Tài liệu Tổng hợp dẫn xuất của flavonoid (rutin, quercetin, hesperidin, hesperetin) và xác định hoạt tính sinh học của chúng

MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪVIẾT tắt DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC Đ ồ THỊ DANH MỤC CÁC s ơ Đ ồ MỞ ĐẦU 1 CHUÔNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1- CẤU TRÚC VÀ PHÂN LOẠI CÁC FLAVONOIT 4 1.2- HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOIT 7 1.2.1- Vai trò của flavonoit đối với cây cỏ 1.2.2- Tính chất dược lý của flavonoit 1.2.2.1 - Khả năng kháng oxy hóa của flavonoit 1.2.2.2- Tác nhân chống ung thư 1.2.2.3- Khả năng kháng viêm 1.2.2.4- Vai trò trong phòng ngừa và điều trị bệnh tim 1.2.2.5- Flavonoit ức chế các enzim 1.2.2.6- Các hoạt tính khác của flavonoit 7 8 8 8 9 10 10 10 1.3- NHŨNG NGHIÊN c ú u TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1- Tinh hình nghiên cứu tổng hợp các flavonoit 1.3.1.1- Các phản ứng tổng hợp dựa trên cấu trúc ban đầu của flavonoit 1.3.1.2- Tổng hợp toàn phần 1.3.1.3- Một số hợp chất tổng hợp có khả năng kháng tế bào ung thư 1.3.2- Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học 10 10 10 1.3.2.1- Tổng quan chung về các lý thuyết nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học 1.3.2.2- Các nghiên cứu về mối quan hệ giữa các flavonoit và các dẫn xuất với hoạt tính sinh học 14 17 18 18 21 1.3- XÁC ĐỊNH ĐÔÌ TƯỢNG NGHIÊN c ú ư 1.3.1- Hoa hòe và rutin 1.3.2- Quercetin 1.3.3- Vỏ quýt và hesperidin 1.3.4- Hesperetin 22 23 24 25 26 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 28 2.1- NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT 28 2.2- PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RUTIN TỪ HOA HÒE VÀ 29 HESPERIDIN TỪVỎ QUÝT 2.3- PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN RUTIN VÀ HESPERIDIN 29 2.4- PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC DAN x u ấ t FLAVONOIT 29 2.5- PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 30 2.6- PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤư TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP 31 CHẤT 2.7- CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC 31 2.7.1 - Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa 31 2.7.1.1 - Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH 31 2.7.1.2- Xác định sản phẩm của quá trình peroxi hóa lipit 32 2.7.2- Phương pháp xác định khả năng kháng nấm, kháng khuẩn 2.7.3- Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRB 2.7.4- Thử nghiệm khả năng gây apoptosis (chết theo chương trình) theo phương pháp xác định hiện tượng ADN phân mảnh 2.7.5- Phương pháp xác định mật độ điện tích và hệ số phân bố dầu/nước 2.7.6- Phương pháp xác định mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học QSAR 32 33 34 CHƯƠNG 3: THỤC NGHIỆM 38 3.1- XỬLÝ NGUYÊN LIỆU 38 3.2- CHIẾT FLAVONOIT TỪ NGUYÊN LIỆU-THỦY PHÂN TẠO 35 35 38 DẪN XUẤT 3.3- TỔNG HỢP CÁC DAN x u ấ t của QUERCETIN 40 3.3.1- Tổng họp các dẫn xuất este của quercetin 40 3.3.2- Tổng hợp các dẫn xuất ete của quercetin 43 3.4- TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA HESPERIDIN 46 3.5- TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA HESPERETIN 48 3.5.1- Tổng hợp các dẫn xuất este của hesperetin 48 3.5.2- Tổng hợp các dẫn xuất chalcon từ hesperetin 3.5.3- Tổng hợp các dẫn xuất chứa halogen của hesperetin 50 51 3.6- THỬNGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 52 3.6.1 - Khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH 3.6.2- Xác định sản phẩm của quá trình peroxi hóa lipit 52 53 