Tài liệu Tìm hiểu về quá trình tăng trưởng và tích lũy dầu ở củ cỏ gấu cyperus esculentus l (tóm tắt)

1 CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Cỏ gấu Cyperus esculentus L. là một cây cho dầu có tiềm năng, vì củ chứa từ 20 % đến 36 % dầu (Muhammad và cs., 2011). Hơn nữa, cỏ gấu dễ trồng, xuất hiện nhiều nơi trên thế giới và phát triển tốt trên những đồng ruộng ngập nước, cho củ ăn được, giàu carbohydrate và đặc biệt là dầu có thành phần tương tự như dầu oliu (Linssen, 1988, Guldhe và cs., 2013). Vấn đề đặt ra là, điều kiện sinh trưởng hoặc tự nhiên nào quyết định quá trình chuyển hóa để tạo tinh bột hay chất béo trong củ? Giải quyết được những câu hỏi này không những giúp ta hiểu rõ cơ chế điều phối hình thành hai nhóm chất dự trữ (tinh bột và dầu) mà còn còn giúp ta kiểm soát sự hình thành các giọt dầu. Đề tài “Tìm hiểu về quá trình tăng trưởng và tích lũy dầu ở củ cỏ gấu Cyperus esculentus L.” được tiến hành để góp phần tìm hiểu quá trình tăng trưởng củ và tích lũy dầu trong củ, từ đó tìm ra phương pháp hợp lý để gia tăng năng suất củ cũng như hàm lượng dầu trong củ, đặc biệt là dầu cho nhiên liệu sinh học. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU Ba thứ cỏ gấu Cyperus esculentus L.: esculentus, sativus và hermanii mọc hoang hay được trồng. Những thí nghiệm sơ khởi được thực hiện trên cả ba thứ cỏ gấu. Kết quả cho thấy thứ esculentus xuất hiện phổ biến hơn trên ruộng ngập nước (ở Tiền Giang và Long An), so với hai thứ hermanii và sativus, nên được tập trung nghiên trong đề tài nà 2.2. PHƯƠNG PHÁ 2.2.1. Theo dõi sự phát triển của ba thứ cỏ gấu tại ruộng ngập nước trong mùa mưa và mùa khô, từ cây trồng tại ruộng ngập nước và tại 2 vườn thực nghiệm, sau đó lập đường cong tăng trưởng củ ở thứ esculentus bằng cách xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô, từ tuần 1- tuần 14. 2.2.2. Quan sát hình thái giải phẫu của củ, cuống phát hoa và lá cỏ gấu, sau sự nhuộm hai màu và dung dịch lugol (I2KI). 2.2.3. Phân tích một số chỉ tiêu sinh lý hóa học của củ 2.2.3.1. Đo cường độ hô hấp và quang hợp bằng máy Hansatech với điện cực oxygen. 2.2.3.2. Xác định trọng lượng tươi và khô của củ: cân để xác định trọng tươi, sau đó sấy khô đổi để xác định trọng lượng khô. 2.2.3.3. Xác định hàm lượng đường và tinh bột của củ theo Combs và cs (1987): Ly trích đường bằng ethanol. Phần bã còn lại chứa tinh bột được sấy khô và thủy giải bằng acid percloric. Thực hiện phản ứng màu với phenol 5% trong acid sulfuric đậm đặc và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 490 nm, để xác định lượng đường và tinh bột nhờ đường cong chuẩn với dung dịch sucrose và glucose. 2.2.3.4. Định lượng đạm tổng số trong củ theo phương pháp MacroKjeldahl (Hancoock, 1984): Chất đạm được vô cơ hóa bằng acid sulfuric, và amonium sulfat sinh ra tác dụng với NaOH để phóng thích NH 3. NH3 được lôi cuốn bằng máy Parnas – Wargner đến Erlen chứa H 2SO4, và lượng H2SO4 thừa được định phân bằng NaOH N/100, để suy ra lượng nitrogen. 2.2.3.5. Định lượng lipid tổng số trong củ theo phương pháp Soxhlet (Hancoock, 1984): dùng ete nóng để hòa tan chất béo, sau đó để bay hơi ete, cân chất béo còn lại, và tính ra hàm lượng lipid trong 100 g mẫu. 2.2.3.6. Đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật của củ: AIA, cytokinin, gibberellin, ABA ở dạng tự do, được ly trích, phân đoạn trên bản sắc ký, cô lập, và đo hoạt tính nhờ các sinh trắc nghiệm (Bùi Trang Việt, 1992), Yokota và cs.,1980). 