................................................................................................................... 94 Bảng 3.16. Độ xốp của các khuôn định dạng tổng hợp sử dụng hai dung môi khác nhau chloroform và 1, 4-dioxan ......................................................................................................... 95 MỞ ĐẦU Các tổn thương về xương đang gia tăng bởi sự già hóa dân số, tai nạn giao thông và sự xuất hiện nhiều môn thể thao mạo hiểm dễ gây ra các chấn thương. Trong các bệnh về xương thì tỷ lệ bệnh cần ghép xương đang gia tăng đáng kể. Thay thế xương là một giải pháp tối ưu trong điều trị sửa chữa các vùng bị phá hủy hay các mô nhiễm bệnh do hoại tử, dị tật, thoái hóa, ung thư hay vì mục đích thẩm mỹ [52]. Các phương pháp ghép xương hiện nay đang được sử dụng là phương pháp ghép xương tự thân, ghép xương đồng loại , ghép xương dị loại và kỹ thuật mô xương. Mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm riêng, trong đó kỹ thuật mô xương là một phương pháp mới đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Trong kỹ thuật mô xương, vật liệu có hoạt tính sinh học được chế tạo dưới dạng khuôn định dạng 3D. Khuôn định dạng (scaffold) là khuôn tạm thời để tế bào bám dính, sinh trưởng, phát triển và hình thành khung ngoại bào trong quá trình hình thành cấu trúc mô mới [59,107]. Khuôn định dạng có thể được chế tạo từ các vật liệu polyme phân hủy sinh học, vật liệu vô cơ có hoạt tính sinh học hoặc composit. Vật liệu polyme phân hủy sinh học và vật liệu vô cơ đã được nghiên cứu nhiều. Nhưng vật liệu polyme thường thiếu nhóm chức có hoạt tính sinh học, tính chất cơ học kém, còn vật liệu vô cơ sinh học thì cứng nhưng giòn. Vì vậy, vật liệu composit với sự liên kết của vật liệu gốm sinh học và polyme, được xem là phương pháp hiệu quả để tăng cường hoạt tính sinh học và tính chất cơ học của khuôn định dạng. Vật liệu vô cơ có thành phần tương tự thành phần khoáng trong xương là hydroxyapatit (HAp). HAp có tính tương thích sinh học, hoạt tính sinh học cao. Chính vì vậy, vật liệu composit HAp/polyme đang thu hút các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển để tạo ra khuôn định dạng có những tính chất gần giống với xương người. Hiện nay, trên thế giới, vật liệu composit HAp/polyme ứng dụng trong kỹ thuật mô xương đã được nghiên cứu rất nhiều và thử nghiệm trên động vật. Ở trong nước, đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về vật liệu composit ứng dụng trong kỹ thuật mô xương. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:’’Tổng hợp và nghiên cứu tính tương thích sinh học khả năng tạo mô xương của vật liệu composit poly (D, L) lactic axit/hydroxyapatit’’. Mục tiêu của luận án: 1 Nghiên cứu tổng hợp vật liệu composit sinh học gồm hydroxyapatit và polyme sinh học (PDLLA) nhằm mục đích tạo ra vật liệu có khả năng tương hợp sinh học, kích thích sự phát triển xương để có thể ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương. Nội dung nghiên cứu của luận án: Để hoàn thành mục tiêu đề ra, luận án bao gồm các nội dung nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu tổng hợp bột HAp kích thước nano bằng phương pháp thủy nhiệt có bổ sung hai chất hoạt động bề mặt khác nhau là CTAB và P123. Trong đó, luận án nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước, hình dạng của tinh thể HAp như: - Ảnh hưởng của nồng độ chất hoạt động bề mặt. - Ảnh hưởng của thời gian thủy nhiệt. Từ các mẫu bột HAp tổng hợp được ở các điều kiện khác nhau, luận án thực hiện đánh giá hoạt tính sinh học của bột HAp bằng thí nghiệm in-vitro ngâm trong dung dịch SBF. 2. Nghiên cứu chế tạo khuôn định dạng composit HAp/PDLLA bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt. Trong đó, luận án nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc vi mô của khuôn định dạng như: - Ảnh hưởng của tỷ lệ HAp/PDLLA. - Ảnh hưởng của dung môi sử dụng là chloroform và 1,4-dioxan. Từ các mẫu khuôn định dạng chế tạo được, luận án thực hiện đánh giá hoạt tính sinh học của các khuôn định dạng bằng thí nghiệm in-vitro ngâm trong dung dịch SBF và tính tương thích sinh học của khuôn định dạng bằng thí nghiệm in-vitro với tế bào MG63. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án: Luận án đã tập trung nghiên cứu tổng hợp bột HAp có kích thước nano và chế tạo vật liệu composit HAp/PDLLA cấu trúc 3D có lỗ xốp ứng dụng trong kỹ thuật mô xương. Các kết quả đạt được đã có những đóng góp mới sau: - Luận án đã tổng hợp thành công bột nano HAp bằng phương pháp thủy nhiệt có sử dụng hai chất hoạt động bề mặt khác nhau là P123 và CTAB. Bột HAp tổng hợp được (đường kính trung bình 28 nm chiều dài trung bình 120 nm, tỷ lệ Ca/P là 1,66) có kích thước tương tự kích thước khoáng xương tự nhiên và thể hiện hoạt tính sinh học cao khi ngâm trong dung dịch SBF. Lớp apatit được hình thành trong thời gian ngắn sau 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF, hình thái lớp apatit tạo thành đặc trưng cho lớp apatit giống xương. 2 - Luận án đã chế tạo thành công khuôn định dạng composit HAp/PDLLA có cấu trúc 3D xốp, bằng phương pháp đổ dung môi rửa hạt với chất tạo lỗ là NaCl và sử dụng hai dung môi khác nhau là 1,4-dioxan và chloroform. Khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp được có độ dày 2 mm, độ xốp cao > 70% với kích thước lỗ xốp dao động trong khoảng 117-254 µm. Các mẫu khuôn định dạng đều có khả năng tương thích sinh học với tế bào MG63. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Xƣơng và các phƣơng pháp cấy ghép xƣơng Xương là mô liên kết chính trong cơ thể và giữ một số các chức năng quan trọng. Chức năng chính của xương là nâng đỡ cơ thể, bảo vệ các cơ quan sống trong hộp sọ, cột sống và lồng ngực; là nơi cho dây chằng, cơ bám giúp cơ thể có thể vận động và di chuyển; là nơi sản sinh ra máu và kiểm soát nồng độ canxi và photpho trong máu [147]. Thành phần chính của xương gồm có 69 % canxi photpho (chủ yếu là hydroxyapatit), 21 % collagen, 9 % nước và 1 % các thành phần khác [65] (Bảng 1.1). Xương là một composit tự nhiên có thành phần chính là gốm (hydroxyapatit) và polyme (collagen) với cấu trúc vi mô phức tạp đã tạo nên tính chất cơ học cao khó có thể bắt chước [65]. Bảng 1.1. Thành phần của xương [65] Thành phần Tỷ lệ Hydroxyapatit 69 % Thành phần hữu cơ 22% Collagen 90 – 96 % thành phần hữu cơ Các phần khác 4 – 10 % thành phần hữu cơ Nước 9% Xương là mô cứng có khả năng tự tái tạo và sửa chữa trong một số trường hợp bị gãy hay tổn thương mà không để lại sẹo. Tuy nhiên, trong trường hợp tổn thương do bệnh lý hay các tổn thương quá lớn, xương không thể tự liền và tự sửa chữa. Chính vì vậy, phương pháp cấy ghép xương là giải pháp tôi ưu để thay thế phần bị tổn thương và hỗ trợ quá trình tái tạo xương. Sự lựa chọn phương pháp cấy ghép xương phụ thuộc vào các yếu tố như khả năng phát triển của mô, kích thước mô tổn thương, kích thước, hình dạng, thể tích mảnh ghép, các đặc điểm cơ sinh, quy trình xử lý mảnh ghép, giá thành, các đặc điểm sinh học và các biến chứng có liên quan [16]. Phương pháp cấy ghép xương có thể được chia làm các loại chính sau: phương pháp ghép xương đồng loại (allograft), phương pháp ghép xương tự thân (autograft), phương pháp ghép dị loại (xenograft). Phương pháp ghép xương tự thân (autograft): là phương pháp lấy xương từ chính cơ thể bệnh nhân (xương ở hông, xương hàm, xương sọ v.v.) để ghép vào phần xương bị tổn 4 thương [35],[63]. Phương pháp này có ưu điểm mô ghép là của chính cơ thể bệnh nhân nên không gây ra các phản ứng miễn dịch đào thải mô ghép và thời gian liền vết thương nhanh. Tuy nhiên, phương pháp này khiến bệnh nhân phải chịu đau nhiều do phải phẫu thuật hai lần và số lượng có hạn. Trong