3.7- XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN 54 3.8- THỬNGHIỆM KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO 55 3.9- THỬNGHĨỆM KHẢ NĂNG GÂY APOPTOSIS 57 3.10- XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HÊ ĐỊNH LUÖNG GIŨA CAU TRÚC 58 VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC QSAR CHUÔNG 4: KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1- XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HÖP CHAT FLAVONOIT VÀ 59 DẪN XUẤT 4.1.1- Các flavonol và dẫn xuất 4.1.1.1 - Xác định cấu trúc của rutin (ký hiệu Ru) 4.1.1.2- Xác định cấu trúc của quercetin (ký hiệu Q) 4.1.1.3- Xác định cấu trúc của 3,3’,4’,7-tetrabutylcacbamoyloxy5-hydroxyflavon (ký hiệu Q-l) 4.1.1.4- Xác định cấu trúc của 3,3’,4’,5,7-pentathiophen-2carbonyloxyflavon (ký hiệu Q-2) 4.1.1.5- Xác định cấu trúc của 3,3’,4’,5,7-pentabenzoyloxyflavon (ký hiệu Q-3) 4.1.1.6- Xác định cấu trúc của 3,3\4’,7-tetra(morpholin-4cacbonyloxy)-5-hydroxyflavon (ký hiệu Q-4) 4.1.1.7- Xác định cấu trúc của pentapropionyloxyflavon (ký hiệu Q-5) 3,3’,4’,5,7- 59 59 60 62 63 65 66 68 4.1.1.8- Xác định cấu trúc của 3,3’,4\5,7-pentaacetoxyflavon (ký 69 hiệu Q-6) 4.1.1.9- Xác định cấu trúc 3,3’,4’,5,7-pentametoxyflavon (ký hiệu 71 Q-7) 4.1.1.10- Xác định cấu trúc của 3,3’,4’,5,7-pentabenzyloxyflavon (ký hiệu Q-8) 4.1.1.11- Xác định cấu trúc của hydroxyflavon (ký hiệu Q-9) 72 3,3’,4’,7-tetrapropoxy-5- 74 4.1.1.12- Xác định cấutrúc của 3’,4’,5,7-tetrametoxy-3hydroxyflavon (ký hiệu Ru-1) 4.1.2- Các flavanon và dẫn xuất 4.1.2.1- Xác định cấu trúc của hesperidin (ký hiệu HD) 4.1.2.2- Xác định cấu trúc của hesperetin (ký hiệu HT) 4.1.2.3- Xác định cấu trúc của octabenzoat hesperidin (HD-1 ) 4.1.2.4- Xác định cấu trúc của octapropionat hesperidin (HD-2) 4.1.2.5- Xác định cấu trúc của octaacetat hesperidin (HD-3) 75 4.1.2.6- Xác định cấu trúc của 3’,7-dibutylcacbamoyloxy-5hydroxy-4’-metoxyflavanon (ký hiệu HT-1) 87 4.1.2.7- Xác định cấu trúc của 3’,5,7-tribenzoyloxy-4’metoxyflavanon (ký hiệu HT-2) 89 4.1.2.8- Xác địnhcấu trúc của 3’,5,7-triacetoxy-4’metoxyflavanon (ký hiệu HT-3) 91 4.1.2.9- 78 78 81 82 84 86 Xác định cấu trúc của 2’,3,4,4’-tetrametoxy-6’hydroxychalcon (ký hiệu HT-4) 92 4.1.2.10- Xác định cấu trúc của 2\3,4’-tripropoxy-4-metoxy-6’hydroxychalcon (ký hiệu HT-5) 94 4.1.2.11- Xác định cấu trúc của 6,8-dibrom-3’,5,7-trihydroxy-4’metoxyflavanon (ký hiệu HT-6) 95 4.1.2.12- Xác định cấu trúc của 6,8-diclo-3’,5,7-trihydroxy-4’metoxyflavanon (ký hiệu HT-7) 4.1.3- Bàn luận 4.1.3.1- Phản ứng este hóa (axyl hóa) các flavonol và flavanon 4.1.3.2- Phản ứng ete hóa (ankyl hóa) các flavonol và flavanon 4.1.3.3- Phản ứng halogen hóa hesperetin 96 100 100 102 103 4.2- KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TĨNH KHÁNG NẤM, 104 KHÁNG KHUẨN 4.3- THỬNGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 4.3.1- Khả năng đánh bắt gốc tự do theo phương pháp DPPH 4.3.1.1 - Các flavonol và dẫn xuất 4.3.1.2- Các flavanon và dẫn xuất 4.3.1.3- Xác định nồng độ bắt 50% gốc tự do DPPH (SC50) của mẫu 4.3.2- Xác định khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp MDA 4.3.3- Mối tương quan giữa cấu trúc vớihoạt tính kháng oxy hóa của các ílavonoit và dẫn xuất 4.4- THỬNCiHIỆM KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO 107 107 107 108 110 112 114 118 4.4.1 - Các flavonol và dẫn xuất 4.4.2- Các flavanon và dẫn xuất 4.4.3- Xác định giá trị IC50 4.4.4- Kết quả gây apoptosis 4.4.5- Mối tương quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các flavonoit 