Tài liệu Thực hành công nghệ sinh học

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI 1 SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN I. Tổng quan Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn. Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất được sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới. Nguyên liệu chính dùng để sản xuất men là mật rỉ, ngoài ra một số hóa chất khác sẽ được cung cấp trong quá trình nuôi cấy men để bổ sung các chất dinh dưỡng mà mật rỉ không đủ[3]. Hình 1: Saccharomyces cereviseae cereviseae có những yêu cầu công nghệ sau[2]: Có sức phát triển maajnh trong dịch đường lên men. Có khả năng tiết ra hệ enzyme zimaza để lên men nhanh và hoàn toàn. Có khả năng lên men ở nhiệt độ tương đối cao mùa hè (35-380). Có khả năng chịu được ở độ cồn tương đối ( khoảng trên 10 0) trong quá trình Saccharomyces lên men. Chịu được ở môi trường acid, có pH khoảng 4-4,5 hoặc thấp hơn. Trong quá trình nuôi cấy nấm men người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồn lên men theo lượng cồn có trong môi trường lên men. Nếu lượng mật nạp vào nhiều quá nấm men sẽ không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khiến nồng độ cồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu lượng mật nạp vào quá ít nấm men sẽ thiếu dinh dưỡng cho sinh trưởng[3]. Chất lượng của nấm men phụ thuộc vào công dụng của nó. Nếu sản xuất men bánh mì thì năng lực sinh khí trong bột (hoạt tính) là thông số cần kiểm soát, nếu nấm men dùng cho công nghiệp cồn t hì khả năng chịu nồng độ cồn cao là quan trọng[3]. Hiện nay nhờ vào tiến bộ của công nghệ gen nên người ta có thể tạo ra các chủng nấm men phù hợp với các công dụng của nó và cho năng suất cao. Tuy nhiên công nghệ kiểm soát quá trình lên men vẫn đóng vai trò quan trọng để sản xuất các mẻ men chất lượng và sản lượng cao[3] Quy trình sản xuất nấm men có thể tóm tắt như sau[3]: Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm  Nuôi cấy men giống trong nhà máy  Ly tấm men giống  Nuôi cấy men thương mại  Ly tấm men thương mại  Lọc men  Đóng gói sản phẩm men tươi hoặc sấy khô để có sản phẩm men khô. 1 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sản phẩm men tươi có thời hạn sử dụng ngắn chỉ vài tuần và phải trữ lạnh, sản phẩm men khô có thời hạn sử dụng dài hơn, thường trên 1 năm nếu được hút chân không và được trữ trong điều kiện thường[3]. Quá trình sản xuất men sẽ tiêu tốn rất nhiều nước và thải ra môi trường một lượng lớn nước thải với hàm lượng COD và BOD cao đòi hroi các nhà máy pahri trang bị một hệ thống xử lý nước thải[3].  Đánh giá chất lượng men trong sản xuất: Những nòi men rượu được dùng trong sản xuất cần có những yêu cầu sau: hoạt lực lên men cao, chịu được độ rượu cao, có khả năng phát triển và hoạt động trong môi trường acid, có thể chịu đựng được một số sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật tạp nhiễm[2]. Những giống men rượu tinh bột cần phải lên men được glucose, maltose và các mono hoặc disaccarit khác có chứa trong môi trường cũng như biến đổi được các dextrin[2]. Nấm men dùng trong thùng lên men cần có những chỉ số sau: số lượng tế bào nảy chồi 10-15%, lượng tế bào chết không quá 2-4% ( số này tăng có nghĩa là trong môi trườgn có mặt các tác nhân kìm hãm hoạt động sống của nấm men); số tế bào chứa glycogen không nhỏ hơn 70% số lượng tế bào nấm men không nhỏ hơn 120 – 140 triệu/ ml [3]. II. Nguyên vật liệu và phương pháp thí nghiệm II.1 Nguyên vật liệu - Giống nấm men được sử dụng là Saccharomyces cerevisiae được nuôi và giữu trong ống nghiệm thạch nghiêng. - Thiết bị lắc ổn nhiệt - Kính hiển vi - Buồng đếm hồng cầu - Dung dịch Methylen blue( cần được lọc bỏ tạp chất vì nếu có tạp chất thì khi quan sát trong kính hiển vi sẽ khó đếm được tế bào nấm men) - Nhóm chuẩn bị môi