3 2.2.3.7. Phân tích thành phần acid béo trong dầu cỏ gấu theo phương pháp sắc ký khí, tại Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu TP. Hồ Ch1 Minh. 2.2.4. Kiểm tra sự biểu hiện gen WRI1 ở cỏ gấu Tách chiết RNA bằng mRNA Purification Kit (Thermo, Hoa Kỳ), và loại bỏ DNA bằng DnaseI (Thermo, Hoa Kỳ). Nồng độ RNA được xác định bằng máy đo quang phổ, trước khi 1 µg RNA tổng được dùng để tổng hợp cDNA bằng cDNA Kit (Thermo, Hoa Kỳ). Định lượng Real-Time PCR và phân tích kết quả. 2.2.5. Đo hàm lượng nước của đất (độ ẩm của đất) bằng cách xác định sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và khô của đất. 2.2.6. Thí nghiệm cắt cơ quan 2.2.6.1. Dùng khúc cắt trong phòng thí nghiệm Cây cỏ gấu thứ esculentus 10 tuần tuổi đang mang cuống phát hoa cấp một và các lá bắc được dùng trong cách cắt 1, và cây 12 tuần tuổi đang mang hoa được dùng trong các cách cắt 2 - 6. Các khúc cắt với cuống phát hoa cấp một dài 10 cm, sau các kiểu cắt bỏ cơ quan khác nhau, được đặt trong bình chứa sẵn 100 ml nước cất: (1) Đặt xuôi phần ngọn cuống phát hoa cấp một (cây 10 tuần tuổi), (2) Đặt xuôi phần ngọn cuống phát hoa cấp một (cây 12 tuần tuổi), (3) Đặt xuôi cuống phát hoa cấp một (như nghiệm thức 2), sau khi cắt bỏ các phát hoa cấp hai, (4) Đặt ngược các cuống phát hoa cấp hai, sau khi cắt bỏ các phát hoa cấp hai (như nghiệm thức 3), (5) Đặt xuôi phần gốc cuống phát hoa cấp một với một lá gốc được giữ lại, và (6) Đặt ngược phần gốc cuống phát hoa cấp một với một lá gốc được giữ lại (như nghiệm thức 5). Lượng đường thoát ra môi trường nước được xác định sau 48 giờ (theo 2.2.4.3). 2.2.6.2. Cắt cơ quan tại vườn thực nghiệm Cây cỏ gấu thứ esculentus 12 tuần tuổi đang mang hoa được trồng trong điều kiện ngập nước, tại vườn thực nghiệm, được dùng để thực hiện 4 các thí nghiệm cắt cơ quan: (1) Cây để nguyên, (2) Cắt phần ngọn phát hoa cấp hai cùng các lá bắc cấp hai, (3) Cắt các lá bắc cấp một nhưng giữ lại các phát hoa cấp hai, (3) Cắt các lá thân, (4) Cắt phần ngọn phát hoa cấp một bao gồm tất cả các lá bắc và phát hoa, và (5) Cắt phần ngọn phát hoa cấp một (như nghiệm thức 5) và các lá thân. Hàm lượng sucrose của các đoạn cuống phát hoa cấp một được xác định (theo 2.2.4.3) vào lúc 16 giờ đối với thí nghiệm ban ngày được bắt đầu từ 6 giờ, và 24 giờ đối với thí nghiệm chiều-tối được bắt đầu từ 16 giờ cùng ngày. 2.2.7. Tích lũy lipid ở lát cắt củ 2.2.7.1. Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật và các chất khác Lát cắt ngang qua phần giữa củ ở tuần 10, đường kính 2,5 mm, dày 5 mm, được đặt nuôi trong Erlen chứa 20 ml môi trường MS không đường (đối chứng), IAA 2 mg/l, ABA 2 mg/l, BA 10 mg/l, ethrel 400 mg/l, GA 3 20 mg/l, NaCl 5g/l, paclobutrazol (PBZ) 2g/l, thiourea 1 g/l, hay KNO 3 1 g/l. Sau 1 tuần nuôi cấy, xác định trọng lượng tươi và khô, và hàm lượng lipid của lát cắt. 2.2.7.2. Thay đổi cân bằng nước - Lát cắt ngang qua phần giữa củ thứ esculentus, ở các tuần 8, 9, 10, 11 và 12, đường kính 2,5 cm , cao 5 mm, được nuôi trong Erlen chứa 15 ml môi trường MS với mannitol 0, 20, 40, 60 và 80 g/l. - Lát cắt như trên được đặt trong đĩa Petri, trong điều kiện ngập nước (mực nước cất cao hơn mặt trên khúc cắt 2 mm) hay trên chồng giấy thấm ẩm (dày 3 mm). Sau 1 tuần, xác định trọng lượng tươi và khô, và hàm lượng lipid của lát cắt củ. 2.2.8. Tăng trưởng và tích lũy lipid của củ theo lượng nước của đất Củ được trồng tại vườn thực nghiệm, ở các điều kiện: (1) “Ngập nước”: luôn giữ mực nước ngập trên đất 5 cm, (2) “Tưới nước”: tưới vào 5 lúc 10 giờ sáng, theo ba cách: mỗi ngày, 2 ngày và 3 ngày một lần, và (3) “Ngập và tưới”: ngập nước trong 2, 6, 10 hay 14 tuần, sau đó để thoát nước, và tưới nước mỗi ngày một lần. Sự tăng trưởng của củ cỏ gấu được theo dõi theo thời gian. Trọng lượng tươi và khô, và hàm lượng lipid tổng số của củ được phân tích. 2.2.9. Xử lý giúp tăng sinh khối và tích lũy lipid tại ruộng ngập nước ở cây 12 tuần tuổi đang mang hoa 2.2.9.1. Xử lý trong mùa mưa, lũ ● Trong điều kiện ngập nước: (1) Đối chứng ngập nước tự nhiên, (2) Cắt hoa: cắt bỏ ngọn mang tất cả các lá bắc và hoa, (3) Cắt hoa và phun GA3: cắt bỏ ngọn như trên và phun GA3 (lên phần khí sinh còn lại). ● Trong điều kiện tháo nước: (1) Đối chứng: ruộng được tháo hết nước bằng cách tạo các rãnh dẫn nước, (2) Cắt ngọn: cắt bỏ ngọn mang tất cả các lá bắc và hoa, (3) Xới gốc: xới đất xung quanh gốc cây, (4) cắt ngọn và xới gốc, (5) Cắt ngọn và phun GA3 20 mg/l, và (6) Cắt ngọn, xới gốc và phun GA3 20 mg/l. Sau 2 tuần xử lý, xác định hàm lượng đường, tinh bột và lipid tổng số của củ. 2.2.9.2. Xử lý trong mùa khô Trồng thứ esculentus trên ruộng ngập nước, và thực hiện các thí nghiệm ở cây 12 tuần tuổi: (1) Đối chứng, (2) Cắt hoa, (3) Xới đất, (4) Cắt hoa và xới đất, (5) Phun GA3 20 mg/l, (6) Phun GA3 20 mg/l và cắt hoa, (7) Phun ethrel 400 mg/l, (8) Phun KNO3 1 g/l, (9) Phun NaCl 5 g/l, (10) Tưới PBZ, (11) Phun PBZ 2 g/l, (12) Phun thiourea 1 g/l, và (13) Phun thiourea 1 g/l và tưới PBZ 2 g/l. Sau 2 tuần xử lý, đo chiều dài cuống phát hoa, xác định trọng lượng tươi và khô, và lipid tổng số của củ. 2.2.9.3. Xử lý cắt hoa trong mùa khô: Cây 10 tuần tuổi (chưa hình thành hoa) được dùng trong các thí nghiệm: (1) Cắt hoa, (2) Xới gốc (để so sánh với xử lý cắt hoa), (3) Cắt hoa và xới gốc, (4) Cắt hoa và phun PBZ 2 g/l, 6 (5) Cắt hoa và phun thiourea 1 g/l, (6) Cắt hoa, xới gốc và phun thiourea 1g/l, và (7) Cắt hoa, xới gốc và phun thiourea và PBZ 2 g/l. Sau 2 tuần xử lý, trọng lượng tươi và khô, hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, và lipid tổng số của củ được phân tích. 2.2.10. Bố trí thí nghiê êm và xử lý thống kê Các thí nghiê êm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên và số liê êu trong các bảng được xử lý theo chương trình SPSS phiên bản 16.0. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. Chu trình phát triển của ba thứ cỏ gấu ● Quan sát ở một thời điểm Trong môi trường đất ruộng ngập nước, vào tháng 5-6/2011, tại Tiền Giang, cỏ gấu thứ esculentus tăng trưởng thành từng bụi 10 - 15 cây, và có thể được phân thành bốn nhóm: nhóm 1 có 2 - 3 cây mang hoa và trái, nhóm 2 có 2 - 3 cây mang phát hoa với các hoa thấy được bằng mắt thường, nhóm 3 có 3 - 4 cây thấp hơn đang mang cuống phát hoa, chưa xuất hiện các nụ hoa, và nhóm 4 có 4 - 5 cây chưa xuất hiện cuống phát hoa xung quanh các cây mang hoa và trái. ● Quan sát theo thời gian Trong môi trường đất ruộng ngập nước, cây 2 tuần tuổi có 3 - 6 lá thân ở dạng hoa hồng. Ở tuần 6, cuống phát hoa cấp một xuất hiện và mang ba lá bắc cấp một. Ở tuần 10, cuống phát hoa cấp hai với ba lá bắc cấp hai xuất hiện trong mỗi lá bắc cấp một. Ở tuần 12, cuống phát hoa cấp một mang tổng cộng chín phát hoa trên ba lá bắc cấp một, mỗi lá bắc cấp một mang ba bphát hoa cấp hai, mỗi cuống phát hoa cấp hai có lá bắc riêng. Đến uần 14, hoa đã trở thành trái. 7 Trọ8ng l ượ ng tươ i Hàm l ượ ng l ipid 60 Trọ ng l ượ ng khô Hàm lượng lipid (mg/gTLK) ● Đường cong tăng trưởng và sự thay đổi hàm lượng lipid của củ 7 ở thứ esculentus 50 Trên ruộng ngập 6 nước, củ cỏ gấu thứ esculentus được trồng từ củ mẹ (ở giai đoạn 14 tuần tuổi) tăng trưởng theo đường cong gồm ba giai đoạn,40dựa 5 vào sự thay đổi trọng lượng tươi, trọng lượng khô: - Giai đoạn củ tăng trưởng chậm từ tuần 1 đến cuối tuần 5. 4 30 Giai đoạn củ tăng trưởng nhanh từ đầu tuần 6 đến cuối tuần 12. 3 Giai đoạn củ giảm tăng trưởng từ đầu tuần 13 đến cuối tuần 14.20 Hàm lượng 2 lipid tăng theo sự tăng trưởng của củ, từ giai đoạn tăng trưởng chậm đến giai đoạn tăng trưởng nhanh, đạt mức cao nhất ở tuần 1012. 1 Sau tuần 12, hàm lượng lipid giảm cùng với sự giảm trọng lượng tươi và khô của củ (hình 0 3.1). 