4.4.6- Mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng gây độc tế bào (QSAR) 4.4.6.1 - Phương trình QSAR sơ bộ 4.4.6.2- Phương trình QSAR kết hợp 118 120 121 125 126 KẾT LUẬN 134 KIẾN NGHỊ 135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG B ố LIÊN QUAN ĐẾN 136 LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHU LUC 127 127 131 DANH MUC CAC TIÎV IÊT TAT bp base pair l3C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic phd công hudng tCr hat nhân Resonance Spectroscopy carbon 13 DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1 -Diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Electron Spray Ionization pho khoi luong phun mu Mass Spectrum diên tù i c 50 50% Inhibitory Concentration nông dô de ché 50% IR Infrared Rays phd hông ngoai kbp kilo base pair HeLa dong té bào ung thir co tu cung 'H-NMR HMBC HSQC LC Proton Magnetic Resonance phd công hudng tù hat nhân Spectroscopy proton Heteronuclear Multiple Bond phd tuong tac di hat nhân Connectivity qua nhiêu lien két Heteronuclear Single- phd tuofng tac di hat nhân Quantum Coherence qua mot lien két Liquid Chromatography süc kÿ long dong te bào ung thu vu MCF-7 MDA Malonyl dialdehyde MIC Minimum Inhibitory nông dô ùc ché toi thiëu (vi Concentration sinh vât bi ùc ché phât triên gân nhu hoàn toàn) NCI-H460 OD dong té bào ung thu phoi Optical Density mât dô quang PEOE_V SA_POL PEOE: Partial Equalization of tong dien tich be mat van Orbital Electronegativity, total der Waals phan cue Polar van der Waals Surface Area QJPRCQSAR RMSE Relative negative Partial tuong quan dien tich am Charge tung phan Q Quantitative Structure- moi quan he dinh lupng cau Activity Relationship truc-hoat tinh Root Mean Squared Error sai so binh phuong danh gia cheo SC50 50% Scavenger Concentration SRB Sulforhodamine B TPSA Topological Polar Surface dien tich topo be mat phan Area cue phan tu Ultra Violet pho tur ngoai UV nong dp biit 50% goc tu do DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cấu trúc của một số dạng flavonoil 6 Hình 1.2: Phức của quercetin với các kim loại đất hiếm 14 Hình 2.1: Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm 28 Hình 2.2: Hiện tượng ADN phân mảnh ở tế bào apoptosis 35 Hình 2.3: Tính toán diện tích tôpô bề mặt phân cực của phântử TPSA 36 Hình 4.1: Mật độ điện tích của quercetin 104 Hình 4.2: Mật độ điện tích của hesperetin 104 Hình 4.3: Kết quả gây apoptosis của mẫu HT-6 125 Hình 4.4: Mối tương quan giữa hoạt tính sinh học và thôngsố tương quan 130 điện tích âm từng phần Q_PRC-(A), diện tích tô pô bề mặt phân cực phân tử TPSA (B), tổng diện tích bề mặt van der Waals phân cực PEOE PEOE_VSA_POL (C) Hình 4.5: Tương quan giữa giá trị độc tính tế bào thực nghiệm và tính toán từ phương trình QSAR 8 132 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Phân loại và một số nguồn thực phẩm chứa flavonoit 7 Bảng 1.2: Cấu trúc các hợp chất chalcon 17 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q 59 Bảng 4.2 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q 61 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q -1 63 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-2 64 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-3 66 Bảng 4.6: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-4 67 Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-5 69 Bảng 4.8 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-6 70 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-7 72 Bảng 4.10: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-8 73 Bảng 4.11: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-9 