trường gồm các thành phần sau: + Peptone: 1% + Yeast extract: 0,5% + Saccharose: 5% + NaCl: 0,5% + Nước cho đủ 250 ml II.2 Phương pháp thí nghiệm II.2.1 Sản xuất sinh khối - Chuyển giống( mà cán bộ phòng thí nghiệm đã nuôi cấy trong 72 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng) vào bình chứa môi trường đã chuẩn bị. - Số lượng nấm men được thêm vào môi trường là ml. - Cho bình tam giác vào thiết bị lắc ổn nhiệt, lắc với tốc độ 220 rpm. 2 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC - Nhiệt độ: 28-350C, pH = 4,5- 7,0. II.2.2 Tiến hành quan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu. - Các chỉ tiêu cần quan sát: + Tổng số tế bào/ml + Tổng số tế bào nấm men nảy chồi + Tổng số tế bào nấm men chết - Cách tiến hành: + Hút 5ml dung dịch đã bổ sung nấm men cho vào ống nghiệm + Từ 5ml trên hút 4ml dung dịch cho vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1 giọt Methylen blue. Lắc đều trong vòng 1 phút để màu thấm vào tế bào chết. Cho dung dịch trong ống nghiệm lên buồng đếm hồng cầu và quan sát dưới kính hiển vi. o Đếm tổng số tế bào trên 5 ô vuông lớn. o Đếm tổng số tế bào chết( là tế bào có màu xanh, mà khi quan sát ta thấy tế bào toàn màu đen) trên 5 ô vuông lớn. o Đếm tổng số nấm men nảy chồi trên 5 ô vuông lớn. Chỉ đếm những tế bào có chồi < ½ tế bào mẹ, các chồi > ½ tế bào mẹ được tính là một tế bào riêng lẻ. o Từ lần đếm thứ 2 trở lên nên pha loãng gấp 2,3…với nước để dễ quan sát vì sau thời gian lắc ổn nhiệt thì số lượng tế bào nấm men sẽ tăng. II.2.3 Tiến hành đo độ hấp thu A600nm - Sau khi hút 4ml từ dung dịch mẫu để đếm tế bào thì 1ml còn lại sẽ pha với 4ml nước rồi đem đi đo độ hấp thu với bước sóng là 600nm.  Lưu ý: - Cần tiến hành đo độ hấp thu và đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu trong thời gian gần nhau vì nếu để 2 thí nghiệm này cách xa nhau sẽ làm sai lệch kết quả vì tế bào nấm men nảy chồi hay chết rất nhanh. Ví dụ: khi ta đo độ hấp thụ xong, khoảng nữa tiếng sau mới đếm tế bào thì số lượng tế bào để đếm và để đo độ hấp thu là khác xa nhau. - Khi đếm trên buồng đếm hồng cầu thì thời gian đếm không được quá 15 phút, vì nếu đếm lâu quá thì số lượng tế bào sẽ thay đổi. - Khi cho Methylen blue vào thì cần cho 1 lượng rất ít vì nếu cho quá nhiều sẽ làm đục dung dịch và khó đếm. - Cần chú ý khoảng thời gian chờ giữa các lần đếm tế bào là như nhau để đảm bảo kết quả ít bị sai lệch - Sau mỗi thời gian lắc ổn nhiệt để tế bào nấm men phát triển thì khi đếm tế bào cần pha loãng dung dịch để dễ đếm số lượng tế bào III. Kết quả và biện luận 3 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC III.1 Số liệu khi thực hành Thời gian (giờ) Độ pha loãng A600nm 8h 9h 10h 11h 12h 13h 14h 0 0 3 lần 4 lần 5 lần 6 lần 7 lần 0,153 0,159 0,224 0,291 0,339 0,371 0,546 III.2 Tổng số Tổng tế bào số tế trong 5 bào ô vuông lớn 875 175 1155 231 1320 264 2060 412 3175 635 4200 840 7070 1414 Kết quả - Tổng số tế bào (tính trung bình) = Tổng số tế bào nảy chồi 105 185 210 200 375 570 1560 Tổng số tế bào nảy chồi trong 5 ô vuông lớn 21 37 42 40 75 114 312 Tổng số tế bào chết Tổng số tế bào chết trong 5 ô vuông lớn 10 5 0 0 25 0 70 2 1 0 0 5 0 14 875  1155  1320  2060  3175  4200  7070 7 = 2836 tế bào 105  185  210  200  375  570  1560 7 - Tổng số tế bào nảy chồi (tính trung bình) = = 458 tế bào 10  5  0  0  25  0  70 7 - Tổng số tế bào chết (tính trung bình) = 3.2.1 Cách tính số tỉ lệ tế bào nảy chồi, tế bào chết: - Tổng số tế bào trong 1 ml nghiên cứu + Lúc 8 giờ t: 4 = 16 tế bào THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC  175 x 400  3  80 x0,1  x10 x1   N1 = (a/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 9 giờ:  231x 400  3  80 x0,1  x10 x1   N2 = (a/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 10 giờ:  412 x400  3  80 x0,1  x10 x 4   