trường hợp vùng tổn thương lớn, phần xương tự thân thu gom được không đủ cho chỗ cần ghép thì cần phải dùng phương pháp ghép xương khác [8]. Xƣơng tự thân Hình 1.1.Các loại vật liệu dùng trongchữa trị tái tạo xương [119] Phương pháp ghép xương đồng loại (allograft): là phương pháp lấy mô ghép từ người hiến tặng và được xử lý an toàn tuyệt đối cho việc ghép xương [8]. Phương pháp này có ưu điểm là bệnh nhân không phải phẫu thuật nhiều lần, mô ghép có nhiều đặc tính tương đồng với xương tự thân. Tuy nhiên, phương pháp này gây ra các phản ứng miễn dịch đào thải mô ghép, số lượng mô ghép hạn chế, tính chất cơ học của vật liệu giảm 50% trong quá trình xử lý mô trước khi cấy ghép và chi phí cao [139]. Phương pháp ghép xương dị loại (xenograft): là phương pháp lấy mô ghép từ loài khác như từ động vật, thực vật [63]. Mô ghép thường được dùng phổ biến là san hô và xương bò. 5 Phương pháp này có ưu điểm về chi phí và số lượng mô đa dạng. Tuy nhiên, cũng giống như phương pháp sử dụng mô ghép đồng loại, phương pháp này thường gây ra các phản ứng miễn dịch đào thải mô ghép, tính chất của vật liệu thay đổi trong quá trình xử lý mô trước khi cấy ghép [63] . Để khắc phục các nhược điểm trên, kỹ thuật mô xương đã được phát triển. Trong kỹ thuật mô, khuôn định dạng được thiết kế phù hợp với vị trí cấy ghép và có thể được bổ sung các tác nhân kích thích phát triển cùng với tế bào tạo xương của bệnh nhân. Chính vì vậy, kỹ thuật mô xương sẽ cải thiện sự liên kết giữa mô ghép và cơ thể, kích thích tái tạo xương. Tác nhân kích thích phát Tế bào triển Thiết bị phản Khuôn định Có tính chất cơ học thích hợp dạng Có tính tương thích sinh học ứng sinh học Có cấu trúc thích hợp Nuôi cấy in-vitro Nuôi cấy in-vivo Kích thích hoạt tính của khuôn Kiểm tra sự bám dính, phát triển và biệt hóa của tế bào Kiểm tra sự phân hủy của khuôn Kiểm sự phát triển tạo mô Hình 1.2. Các nguyên tắc chung của kỹ thuật mô[87, 88] Khuôn định dạng (scaffold) là khuôn tạm thời để tế bào bám dính, sinh trưởng, phát triển và hình thành khung ngoại bào phục vụ cho việc tạo thành cấu trúc mô mới [108]. Quá trình nuôi cấy tế bào trên khuôn định dạng được thực hiện bằng thí nghiệm in-vitro để hoạt hóa tế bào. Sau đó, khuôn định dạng sau khi nuôi cấy với tế bào được cố định vào các phần bị tổn thương trong cơ thể như xương, sụn hay phần mô mềm [121]. Quá trình tái tạo mô tự nhiên trong khuôn định dạng bao gồm hai quá trình xảy ra song song đó là sự xâm nhập, phát 6 triển của mạch máu vào trong cấu trúc khuôn và sự phát triển của các mô mới, đồng thời khuôn bị phân hủy dần dần [118]. Hình 1.2 là sơ đồ mô tả các nguyên tắc chung của kỹ thuật mô [119]. Khuôn định dạng dùng trong kỹ thuật mô nói chung cần có tính chất như sau: Tính tương thích sinh học: Khả năng tương thích sinh học là tính chất quan trọng nhất để phân biệt vật liệu sinh học với các vật liệu khác [57]. Tính tương thích sinh có thể được định nghĩa là khả năng của vật liệu tương thích với các đáp ứng trên vật chủ. Điều đó có nghĩa là vật liệu có thể tồn tại trong cơ thể người mà không gây ra các phản ứng miễn dịch [41]. Một khuôn định dạng được sử dụng trong tái tạo mô xương thì khả năng tương thích sinh học của nó là một tính chất quan trọng cần có. Khi một khuôn định dạng được đặt vào cơ thể sống thì một xu hướng tự nhiên là cơ thể sống sẽ phản ứng lại với vật thể lạ này [41]. Có rất nhiều phản ứng xuất hiện trên bề mặt giữa khuôn định dạng với phần mô được cấy như phản ứng viêm, phản ứng sưng… Các phản ứng này phụ thuộc vào đặc tính của vật liệu như thành phần hóa học của vật liệu, cấu trúc, hình thái, khả năng kết tinh, khả năng thấm ướt, tính đàn hồi và độ xốp của khuôn định dạng [41]. Để tạo ra khuôn định dạng cho kỹ thuật mô thì cần phải hiểu rõ cơ chế của các phản ứng tương tác giữa bề mặt mô và vật liệu để từ đó điều khiển các phản ứng