74 Bảng 4.12: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Ru-1 76 Bảng 4.13: Cấu trúc và hiệu suất phản ứng của các dẫn xuất flavonol 77 Bảng 4.14: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HD 80 Bảng 4.15: Dữ liệu phổ NMR của họp chất HT 82 Bảng 4.16: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HD-1 83 Bảng 4.17: Dữ liệu phổ NMR của họp chất HD-2 85 Bảng 4.18: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HD-3 86 Bảng 4.19: Dữ liệu phổ NMR của họp chất HT-1 88 Bảng 4.20: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HT-2 90 Bảng 4.21: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HT-3 91 Bảng 4.22: Dữ liệu phổ NMR của họp chất HT-4 93 Bảng 4.23: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HT-5 94 Bảng 4.24: Dữ liệu phổ NMR của họp chất HT-6 96 Bảng 4.25: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HT-7 97 Bảng 4.26: Cấu trúc và hiệu suất phản ứng của các dẫn xuất tlavanon 99 Bảng 4.27: Cấu trúc và hiệu suất phản ứng của các dẫn xuất chalcon 99 Bảng 4.28: Kếl quả thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của các 105 ílavonol và dẫn xuất Bảng 4.29: Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn 106 của các ílavanon, chalcon và dẫn xuất Bảng 4.30: Kết quả ức chế DPPH (%) theo nồng độ của các 107 llavonol và dẫn xuất Bảng 4.31: Kết quả ức chế DPPH (%) theo nồng độ của các 109 tlavanon, chalcon và dẫn xuất Bảng 4.32: Giá trị SC50 (DPPH) của các mẫu có hoạt tính Bảng 4.33: Khả năng chống oxy hóa (%) của hợp chất theo nồng độ Bảng 4.34: Kết quả tính sc50(phương pháp MDA) 112 113 Bảng 4.35: Kết quả ức chế DPPH của một số ílavonoit 117 Bảng 4.36: Kết quả thử khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng 118 HeLa, MCF-7, NCI-H460 của các ílavonol và dẫn xuất Bảng 4.37: Kết quả thử khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng HeLa, 120 MCF-7, NCI-H460 của các ílavanon và dẫn xuất Bảng 4.38: Giá trị IC50 của các hợp chất 124 Bảng 4.39: Kết quả trọng lượng phân tử và tính toán loaP 127 Bảng 4.40: Độc tính tế bào trên dòng MCF-7 của các dần xuất 128 Bảng 4.41: Giá trị thông số mô tả phân tử trong xây dựng 128 phương trình QSAR Bảng 4.42: Phương trình QSAR sơ bộ sừ dụng duy nhất một thông số 129 mô tả phân tử Bảng 4.43: Hệ số tương quan chéo giữa các thông số mô tả phân tử 131 và độc tính tế bào Bảng 4.44: Hệ số tương quan chéo giữa thông số mô tả phân tử dùng trong phương trình kết hợp và độc tính tế bào 131 DANH MỤC CÁC Đ ồ THỊ Trang ĐỒ thị 4.1: Khảo sát khả năng ức chế DPPH (%) của các flavonol và dãn 108 xuất ở nồng độ 100 pg/ml ĐỒ thị 4.2: Khảo sát khả năng ức chế DPPH (%) của các flavanon, 110 chalcon và dẫn xuất ở nồng độ 100 pg/ml ĐỒ thị 4.3: Khả năng ức chế DPPH theo nồng độ của vitamine c 110 ĐỒ thị 4.4: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của rutin 110 ĐỒ thị 4.5: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của mẫu Ru-1 111 ĐỒ thị 4.6: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của quercetin 111 ĐỒ thị 4.7: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của hesperetin 111 ĐỒ thị 4.8: Kết quả giá trị sc50(pg/ml) của một số flavonol, flavanon 112 và dẫn xuất theo phương pháp DPPH ĐỒ thị 4.9: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của trolox 113 ĐỒ thị 4.10: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của rutin 113 Đồ thị 4.11: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của Ru-1 113 ĐỒ thị 4.12: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của quercetin 113 ĐỒ thị 4.13: Kết quả