N4 = (a/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 12 giờ: N6= (a/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 14giờ: = 1155x104 tế bào  264 x 400  3  80 x0,1  x10 x3   N3 = (a/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 11 giờ: N5= (a/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 13giờ: = 875x104 tế bào  635 x 400  3  80 x0,1  x10 x5    840 x 400  3  80 x0,1  x10 x6   = 3960x104 tế bào = 8240x104 tế bào = 15875x104 tế bào = 25200x104 tế bào  1414 x 400  3  80 x0,1  x10 x 7   N7= (a/b x 400/0,1) x 103 x n = = 49490x104 tế bào Tổng số tế bào trong 1ml nghiên cứu( tính trung bình) Na = N1  N 2  N 3  N 4  N 5  N 6  N 7 7 875  1155  3960  8240  15875  25200  49490 7 = =14971x104 tế bào - Tổng số tế bào chết trong 1ml nghiên cứu: + Lúc 8giờ: N1 = (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 9 giờ:  2 x 400  3  80 x0,1  x10 x1   5 =100x103 tế bào THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC N2 = (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 10 giờ: N3 = (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 11 giờ: N4 = (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 12 giờ: N5= (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 13giờ: N6= (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 14giờ:  1x 400  3  80 x0,1  x10 x1    0 x 400  3  80 x 0,1  x10 x3    0 x 400  3  80 x0,1  x10 x 4    5 x 400  3  80 x 0,1  x10 x5   = 50x103 tế bào = 0 tế bào = 0 tế bào = 1250x103 tế bào  0 x 400  3  80 x0,1  x10 x6   = 0 tế bào  14 x 400  3  80 x0,1  x10 x 7   N7= (a1/b x 400/0,1) x 103 x n = = 4900x103 tế bào Tổng số tế bào chết tính trong 1ml mẫu nghiên cứu (tính trung bình) Nb = N1  N 2  N 3  N 4  N 5  N 6  N 7 7 = 100  50  0  0  1250  0  4900 7 4 90x10 tế bào - Tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứu: + Lúc 8giờ: N1 = (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 9 giờ: N2 = (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 10 giờ:  21x 400  3  80 x 0,1  x10 x1    37 x 400  3  80 x0,1  x10 x1   6 =105x104 tế bào = 185x104 tế bào = THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC N3 = (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 11 giờ: N4 = (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 12 giờ: N5= (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 13giờ: N6= (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = + Lúc 14giờ:  42 x 400  3  80 x 0,1  x10 x3   = 630x104 tế bào  40 x 400  3  80 x0,1  x10 x 4    75 x 400  3  80 x0,1  x10 x5   = 800x104 tế bào = 1875x104 tế bào  114 x 400  3  80 x0,1  x10 x 6   = 3420x104 tế bào  312 x 400  3  80 x0,1  x10 x7   N7= (a2/b x 400/0,1) x 103 x n = = 10920x104 tế bào Tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứu (tính trung bình): Nc = N1  N 2  N3  N 4  N 5  N 6  N 7 7 = 105  185  630  800  1875  3420  10920 7 - = 2562x104 tế bào Tỉ lệ tế bào nấm men chết(%) = Nb/Na x 100 + Lúc 8giờ: 100 x103 875 x104 x100= 1,14% 3 + Lúc 9giờ: 50 x10 1155 x104 x100= 0,43% 3 + Lúc 10giờ: 0 x10 3960 x104 x100= 0% 3 + Lúc 11giờ: 0 x10 8240 x104 x100= 0% 7 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC + Lúc 12giờ: 1250 x103 15875 x104 x100= 0,79% 3 + Lúc 13giờ: 0 x10 25200 x104 x100= 0% 3 + Lúc 14giờ: - 4900 x10 49490 x104 x100= 1% Tỉ lệ tế bào nấm men nảy chồi(%) = Nc/Na x 100 + Lúc 8giờ: 105 x104 875 x104 x100= 12% 4 + Lúc 9giờ: 185 x10 1155 x104 + Lúc 10giờ: + Lúc 11giờ: x100= 16% 630 x104 3960 x104 x100= 16% 800 x104 8240 x104 x100= 9,7% 4 + Lúc 12giờ: 1875 x10 15875 x104 x100= 11,8% 4 + Lúc 13giờ: 3420 x10 25200 x104 x100= 13,6% 3 + Lúc 14giờ: 10920 x10 49490 x104 x100= 22,1% Với: Na: Tổng số tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu Nb: Tổng số tế bào chết trong 1ml mẫu nghiên cứu Nc: Tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứu a: Tổng số tế bào trong 5 ô vuông lớn a1: Tổng số tế bào chết trong 5 ô vuông lớn a2: Tổng số tế bào nảy chồi trong 5 ô vuông lớn 8 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16x5 = 80 ô vuông nhỏ) 400: Tổng số ô vuông nhỏ 0,1: Thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm 103: Số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1 ml) n: Độ pha loãng của mẫu dung dịch nuôi cấy nấm men 3.2.2 Cách tính thông số về sinh trưởng và phát triển của nấm men trong mẫu thí nghiệm a) Thời gian thế hệ (g) Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là N 0 thì sau n lần phân chia ta sẽ có tổng số tế bào là N, với t = (t2-t1) biểu thị sự sai khác giữa thời gian t1 và thời gian t2 trong trường hợp của bài thí nghiệm này, t = t2 - t1 = 1 giờ). g= t n lg 2(t 2  t1 ) lg N  lg N 0 = + Lúc 9h: g = log 2 7,1  6,9 + Lúc 10h: g = + Lúc 11h: g = + Lúc 12h: g = + Lúc 13h: g = + Lúc 14h: g = = 1,5 log 2 7, 6  6,9 log 2 3,9  6,9 log 2 8, 2  6,9 log 2 8, 4  6,9 log 2 8, 7  6,9 = 0,4 = -0,1 = 0,23 = 0,2 = 0,17 b) Hằng số tốc độ phân chia (c) Giá trị nghịch đảo của thời gian thế hệ hay là số lần phân chia sau một đơn vị thời gian ( tức là sau 1 giờ) gọi là hằng số tốc độ phân chia ( c ). Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc vào: loài vi sinh vật, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy… 9 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1 g c= n t = 1 1,5 + Lúc 9h: g = = 0,7 1 0, 4 + Lúc 10h: g = + Lúc 11h: g = = 2,5 1 0,1 = -10 1 0, 23 + Lúc 12h: g = = 4,34 1 0, 2 + Lúc 13h: g = =5 1 0,17 + Lúc 14h: g = = 5,9  c) Hằng số tốc độ sinh trưởng ( )  Mối quan hệ giữa hằng số tốc độ sinh trưởng ( ), hằng số tốc độ phân chia (c) và thời gian thế hệ ( g ):   0, 69c   0, 69 g 0, 69 1,5 + Lúc 9h: = 0,46 0, 69  0, 4 + Lúc 10h: = 1,725  + Lúc 11h: 0, 69 0,1 = -6,9 0, 69  0, 23 + Lúc 12h: =3 10 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC  0, 69 0, 2 + Lúc 13h: = 3,45  + Lúc 14h: d) Đo độ đục 0, 69 0,17 = 4,1  Abs=KxC Với :K là hằng số C là số lượng tế bào đếm được  Vậy K = Abs là độ hấp thu ánh sáng Abs C Thời gian (giờ) 8h 9h 10h 11h 12h 13h 14h Tổng số tế bào 875 1155 1320 2060 3175 4200 7070 A600nm 0,153 0,159 0,224 0,291 0,339 0,371 0,546 K 1,75x10-4 1,38x10-4 1,7x10-4 1,41x10-4 1,07x10-4 8,83x10-5 7,72x10-5 Bảng kết quả thí nghiệm Thời gian (giờ) A600nm 8h 9h 10h 11h 12h 13h 14h 0,153 0,159 0,224 0,291 0,339 0,371 0,546 lgNa lgNb lgNc (tb/ml) (tb/ml) (tb/ml) 6,9 7,1 7,6 3,9 8,2 8,4 8,7 5 3,7 6,1 6,7 6 6,3 6.8 6,9 7,3 7,5 8 Tỉ lệ chết ( %) 1,14 0,43 0 0 0,79 0 1 11 Tỉ lệ nảy chồi (%) 12 16 16 9,7 11,8 13,6 22,1 g c 1,5 0,4 -0,1 0,23 0,2 0,17 0,7 2,5 -10 4,34 5 5,9  0,46 1,725 -6,9 3 3,45 4,1 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 8h là thời điểm ngay khi vừa cho giống vào môi trường nuôi cấy. Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thụ A600nm và nồng độ tế bào 8000 TỔNG SỐ TẾ BÀO 7000 6000 f(x) = 17791.65 x^1.6 R² = 0.96 5000 4000 3000 2000 1000 0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 A600nm ĐỒ THỊ BIỂU DIỄN MỐI QUAN HỆ GIỮA THỜI GIAN THẾ HỆ VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY 12 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.6 THỜI GIAN THẾ HỆ 1.4 1.2 1 0.8 0.6 f(x) = -0.83 ln(x) + 2.34 R² = 0.1 0.4 0.2 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 THỜI GIAN NUÔI CẤY III.3 Biện luận Kết quả có thể không chính xác do: - Tiến hành đo độ hấp thu và đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu trong thời gian không gần nhau vì nếu để 2 thí nghiệm này cách xa nhau sẽ làm sai lệch kết quả vì tế bào nấm men nảy chồi hay chết rất nhanh. - Khi đếm trên buồng đếm hồng cầu thì thời gian đếm quá 15 phút, do điều chỉnh kính hiển vi, dẫn đến số lượng tế bào tăng hay giảm. - khoảng thời