0 Hình 3.1. Đường cong tăng trưởng của củ cỏ gấu thứ esculentus theo thời gian (với các mẫu tự khác nhau trên hình biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05) 8 ● Cách phát triển củ Trong môi trường đất ruộng ngập nước, ba thứ cỏ gấu có hệ thống rễ và thân ngầm phức tạp dưới đất. Các củ trong bụi có kích thước và ở giai đoạn phát triển khác nhau: (1) Củ nhỏ, khi cây đang mang 3-9 lá thân, (2) Củ vừa, khi cây mang hoa và củ đang mang mầm chồi, và (3) Củ lớn khi cây mang trái và mầm ngủ trên củ đã phát triển thành cây con mới. ● Quan sát tại vườn thực nghiệm Ở thứ esculentus, cách tạo củ trực tiếp từ củ đang tăng trưởng có thể được quan sát từ tuần 2 trong cả ba nghiệm thức: ngập nước, tưới và ngập và tưới. Cách tạo củ gián tiếp qua thân bò chỉ xảy ra sau 6 tuần trong môi trường ngập nước, không xảy ra trong điều kiện tưới. 3.1.2. Quan sát hình thái giải phẫu Ở lát cắt ngang, lá thân hay lá bắc cỏ gấu có cấu trúc tương tự: các bó mạch xếp theo một vòng, gân giữa có những tế bào bóng, nhiều khoảng khuyết trong mô mềm, và có một vòng bao mô cứng quanh bó mạch. Tế bào vòng bao bó mạch ở cuống phát hoa cấp một chứa tinh bột. Cấu trúc dưới biểu bì của củ hóa mô cứng ở tuần 6. Có rất nhiều giọt dầu tập trung ở vùng mô mềm của trụ. Mô phân sinh dày cấp một hiện diện trong phần ngoại vi của củ. Khi củ mới tượng, những bó mạch mới được hình thành hướng tâm từ mô phân sinh dày. Sau đó, số bó mạch gia tăng ngày càng nhiều và các lớp mô phân sinh dày cũng phân chia mạnh ở ngày thứ 10. Đến tuần 2, mô phân sinh dày cấp hai xuất hiện với vách tế bào tẩm lignin. Ở ruộng ngập nước, củ cỏ gấu thứ esculentus được trồng từ củ mẹ tăng trưởng theo ba giai đoạn, dựa vào sự thay đổi trọng lượng tươi và khô: (1) chậm từ tuần 1 đến cuối tuần 5, (2) nhanh từ đầu tuần 6 đến cuối tuần 12, và (3) giảm tăng trưởng từ đầu tuần 13 đến cuối tuần 14. 9 3.1.3. Sự tích lũy dầu ở củ trong môi trường đất ruộng ngập nước Hàm lượng lipid tăng theo sự tăng trưởng của củ, từ giai đoạn tăng trưởng chậm đến tăng trưởng nhanh, đạt mức cao nhất ở tuần 12. Sau tuần 12, lipid giảm cùng với sự giảm trọng lượng tươi và khô của củ. CĐHH giảm từ giai đoạn củ tăng trưởng chậm sang tăng trưởng nhanh và tăng từ giai đoạn tăng trưởng nhanh sang giai đoạn giảm tăng trưởng. Hàm lượng đường, protein và lipid tăng trong khi hàm lượng tinh bột giảm từ củ tăng trưởng nhanh sang củ giảm tăng trưởng. 3.1.4. Sự thay đổi cường độ quang hợp và cường độ hô hấp Lá thân quang hợp mạnh ở tuần 6, sau đó giảm dần và thấp nhất ở tuần 12, trong khi lá bắc tăng quang hợp từ tuần 6 đến tuần 10 và giữ không đổi ở tuần 12. Hô hấp của lá thân không đổi từ tuần 2 đến tuần 10 và tăng lên ở tuần 12, nhưng hô hấp của lá bắc giảm mạnh ở tuần 12. Hô hấp của củ giảm mạnh ở tuần 6 và tuần 12, đạt mức cao ở tuần 2 và 10. 3.1.5. Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Hoạt tính auxin giảm ở tuần 10 và tăng lên ở tuần 12, trong khi acid abscisic tăng ở tuần 10 và giữ ở mức cao ở tuần 12. Hoạt tính gibberellin và zeatin tăng đều đặn theo thời gian. 3.1.6. Sự phân bố đường trong thân và mối quan hệ xuất nhập ● Trắc nghiệm khúc cắt cuống phát hoa cấp mô tê Sucrose xuất ra khi đặt xuôi ngọn cây 12 tuần tuổi (mang hoa) ít hơn so với khi đặt xuôi ngọn cây 10 tuần tuổi (chuẩn bị hoa). Trong các trường hợp đặt phần ngọn và hay phần gốc của cây 12 tuần tuổi, thì đặt ngược dẫn tới sự xuất sucrose mạnh hơn đặt xuôi và đặc biệt mạnh khi đặt ngược phần ngọn. 10 ● Thí nghiệm cắt cơ quan Ở cây đối chứng, hàm lượng sucrose của các khúc cắt ngọn, giữa và gốc, và hàm lượng sucrose tổng luôn luôn cao hơn ở các thí nghiệm chiều-tối so với ban ngày. Ngược lại, khi cắt phát hoa và các lá bắc cấp một, hàm lượng sucrose cao hơn trong thí nghiệm vào ban ngày và thấp hơn trong thí nghiệm vào chiều-tối, đặc biệt cao hơn ở phần ngọn và phần giữa khúc cắt. 3.1.7. Nuôi cấy in vitro lát cắt củ thứ esculentus ● Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tăng trưởng và tích lũy lipid của lát cắt củ Ở các nghiệm thức xử lý IAA 2 mg/l, ABA 2 mg/l, BA 10 mg/l, ethrel 400 mg/l và GA3 20 mg/l, trọng lượng tươi thấp, trong khi hàm lượng lipid luôn cao hơn đối chứng, và cao nhất với ABA 2 mg/l. Cùng với sự gia