giá trị sc50(pg/ml) (phương pháp MDA) ĐỒ thị 4.14: Khảo sát khả năng gây độc tế bào (%) của các flavonol và dẫn 113 119 xuất ờ nồng độ 100 pg/ml ĐỒ thị 4.15: Khảo sát khả năng gây độc tế bào (%) của các flavanon và dẫn 121 xuất ở nồng độ 100 pg/ml ĐỒ thị 4.16: Tỉ lệ (%)gây độctế bào theo nồng độ của mẫu Q 122 ĐỒ thị 4.17: Tỉ lệ (%)gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Q-l 122 ĐỒ thị 4.18: Tỉ lệ (%)gây độctế bào theo nồng độ của mẫu Q-5 122 ĐỒ thị 4.19: Tỉ lệ (%)gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Ọ-6 122 Đồ thị 4.20: Tỉ lệ (%)gây độctế bào theo nồng độ của mẫu Q-7 122 ĐỒ thị 4.21: Tỉ lệ (%)gây độc tế bào theo nồng độ của mầu Ru-1 122 ĐỒ thị 4.22: Tỉ lệ (%)gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu HT 123 Đồ thị 4.23: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu HT-3 123 ĐỒ thị 4.24: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu HT-6 123 ĐỒ thị 4.25: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu HT-7 123 ĐỒ thị 4.26: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu HT-1 123 ĐỒ thị 4.27: Kết quả giá trị IC50 (pg/ml) của các hợp chất 124 DANH MỤC CÁC s ơ Đ ồ Trang Sơ đồ 1.1: Quy trình tổng hợp một số dẫn xuất este củaquercetin 12 Sơ đồ 1.2: Quy trình tổng hợp một số dẫn xuất ete của quercetin 13 Sơ đồ 1.3: Quy trình tổng hợp các nitrollavon, aminoflavon 14 Sơ đồ 1.4: Quy trình tổng hợp các flavon, thioflavon và iminoflavon 15 Sơ đồ 1.5: Quy trình tổng hợp các isoflavon và quinolon 15 Sơ đồ 1.6: Con đường tổng họp các flavon và flavanon bằng các aryl alđehit 16 Sơ đồ 3.1: Tổng hợp các dân xuất este của quercetin 40 Sơ đồ 3.2: Tổng họp các dẫn xuất ete của quercetin 43 Sơ đồ 3.3: Tổng họp các dẫn xuất este của hesperidin 46 Sơ đồ 3.4: Tổng họp các dẫn xuất este của hesperetin 48 Sơ đồ 3.5: Tổng hợp các dẫn xuất chalcon từ hesperetin 50 Sơ đồ 3.6: Tổng hợp các dẫn xuất halogen của hesperetin 51 MỞ ĐẦU Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải n^ày càng cao đã đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên do khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn cao trong sử dụng để ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan y. Hiện nay nhóm flavonoit nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới do chúng luôn có mặt trong các loại thực phẩm hàng ngày của con người. Các nghiên cứu cho thấy các chất thuộc họ này không gây độc cho cơ thể dù dùng ở liều cao và khi sử dụng kết hợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc này. Rất nhiều các hợp chất được chiết tách đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc trị bệnh có tác dụng mạnh hơn và ít độc hại hơn đối với cơ thể người bệnh. Với xu thế quay trở lại nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đang phát triển mạnh mẽ nhằm tìm kiếm các loại thuốc chữa bệnh, các phụ gia dùng trong thực phẩm, mỹ phẩm..., các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về nhiều khía cạnh của các hợp chất thiên nhiên nước ta để tận dụng ưu thế của một nước nhiệt đới, nơi có một hệ động thực vật đa dạng, phong phú, có nhiều loại cây cỏ có tác dụng sinh dược học mạnh. Các nghiên cứu này cũng đã đạt được nhiều thành quả trong việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất chiết xuất được vào một số lĩnh vực. Trên cơ sở đó, hướng nghiên cứu đề ra cho đề tài là tiến hành tổng hợp dẫn xuất của một vài hợp chất tách chiết từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên có sẵn, tương đối nhiều ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng nhằm có