này và tối ưu các đặc điểm của vật liệu. Vì vậy, khả năng tương thích sinh học của vật liệu cần được đánh giá qua các thử nghiệm sinh học. Các hoạt tính sinh học bề mặt: Thành phần hóa học của bề mặt khuôn định dạng liên quan đến khả năng bám dính của tế bào. Sự bám dính ban đầu đóng vai trò quan trọng đến sự sống của tế bào [23]. Sự phát triển và biệt hóa của tế bào chỉ xuất hiện sau khi tế bào bám lên được khuôn định dạng. Khi một khuôn định dạng được cấy vào trong cơ thể, tế bào sẽ bám lên bề mặt khuôn định dạng thông qua các phân tử sinh học được gọi là các thụ thể bề mặt tế bào. Các thụ thể bề mặt có thể được hấp phụ lên bề mặt khuôn định dạng khi khuôn định dạng có các tính chất hóa học thích hợp [23]. Các thụ thể kết nối tế bào có thể truyền tín hiệu hóa sinh giữa các phần ngoại bào và nội bào. Tính ưa nước hay khả năng thấm ướt phụ thuộc vào thành phần hóa học trên bề mặt khuôn định dạng và ảnh hưởng đến sự bám dính của tế bào [90]. Các tế bào sau khi gắn được lên bề mặt sẽ giãn và di chuyển đến vị trí thích hợp hơn để đảm bảo cho sự cố định chắc chắn và sự phát triển của tế bào sau này. Không chỉ thành phần hóa học mà cả hình thái trên bề mặt 7 khuôn định dạng cũng ảnh hưởng đến các thích ứng của tế bào với vật liệu như sự bám dính, sự di cư và sự phát triển của tế bào [116]. Các tính chất cơ học và cấu trúc vật liệu: Cấu trúc 3D của khuôn định dạng phải có độ xốp cao, các lỗ xốp có độ liên thông cao. Các nghiên cứu cho thấy với kích thước lỗ tối thiểu là 100 µm là thích hợp cho tế bào di chuyển và quá trình trao đổi chất giữa tế bào với môi trường [87]. Các đặc điểm cấu trúc của khuôn định dạng phụ thuộc vào phương pháp chế tạo. Độ xốp và độ liên thông giữa các lỗ xốp là những thông số quan trọng của khuôn định dạng bởi chúng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình vận chuyển dinh dưỡng, khí và các chất thải của quá trình trao đổi chất phục vụ cho hoạt động sống của tế bào [87]. Kuboki (1998) nhận thấy độ xốp của khuôn định dạng là yếu tố quyết định sự hình thành xương khi thực hiện thí nghiệm trên vật liệu hydroxyapatit đặc và có lỗ xốp [74]. Trên vật liệu hydroxyapatit với cấu trúc xốp, xương mới được hình thành sau 2 tuần, trong khi đó trên vật liệu này với cấu trúc đặc, không có xương mới tạo thành [74]. Độ xốp tăng sẽ tạo thuận lợi cho quá trình khuếch tán các chất dinh dưỡng và khí do đó sẽ thúc đẩy sự phát triển của tế bào. Trong các thí nghiệm in-vivo với các khuôn định dạng poly(L-lactic-co-D,L lactic)/β-tricanxi photphat có độ xốp từ 80-88% cũng cho kết quả tương tự, sự phát triển của các mô xuất hiện ở vùng có độ xốp cao hơn [167]. Hơn nữa, kích thước lỗ cũng rất quan trọng bởi nó ảnh hưởng đến sự tương tác của tế bào. Nếu kích thước quá nhỏ, nó sẽ ngăn cản sự di chuyển của tế bào, sự phát triển khuôn ngoại bào và sự phân bố các mạch máu [4]. Nghiên cứu trước đây cho thấy, kích thước lỗ to hơn 300 µm có tỉ lệ tái tạo xương và sự phân bố mạch cao [146]. Kết quả thí nghiệm in-vitro trên mẫu khuôn định dạng hydroxyapatit có độ xốp 70%, kích thước lỗ 800 µm và mẫu có độ xốp 60%, kích thước lỗ 400 µm cho thấy mẫu có độ xốp 60%, kích thước lỗ 400 µm cho kết quả tốt hơn. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm in-vivo chỉ ra rằng khuôn có độ xốp 70% , kích thước lỗ 800 µm có sự hình thành xương tốt hơn. Mặc dù, kết quả khác nhau trong hai thí nghiệm in-vivo và in-vitro nhưng điều này cho ta thấy ảnh hưởng của độ xốp và kích thước lỗ đến sự phát triển của tế bào và sự tái tạo mô [81]. Các nghiên cứu khác cho thấy kích thước lỗ và độ xốp tối ưu cho sự tái tạo mô phụ thuộc vào từng giai đoạn tái tạo. Ở giai đoạn đầu là giai đoạn tế bào bắt đầu bám dính và phát triển trên khuôn định dạng, kích thước lỗ tối ưu cho sự phát triển của các tế bào tạo xương là 100-350 µm. Khi số lượng tế bào tăng lên, tế bào cần 8