tăng hàm lượng lipid là sự giảm trọng lượng khô ở xử lý ABA 2 mg/l. Ethrel 400 mg/l làm tăng hàm lượng lipid, giảm trọng lượng tươi nhưng không giảm trọng lượng khô. ● Ảnh hưởng của mannitol và một số hợp chất khác lên sự tăng trưởng và tích lũy lipid của lát cắt củ Trong tất cả các xử lý, hàm lượng lipid đều tăng so với đối chứng, và cao nhất khi xử lý mannitol 80 g/l, tiếp theo là PBZ 2 g/l, tăng ít nhất là KNO3 1 g/l. Cùng với sự gia tăng hàm lượng lipid là sự giảm trọng lượng tươi và trọng lượng khô. Hàm lượng lipid tăng dần theo nồng độ mannitol. PBZ 2 g/l cho hàm lượng lipid cao nhất, so với NaCl 5 g/l, KNO 3 1 g/l và thiourea 1 g/l. 3.1.8. Ảnh hưởng của hàm lượng nước của đất lên sự tích lũy lipid Ở nghiệm thức tháo nước sau 2 tuần ngập nước, hàm lượng lipid của củ tăng theo thời gian và đạt mức cao nhất ở tuần 10, và sau đó giảm ở 11 tuần 18. Ở nghiệm thức tháo nước sau 10 và 14 tuần ngập nước, hàm lượng lipid cũng đạt mức cao ở tuần 10 nhưng giữ ở mức cao ở tuần 18. 3.1.9. Xử lý trên đồng ruộng nhằm tăng hàm lượng lipid ở củ cỏ gấu thứ esculentus trên đồng ruộng ● Ảnh hưởng của tháo nước, xới gốc, cắt ngọn và GA3 Hàm lượng lipid tăng trong tất cả các xử lý so với đối chứng và tăng cao nhất trong hai nghiệm thức “tháo nước, xới gốc và cắt ngọn” và “tháo nước, xới gốc, cắt ngọn và phun GA3 20 mg/l”. Sự tăng hàm lượng lipid ở nghiệm thức “tháo nước, xới gốc và cắt ngọn” xảy ra cùng với sự giảm trọng lượng tươi/củ, trọng lượng khô/củ và tinh bột, và sự tăng TLK/g TLT và đường so với đối chứng. Sự tăng hàm lượng lipid ở nghiệm thức “tháo nước, xới đất và cắt ngọn và phun GA 3 20 mg/l” xảy ra cùng với sự giảm TLT/củ, TLK/củ, TLK/g TLT nhưng tăng đường và tinh bột so với đối chứng. ● Ảnh hưởng của sự cắt hoa và xới gốc và các xử lý khác Khi cắt hoa và xới gốc, chiều dài cuống phát hoa cấp một thay đổi không đáng kể so với đối chứng, trong khi tăng mạnh khi cắt hoa và giảm nhẹ khi xới gốc. Tất cả các xử lý khác (GA 3, Ethrel, NaCl, tưới hay phun PBZ, kết hợp PBZ và thiourea) đều làm giảm hàm lượng lipid, trừ xử lý GA3 20 mg/l kết hợp với cắt hoa và thiourea. KNO 3 1 g/l làm giảm hàm lượng lipid, đồng thời làm tăng mạnh chiều dài cuống phát hoa cấp một. Hàm lượng lipid ở cả ba chỉ tiêu (mg/g TLT, mg/g TLK, g/củ) tăng cao trong xử lý kết hợp cắt hoa và xới gốc, so với chỉ cắt hoa hay xới gốc, hay cắt hoa và xới gốc kết hợp với các xử lý khác (cắt hoa và PBZ , cắt hoa và thiourea, cắt hoa, xới gốc và thiourea hay kết hợp cả cắt hoa, xới gốc, thiourea và PBZ). Không chỉ làm tăng hàm lượng lipid, sự cắt hoa và xới đất còn làm tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của củ. 12 Ở củ và rễ, auxin và acid abscisic tăng mạnh sau 5 ngày xử lý cắt hoa và xới đất, tuy nhiên cytokinin và giberellin giảm ở củ và thay đổi không đáng kể ở rễ. Cường độ quang hợp của lá thân và hô hấp của củ đều tăng do xử lý cắt hoa và xới đất. 3.1.10. Sự thay đổi thành phần và tỷ lệ acid béo trong củ cỏ gấu sau các xử lý Thành phần acid béo chủ yếu trong củ cỏ gấu ở nghiệm thức đối chứng bao gồm acid oleic (42,42 %), acid lauric (17,13 %), acid linolenic (13,35 %) và acid palmitic (10,09 %). Thành phần này thay đổi không đáng kể trong củ ở nghiệm thức cắt hoa và xới đất, trong khi với xử lý thiourea làm tăng nhẹ acid oleic (44 %) và acid linolenic (15,86 %), tăng mạnh acid palmitic (22,05 %), nhưng giảm mạnh acid lauric (6,93 %). Các acid béo trong củ cỏ gấu có mạch carbon từ C10 cho đến C20 với mức độ bão hòa khác nhau: 43,61 % no (bão hòa), 42,24 % có 1 nối đôi, 13,35 % có 2 nối đôi, và 0,32 % có 3 nối đôi. Trong đó, thành phần chiếm ưu thế là các acid béo có chuỗi carbon dài (C14 - C20) (79,77 %). Phun thiourea làm tăng acid béo chuỗi dài (91,84 %), giảm acid béo chuỗi trung bình (8,16 %), và không thay đổi nhiều về mức bão hòa của các acid béo. 3.1.11. Biểu hiện gen WRI1 Độ tinh sạch của mRNA được xác nhận từ sự đo OD: OD260/OD280 trong khoảng 1.8 đến 2.0, và OD260/OD280>2. Có sự hiện diện của mRNA tổng số trong mẫu, cao nhất trong mẫu củ tăng trưởng nhanh. Tuy nhiên, trên bảng điện di, không phát hiện các băng tương ứng với cDNA từ gen WRI1 của củ có gấu thứ escalentus ở ba giai đoạn: tăng trưởng chậm (sau 2 tuần), tăng trưởng nhanh (12 tuần) và ngừng tăng trưởng (14 tuần). 