được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổng họp các dẫn xuất khác sau này đồng thời hy vọng có thể tìm thêm được những hợp chất mới có khả năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y dược. 2 Mục tiêu của luận án: Mục tiêu của luận án là tổng hợp các dần xuất từ một vài flavonoit có nhiều trong thiên nhiên và xác định các hoạt tính kháng oxi hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này để từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa vào sử dụng các flavonoit và dẫn xuất của chúng cho các ngành y tế, thực phẩm. Dựa trên các kết quả thu được hy vọng có thể đưa ra nhận xét bước đầu về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học, từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các flavonoit nói chung và các dẫn xuất của chúng. Để đạt được các mục đích trên luận án đã thực hiện các nội dung sau: 1- Tách chiết rutin từ hoa hòe và hesperidin từ vỏ quýt và tiến hành thủy phân hai hợp chất này thành quercetin và hesperetin để làm nguồn nguyên liệu cho các phản ứng tổng hợp tiếp theo. 2- Từ bốn họp chất trên bằng các phương pháp este hóa, ete hóa, halogen hóa để tạo ra các dẫn xuất của llavonoit, xác định cấu trúc của sản phẩm và các điều kiện phản ứng. 3- Khảo sát hoạt tính sinh học của các flavonoit và dẫn xuất gồm có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, hoạt tính kháng oxi hóa, khả năng gây độc tế bào ung thư trên 3 dòng tế bào: HeLa —tế bào ung thư cổ tử cung, MCF-7 —tế bào ung thư vú, NCTH460 —tế bào ung thư phổi. 4- Trên cơ sở những kết quả có được đưa ra mối quan hệ giữa cấu trúc với từng hoạt tính thử nghiệm. 5- Thiết lập phương trình QSAR (quan hệ định lượng cấu trúc —hoạt tính) để có thể dự đoán tính gây độc tế bào của các dẫn xuất quercetin và hesperetin. 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Ỷ nghĩa khoa hoc Đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu phản ứng este hóa, ete hóa, halogen hóa các flavonoit có các nhóm -OH linh động để từ đó tổng hợp được những dẫn xuất mới của ílavonoit. Các khảo sát mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính kháng oxi hóa của ílavonoit cho thấy các mối liên quan giữa độ âm điện của các nhóm -OH ở vòng B và nhóm -OH ở vị trí C-3 với khả năng kháng oxi hóa của các ílavonoit và dẫn xuất. Kết quả khảo sát mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào cũng đã tiếp tục khẳng định mối liên quan giữa chỉ số logP, trọng lượng phân tử của hợp chất với khả năng thẩm thấu qua màng tế bào. - Ỷ nghĩa thưc tiễn Việc tổng hợp ra các dẫn xuất ílavonoit từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên Việt Nam sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu ứng dụng tìm tòi phát hiện ra những hợp chất mới với những hoạt tính sinh học mới để có thể ứng dụng trong y dược và nâng cao vai trò của cây thuốc Việt Nam. Phần khảo sát mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học giúp các nhà tổng hợp hóa dược rút ngắn hơn thời gian của quá trình nghiên cứu, dự đoán được hoạt tính sinh học của hợp chất ílavonoit dựa trên cấu trúc của chúng. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Flavonoit là một nhóm bao gồm khoảng 4000 hợp chất tự nhiên hiện diện trong nhiều thành phần của cây cối cũng như trong các loại rau quả: [36] [69] - Hoa: có nhiều màu sắc, bao gồm nhiều thành phần như antoxianidin, flavon, flavonol, flavanon, chalcon và auron. Antoxianin làm cho hoa có màu đậm và tươi, polihydroxyflavon và flavonol thì làm cho hoa có ánh vàng. Những bông hoa có màu sắc rực rỡ lại do sự có mặt của chalcon và auron... Hoa là thành phần thích hop nhất để chiết flavonoit do hàm lượng nhiều và ít tạp chất. - Vỏ quả: do có nhiều màu sắc nên cũng là thành phần được nghiên cứu nhiều. Chúng có thể chứa tangeretin, naringin, rhoifolin, hesperidin, nobiletin... từ các vỏ quả họ Cam. - Hạt: chứa hydroxyflavon, các metyl ete của chúng, glycozit, furanoflavonoit, các dẫn xuất rotenoit và leucoantoxianidin. - Lá, gỗ, rễ và vỏ cây. Ngoài ra một số loại nước uống như rượu vang đỏ, trà, cà phê, bia hay cả trong các bài thuốc dân gian cũng được tìm thấy có chứa một lượng lớn flavonoit. Người ta dự đoán con người tiêu thụ tổng lượng flavonoit trong thực phẩm vào khoảng vài trăm miligam mỗi ngày. [97] Với sự đa dạng như vậy, ílavonoit là một hợp chất quan trọng không những đối với cây cỏ mà còn đối với các loài động vật bao gồm cả con người. 1.1- CẤU TRÚC VÀ PHÂN LOẠI CÁC FLAVONOIT Flavonoit là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon. Cấu trúc là một vòng kín hoặc hở. Cách đánh số tùy theo mạch cacbon kín hay hở. Nếu mạch cacbon kín, cách đánh số bắt đầu từ nguyên tố dị vòng oxi mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B được đánh số phụ. Nếu mạch cacbon hở, thì cách đánh số chính bắt đầu trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. 5 3 5 , 3 2fí í ?\ 4 . B 8 7( í? [ A 6 J 2 0 I " ' A if c | 5 ’° ÍT C 6 Sự phân loại các ílavonoit dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxi hóa của mạch cacbon (hình 1.1). - Flavon: Flavon có cấu trúc chung bao gồm 2 vòng benzen A và B. Vòng B gắn vào vòng c (pyran) tại vị trí c2. - Flavanon: Flavanon khác với flavon ở chỗ không có nối đôi ở vị trí c2và c3. Tất cả các flavanon được phát hiện cho đến nay đều có nhóm OH ở vòng A hoặc B. - Flavonol: Khác với flavon, flavonol có thêm nhóm OH ở C3. Flavonol rất phổ biến trong tự nhiên. Thống kê trên 1000 loài thuộc thực vật hạt kín thì thấy 48% loài có kaempferol, 26% loài có quercetin và myricetin chiếm 10% trong tổng số loài có flavonol. - Dihvdroflavonol: 3-hydroxyflavanol hoặc flavanol có cấu trúc cơ bản giống flavonol nhưng không có nối đôi C2-C3. - Chalcon: Chalcon có 2 vòng A và B nối với nhau bởi 1 mạch hở 3 cacbon, không có dị vòng như các flavonoit khác và số thứ tự cacbon bắt đầu từ vòng B. - Dihvdrochalcon: Là chalcon mất dây nối đôi a, p. Loại này ít gặp trong tự nhiên. - Auron: Là nhóm ílavonoit có màu vàng sáng. Khung của auron cũng có 12 cacbon như các flavonoit khác, nhưng dị vòng c chỉ có 5 cạnh. Số lượng cũng như sự phân bố trong cây cũng hạn chế. - Antoxianidin: v ề cấu trúc, nhóm này khác các flavonoit khác ở chỗ không có nhóm cacbonyl ở c4. - Leucoantoxianidin: Là 3,4-dihydroxyflavan, không màu, nhưng gặp axit biến thành antoxianidin có màu hồng hoặc đỏ, rất phổ biến trong cây, nhất là trong vỏ cây và gỗ. - Isoflavon: Là nhóm isoflavonoit phổ biến nhất. Vòng B trong nhóm isoflavon nối với vòng c tại vị trí c3trong khi vòng B ở nhóm flavon nối với vòng c ở vị trí c2. 6 - Rotenoit: Người ta đã biết khoảng 15 chất rotenoit, chất điển hình nhất là rotenon có trong cây thuốc cá Derris elliptica. Tác dụng quan trọng của nhóm hợp chất này là diệt sâu bọ, do hạn chế khả năng thu nhận oxi của sâu bọ. - NeoAavonoit: Không có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 thay vào đó là vòng B. Chất đầu tiên phân lập là calophylolid chiết từ hạt cây Mù u Calophyllum inophyllum và một số loài CalophyỊỊỵm khác, họ Bứa (Guttifereae). DihydHichakan c láoílavỉinoo >'caílavoncil Hình 1.1: Cấu trúc của một số dạng Aavonoit 7 Bảng 1.1 : Phân loại và một số