13 3.2. THẢO LUẬN ● Sự phát triển và chu trình phát triển của cỏ gấu Trong môi trường đất ruộng ngập nước, thứ esculentus phát triển củ trực tiếp từ củ mẹ và phát hoa mang rất nhiều hoa, tạo nên nơi nhập mạnh, thu hút mạnh dòng biến dưỡng, cạnh tranh với củ. Cỏ gấu là loài cây nhất niên, nhưng do sự phát triển tuần tự của các cây trong bụi giúp bụi tồn tại nhiều năm. Do đó, tùy theo nhà nghiên cứu, cỏ gấu được xem như loài nhất niên hoặc đa niên (Ekeanyanwu và Ononogbu, 2010; Eteshola và Oraedu, 1996). Dựa vào hình thái, cấu trúc và đường cong tăng trưởng củ, có thể nói sự tích lũy chất dự trữ thấp trong giai đoạn đầu khi tế bào phân chia nhanh, sau đó tăng đồng thời với sự tăng trưởng tế bào. Cỏ gấu là cây đơn tử diệp, có vòng bao bó mạch, nhiều khoảng khuyết trong mô mềm, cuống phát hoa hoa cấp một kéo dài với nhiều khoảng khuyết chứa đầy khí phù hợp với đời sống trong vùng ngập nước. Mô phân sinh dày cấp một hoạt động giúp tế bào ở vùng dưới ngọn phù lên, phân chia theo hướng xuyên tâm, là bước đầu tiên trong quá trình tạo củ ở cỏ gấu, cũng như khoai tây (Fujino và cộng sự, 1995) và nghệ đen (Nguyễn Thị Duy Bình và Bùi Trang Việt, 2011). Ở củ cỏ gấu, dầu tích lũy chủ yếu trong mô mềm, do đó, nếu mô phân sinh dày cấp một càng hoạt động mạnh thì đường kính củ và số lượng mô mềm tích lũy dầu càng nhiều. Mô phân sinh dày hoạt động sớm từ tuần 1, sau đó ngừng hoạt động rất nhanh ở tuần 2, nên sau đó củ bắt đầu kéo dài thay vì tăng rộng. ● Liên hệ xuất-nhập giữa lá thân, lá bắc, phát hoa và củ Ở cỏ gấu, sự tăng trưởng dinh dưỡng của phần khí sinh, phát triển hoa và củ diễn ra theo một trình tự xác định (hình 3.1). Sự phù củ xảy ra rất sớm trong hai tuần đầu, do hoạt động của mô phân sinh dày cấp một và gần như đồng thời với sự xuất hiện và tăng trưởng của các lá thân. Sau đó, củ vào giai đoạn tăng trưởng chậm cho tới tuần 6, do mô phân sinh dày cấp 14 một ngừng hoạt động sớm, dù số lá thân không ngừng gia tăng. Củ tăng trưởng rất nhanh từ tuần 6 cho tới tuần 12 (nhờ sự tăng trưởng tế bào) cùng với sự xuất hiện của các lá bắc, dù hoa đã xuất hiện và chồi con bắt đầu nhú lên từ tuần 10. Củ giảm tăng trưởng ở tuần 12 - 14, khi hoa phát triển thành trái và chồi trên củ đã phát triển thành cây con, với phần gốc đã phù lên thành củ, và lá thân ban đầu vào giai đoạn lão suy. Phát hoa cùng với trái đang phát triển và các củ non là các cơ quan nhập cạnh tranh dòng carbon với củ đang tăng trưởng và tích lũy chất dự trữ. Hình 3.1. Sơ đồ liên hệ giữa sự xuất hiện hoa và củ ở thứ cỏ gấu esculentus. Sự đặt xuôi khúc cắt ngọn bị cắt bỏ hoa từ cây 12 tuần tuổi làm tăng lượng sucrose xuất ra so với đối chứng vẫn giữ nguyên hoa, và sự đặt xuôi khúc cắt gốc làm giảm lượng sucrose xuất ra so với đặt ngược chứng tỏ, dòng sucrose được chuyển lên phần ngọn để nuôi hoa rất mạnh. Lá bắc quang hợp, góp phần giữ vai trò xuất, giúp cây không dùng cạn năng lượng dự trữ từ củ, và do đó củ có khả năng tích lũy lipid khi mang hoa. Đối với trắc nghiệm với ba loại khúc cắt cuống phát hoa cấp một, lượng đường thoát ra từ phần gốc của khúc cắt ngọn chưa mang hoa nhiều hơn so với khúc cắt ngọn mang hoa. Điều này cho thấy, ngọn mang hoa là nơi nhập mạnh sucrose. Do đó, nếu cắt bỏ phát hoa cấp hai, lượng sucrose 15 thoát ra ở phần gốc tăng vượt trội so với đối chứng, do dòng chuyển vị sucrose lên ngọn giảm. Kết quả thí nghiệm cắt cơ quan trong vườn thực nghiệm cho thấy, cây