nguồn thực phẩm chứa ílavonoit [97] Nhóm flavonoit Các flavonoit tiêu biểu Nguồn thực phẩm chính cung cấp Kaempferol, myricetin, rutin, Hành, anh đào, táo, bông cải xanh, cải quercetin xoăn, cà chua, trà, rượu vang đ ỏ ,... FI avon Apigenin, chrysin, luteolin Mùi, cỏ xạ hương... Isoflavon Daidzein, genistein, glycitein, Đậu nành, các loại đậu... Flavonol formononetin Flavanol Catechin, gallocatechin Flavanon Eriodictyol, hesperetin, naringenin Cam, nho... 1.2- Táo, trà... HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOIT 1.2.1- Vai trò của flavonoit đối vói câv cỏ [70][73 ] Các flavonoit đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển và tự vệ của cây. - Trong các phản ứng sinh hóa: Một số flavonoit có tác dụng như một chất chống oxi hóa, bảo vệ axit ascorbic, một thành phần quan trọng trong tế bào thực vật. Một số có tác dụng ức chế các enzim và các chất độc của cây. - Vai trò ức ch ế và kích thích sinh trưởng: Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây của flavonoit. Nhóm chức hiđroxi có vai trò quyết định về tác dụng này. - Vai trò tạo màu sắc: Flavonoit đóng vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả. - Vai trò m ột chất bảo vệ cây: Một số flavonoit không màu trong lá đóng vai trò một chất bảo vệ cây. Vị đắng và khó chịu của flavonoit làm cho động vật khi ăn phải mất cảm giác ngon và không thích ăn các loại cây cỏ này. Ngoài ra, do khả năng hấp thụ mạnh tia của tia uv mà các flavonoit giúp bảo vệ cây chống lại các tác hại uv, nhiệt độ. Chúng còn giúp cây chống lại một số vi khuẩn, nấm. 8 1.2.2- Tính chất dươc lỷ của Aavonoit Flavonoit có nhiều hoạt tính sinh học như khả năng kháng oxi hóa, kháng khối u, kháng viêm, chống dị ứng và là tác nhân bảo vệ gan. Vì vậy, nghiên cứu về hoạt tính của các flavonoit luôn nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học đặc biệt là nghiên cứu về khả năng kháng khối u của llavonoit. 1.2.2.1 - Khả năng kháng oxi hóa của ílavonoit [20] [21][41] [42] [49] [62] Các ílavonoit là các chất kháng oxi hóa tự nhiên được thể hiện thông qua khả năng bắt gốc tự do, tạo phức với ion kim loại và ức chế hệ thống enzim. 1.2.2.2- Tác nhân chống ung thư Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ở mức độ in vitro và in vivo cũng như các nghiên cứu về dịch tễ học đề cập đến vai trò của flavonoit ở khẩu phần ăn hàng ngày trong việc ngăn ngừa ung thư [56], một số sự kết hợp trong điều trị được thực hiện với thực phẩm giàu ílavonoit như sử dụng đậu nành và ung thư vú thời kỳ tiền mãn kinh, trà xanh và ung thư bao tử, hành và ung thư phổi...[97]. Vì vậy, hiểu biết thêm về khả năng chống ung thư của các loại thực phẩm này sẽ giúp cải thiện thói quen trong ăn uống của chúng ta. Ngoài ra, bên cạnh các flavonoit tự nhiên thì các flavonoit tổng hợp là những ứng cử viên cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai, một số các hợp chất này đang ở trong giai đoạn thăm dò lâm sàng như navopiridol, 5,6dimetylxanthenon-4-axetic axit, phenoxodiol hay silybin,_[100] Cơ chế khán» ung thư cùa flavonoit: - Fìavonoit là tắc nhân ngăn ngừa về mặt hóa học: Năm 1996, Calomme M. và đồng nghiệp phát hiện flavonoit họ Cam có khả năng ức chế sự đột biến của vi khuẩn. Các thí nghiệm cho thấy tangeretin kháng lại tất cả các thử nghiệm trên các chất gây đột biến gián tiếp, còn nobiletin lại kháng sự đột biến do benzo[a lpyren và 2-aminofluoren gây ra. Do tính chất này mà các ílavonoit họ Cam (đặc biệt là tangeretin và nobilelin) đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa ung thư về mặt hóa học....[100]