cỏ gấu nguyên vẹn chịu tương tác của các cơ quan khác nhau: lá thân, lá bắc, phát hoa các cấp và củ. Vào ban ngày, lá quang hợp, một phần sucrose được chuyển đến các cơ quan khác, phần còn lại được dự trữ tạm thời ở lá. Vào ban đêm, tinh bột được thủy giải và chuyển đến các cơ quan (Nguyễn Quốc Bình, 1991). Do đó, trong tối, có sự xuất sucrose mạnh từ các khúc cắt cuống phát hoa cấp một, và hàm lượng sucrose tổng luôn cao hơn so với nghiệm thức sáng. Trong tối, lượng sucrose trong cuống phát hoa cấp một giảm mạnh khi cắt cả lá bắc cấp một, hoa và các phần phụ của hoa. Lá bắc và lá thân đóng vai trò quan trọng trong mối quan hệ nhập-xuất giữa hoa và củ, như được tóm tắt trong hình 3.2: - Khi cây tăng trưởng dinh dưỡng, lá thân là nơi nhập duy nhất của củ (củ lúc đầu là nơi xuất). - Khi cây mang hoa và trái ở giai đoạn 12 tuần tuổi và củ cấp một tạo củ cấp hai, thì củ cấp một trở thành nơi xuất quan trọng cho các nơi nhập: củ cấp hai, cuống phát hoa cấp một và phát hoa cấp hai, dù vẫn còn là nơi nhập các sản phẩm từ lá thân, cuống phát hoa cấp một và lá bắc. - Lá thân trước tuần 6 còn là nơi nhập, nhưng sau tuần 6 trở thành nơi xuất quan trọng cho củ cấp một, cuống phát hoa cấp một và phát hoa cấp hai. - Cuống phát hoa cấp một là nơi nhập các sản phẩm từ củ, lá thân và cả lá bắc cấp một, và là nơi xuất (sucrose từ sự thủy giải tinh bột dự trữ) cho củ và phát hoa. 16 Hình 3.2. Sơ đồ các nơi xuất và nhập ở cây non và trong giai đoạn sinh sản của cỏ gấu 17 ● Hiệu ứng hormone trong sự tăng trưởng và tích lũy lipid ở củ cỏ gấu Ở giai đoạn phù củ, gibberellin giúp tăng đường kính củ do mô phân sinh dày phân chia và kéo dài theo trục dọc của thân (Abelenda và cs, 2014). Gibberellin làm gia tăng sự thủy giải tinh bột (Barani vàcs., 2012), cung cấp tiền chất cho sinh tổng hợp lipid trong củ, và có thể là một tín hiệu hoạt hóa sự chuyển đổi các con đường biến dưỡng tinh bột, lipid và đường, kích thích sự chuyển vị trong libe, và làm gia tăng sức hút của nơi nhập đang phát triển (Iqbal và cs., 2011). Ở cỏ gấu, hoạt tính zeatin tăng theo sự tăng trưởng củ, từ giai đoạn tăng trưởng chậm đến giai đoạn tăng trưởng nhanh, đồng thời với sự tăng hàm lượng lipid. Tỉ lệ gibberellin/zeatin cao trong củ có khuynh hướng thủy giải tinh bột, do đó hàm lượng lipid cao (Seo và cộngsự, 2009). Hoạt tính auxin giảm vào đầu giai đoạn tăng trưởng nhanh, sau đó tăng ở gần cuối giai đoạn này, đúng vào thời điểm cây mang hoa đồng thời với sự gia tăng hàm lượng lipid mạnh nhất. Hoạt tính của auxin giảm ở tuần 10 và tăng lên ở tuần 12, trong khi sự gia tăng trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng lipid ở tuần 10 và 12 ở củ cỏ gấu. Do đó, không thể nói auxin kích thích hay làm giảm hàm lượng lipid. Auxin kích thích sự thành lập củ (Roumeliotis và cộng sự, 2012), vì hàm lượng auxin ở củ cỏ gấu tăng cao ở tuần 12 là giai đoạn củ mang nhiều mầm chồi trên củ mẹ. Auxin cũng giúp sự phân chia tế bào và tăng trưởng củ (Xu và cộng sự, 1998)  Mối quan hệ giữa hoạt động biến dưỡng, tăng trưởng và sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Dựa vào các kết quả thí nghiệm, mối liên hệ giữa hoạt động biến dưỡng và sự thay đổi hàm lượng các chất chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng và tích lũy lipid ở củ cỏ gấu thứ esculentus được tóm tắt trong hình 3.3: 18 - Cỏ gấu tích lũy lipid từ rất sớm và hàm lượng lipid tăng theo các giai đoạn tăng trưởng của cây và củ cho, tăng đến giai đoạn cây ra hoa, và chỉ giảm khi cây đang mang trái và mầm trên củ phát triển thành cây con mới (ở tuần 13-14). - Khi hàm lượng tinh bột giảm thì lipid tăng, và ngược lại. - Khi quang hợp của lá thân giảm thì quang hợp của lá bắc tăng, để góp phần tạo chất hữu cơ cho cây. - Hoạt tính auxin giảm ở đầu giai đoạn tăng trưởng nhanh nhưng tăng lên vào giai đoạn tăng trưởng nhanh, ABA tăng hoặc không đổi trong suốt giai đoạn tích lũy lipid, zeatin và gibberellin tăng trong suốt giai đoạn tăng trưởng củ. Hình 3.4. Mối liên hệ giữa hoạt động biến dưỡng và sự thay đổi hàm lượng các chất chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng và tích lũy lipid ở củ cỏ gấu thứ esculentus ( : tăng, : giảm, : không thay đổi). 19  Xử lý thay đổi hàm lượng nước của đất ruộng Đối với cây 12 tuần tuổi, sự tháo nước làm tăng mạnh hàm lượng lipid của củ, so với đối chứng ngập nước. Sự giảm hàm lượng nước trong đất giúp sự tích lũy dầu ở củ cỏ gấu, nhưng có tác dụng ngược lại ở Jojoba (Ali và cs., 2012). Sự tháo nước liên quan tới stress nước nhẹ, giúp đất thoáng khí hơn, tế bào rễ và củ hô hấp mạnh hơn, các sản phẩm quang hợp di chuyển xuống rễ mạnh hơn và được dùng để tổng hợp và tích lũy các chất dự trữ, bao gồm lipid trong củ. Stress nước ở thực vật thường xảy ra bởi sự khô, tác động qua vai trò của ABA lên sự biến dưỡng (Lobell và cs., 2013). Trên đồng ruộng, quá trình gây stress dễ bị gián đoạn.  Xử lý gibberellin, thiourea, PBZ, ethrel và các muối Trong môi trường ngập hay tháo nước, kết hợp sự cắt hoa với phun gibberellin làm giảm hoặc tăng nhẹ hàm lượng lipid của củ. Kết quả này xác nhận vai trò cản sự tích lũy lipid của gibberellin. Tuy nhiên, khi kết hợp với sự xới đất, gibberellin giúp tăng hàm lượng lipid, có lẽ gián tiếp qua sự thủy giải tinh bột và giúp quá trình tăng trưởng. Khi phun thiourea lên phần khí sinh, hàm lượng lipid của củ tăng mạnh. Thiourea làm tăng sự chuyển vị sucrose từ nơi xuất tới nơi nhập, và do đó tăng năng suất củ (Srivastava và cộng sự, 2008). Ở củ cỏ gấu, hàm lượng lipid tăng khoảng 23 %, phù hợp với nghiên cứu của Pandey và cộng sự (2013), tăng 10 - 20 % khi xử lý thiourea. Ở nghiệm thức xới đất, chiều dài cuống phát hoa cấp một giảm khi phun gibberrellin, phun hay tưới PBZ, và tăng khi phun ethrel, KNO 3, NaCl và phun hỗn hợp thiourea và PBZ, nhưng các xử lý này đều làm giảm hàm lượng lipid so với đối chứng. Như vậy, ở cỏ gấu, PBZ giúp tăng trưởng, phù hợp với nghiên cứu của Moreno và cộng sự (2011). Ethrel hay các muối KNO3 và NaCl giúp cây tăng trưởng, nhưng không giúp tích lũy lipid. 20  Xử lý cắt hoa và xới đất Khi cắt hoa, dù trong điều kiện ngập hay tháo nước, cây 10 tuần tuổi hay 12 tuần tuổi, hàm lượng lipid của củ đều tăng mạnh so với đối chứng. Điều này một lần nữa cho thấy, phát hoa đang phát triển là vùng nhập mạnh, thu hút mạnh sucrose, nên khi bị loại bỏ thì sucrose tập trung về củ, giúp tăng tích lũy lipid trong củ. Hàm lượng lipid tăng mạnh nhất khi cắt hoa và xới đất ở tuần 10, tăng 58% so với đối chứng cắt hoa, trong khi cắt hoa và xới đất ở tuần 12 chỉ làm tăng 21% so với đối chứng cắt hoa. Điều này cho thấy các tác động làm tăng hàm lượng lipid hiệu quả hơn nếu được thực hiện sớm ở tuần 10, khi vùng nhập phát hoa chưa phát triển mạnh. Khi cắt bỏ phát hoa, hàm lượng lipid tăng đáng kể vào mùa mưa và tăng mạnh hơn nhiều vào mùa khô ở cây 12 tuần tuổi. Điều này cho thấy, mùa mưa giúp cho cỏ gấu tăng trưởng nhanh, nhưng mùa khô thích hợp cho việc tích lũy lipid. ● Ảnh hưởng của các xử lý đến thành phần và hàm lượng acid béo Thành phần và hàm lượng acid béo trong dầu thứ esculentus ở mẫu đối chứng tương tự với kết quả đã công bố của Bado và cộng sự (2015) ở Cyperus esculentus L., hầu hết các acid béo chuỗi dài (C14 - C20). Ở cỏ gấu với thành phần chủ yếu là acid oleic (C:18,1), khoảng 42,24 %, khá cao so với dầu oliu (dầu có giá trị dinh dưỡng cao) là 58,8-80 % (Leon và cs., 2004). Sự cắt hoa và xới đất (ở cây 10 tuần tuổi) chủ yếu làm giảm bớt sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa hoa và củ, tập trung dòng năng lượng về củ, từ đó làm tăng hàm lượng lipid trong củ, nhưng không làm thay đổi thành phần acid béo. Khác hơn, xử lý thiourea, mặc dù hàm lượng acid béo không