gian chờ giữa các lần đếm tế bào bị sai lệch. - Sau mỗi thời gian lắc ổn nhiệt để tế bào nấm men phát triển thì khi đếm tế bào không pha loãng dung dịch nên khó đếm số lượng tế bào. - Khi đo độ hấp thu không đo mẫu chuẩn trước. - Buret đựng dung dịch cần đo độ hấp thu bị trầy xước. - Buồng đếm hồng cầu hay kính hiển vi mờ nên không đếm chính xác số lượng tế bào. - Người đếm tế bào bị mệt hay mờ mắt nên đếm không kĩ. 13 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI 2 SẢN XUẤT THẠCH DỪA I. Tổng quan Thạch dừa ( Nata de coco) được tạo thành bởi sự lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già. Thạch dừa là sản phẩm trắng trong như thạch agar, hơi dai, có bản chất hóa học là polysaccharide nên không có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng có đặc tính kích thíc nhu động ruột làm cho việc điều hòa bài tiết được tốt hợn. Chế phẩm từ dừa này còn có tác dụng phòng ngừa ung thư và có thể giữ cho da được mịn màng. Những năm gần đây, số lượng người mắc bệnh béo phì ở các nước phát triên đang gia tăng rất nhanh. Thạch dừa là loại thực phẩm chứa ít năng lượng và có giá trị cảm quan cao, là một phương thuốc thần diệu để giảm nguy cơ mắc bệnh béo phì [4]. 1.1Thành phần của trái dừa - ứng dụng Dừa là cây thuộc họ Palmas, bộ Sapdiciflorales. Cây dừa thường ra hoa từ năm 7-12 tuổi sau khi trồng. Từ thụ phấn đến khi trái chin là 12-13 tháng. Khi chin, trái dừa nặng 1,2-2 kg[4]. Bảng 1: Thành phần và khối lượng các bộ phận trên trái dừa nặng 1,2kg[4]. STT 1 2 3 4 Bộ phận Vỏ Gáo Nước dừa Cơm dừa Dầu dừa Bã dừa ẩm Trọng lượng (kg) 0,4 0,18 0,26 0,36 0,12 0,06 0,18 % khối lượng 33 12 25 30 1.1.2 Vỏ dừa: Gồm xơ và bụi xơ. Xơ dừa dùng để se chỉ hay đan lưới, xoắn hay tấm cao su làm nệm giường, bọc ghế, thảm, màng lọc không khí, chất cách nhiệt…nhưng hiệu quả kinh tế kém khi triển khai ở qui mô lớn[4]. 14 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.1.3 Gáo dừa Nằm dưới lớp vỏ, hình cầu, có bề dày 3-5 mm. Thành phần chính của gáo dừa là ligin, cellusoe, pentosan giống như gỗ. Được ứng dụng làm chất đốt (cháy đề, không khói) [4]. 1.1.4 Cơm dừa Chất rắn màu trắng, bè dày khoảng 10 mm, bên ngoài có một lớp vỏ nâu mỏng. Cơm dừa được ứng dụng làm thực phẩm dưới nhiều dạng sản phẩm khác nhau (cơm dừa khô, cơm dừa nạo sấy, sữa dừa đóng hộp…)[4]. 1.1.5 Nước dừa Trung bình một trái dừa có chứa 300ml nước, chiếm 25% trọng lượng trái dừa. Nước dừa là loại nước giải khát phổ biến vì chứa nhiều chất dinh dưỡng như: đường, protein, lipid, vitamin, và khoáng nhưng với nồng độ rất loãng[4]. Bảng 2: Thành phần hóa học của nước dừa[4]. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Thành phần Chất khô Đường tổng số Tro K Na Ca Mg Fe Cu P S Protein Dầu béo Khối lượng 4,71 2,08 0,002 3,12 1,5 2,9 3,0 0,01 0,04 3,7 3,4 0,55 1,02 Bảng 3: Các vitamin có trong nước dừa[4] STT 1 2 Vitamin Acid ascorbic Penthothennic 15 Hàm lượng (g/l) 3 0,052 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 3 4 5 Acid nicotinic Acid folic Riboflavin 0,064 0,03 0,00001 Bảng 4: Các acid amin có trong nước dừa[4]. STT Acid amin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Acid glutamic Arginine Leucine Lysine Proline Aspartic Tyrosine Alamine Histidine Pheny alanin Senine Cystenin Hàm lượng (% khối lượng/ amin tổng số) 14,5 12,75 4,18 4,51 4,12 3,6 2,83 2,41 2,05 1,23 0,91 1,17 1.2 Vi sinh vật trong sản xuất thạch dừa 1.2.1 Đặc điểm giống vi khuẩn Acetobacter: Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rỗng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế[4] . Vi khuẩn Acetobacter: Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy ( nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hay phình to ra. Không sinh nha bào tử, hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Tế bào đứng riêng lẻ hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:  Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc. 16 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC  Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc.  Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.  Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.  Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành váng không chắc chắn.  Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Fe, P, S… ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter. Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B 1, B2, oxy hóa sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4]. 1.2.2 Phân loại Acetobacter Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter schutzenbachii: trực khuẩn dài, tạo thành ván dày, và không bền vững, có khả năng tích lũy trong môi trường đến 11,5% acid acetic do đó thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp nhanh (phương pháp của Đức) [4]. Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như acid para aminopenzoic, acid panthoteric, acid nicotinic[5]. Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo ra váng rất dày trên môi trường dịch thể. Có thể phát triển được có nồng độ rượu cao (10%-20%) và làm tích lũy đến 9,5% acid acetic. Thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm (phương pháp của Pháp). Phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-300C[5]. Acetobacter xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá dày. Váng có chứa hemicelluloses nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iod sẽ bắt màu xanh. Có thể tích lũy 4,5% acid acetic trong môi trường. Thường gặp loài vi khuẩn này cung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thủy hoài sâm”, một loại sản phẩm giải khát bổ dưỡng theo cách làm của người Trung Hoa. Đó là một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong các gia đình người Trung Hoa, trên mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè và đường [5]. Acetobacter aceti: trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng chuỗi dài. Váng của vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm iod, chúng có thể 17 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC phát triển trong môi trường có đồng độ rượu khá cao 11% và có thể tích lũy đến 6% acid acetic trong môi trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 340C [5]. Acetobacter pasteurianum: hình dạng tương tự như loại trên nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc iod [5]. 1.2.3 Phân lập Vi khuẩn Acetobacter có thể được phân lập từ giấm, rượu, bia, hoa quả, chuối chin, váng giấm…ví dụ: muốn phân lập vi khuẩn Acetobacter từ không khí, người ta pha rượu thành dung dịch 5-6% (hoặc theo kinh nghiệm dân gian, chỉ cần lấy một phần rượu hòa với 7 phần nước lã, đựng trong cốc miệng rộng, giữ ở tủ ấm 30 0C trong 2-3 ngày. Rượu sẽ đục và trên mặt xuất hiện một váng mỏng. Lấy váng mỏng này pha loãng ra, và phân lập trên môi trường thạch dĩa [5] Để ức chế sự phát triển của các loại nấm men Mycoderma (thường phát triển đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter), người ta bổ sung vào môi trường phân lập 1-1,5% acid acetic. Do những ưu điểm vượt trội của chủng Acetobacter xylinum đã được nêu ở trên nên Acetobacter xylinum được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [5] 1.2.4 Giống Acetobacter xylinum: Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn gốc từ Philippien. Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic. Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae[5].  Acetobacter xylinum là loại vi khuẩn dài khoảng 2 m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicelluloses khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm iod và H2SO4[5]. Acetobacter xylinum sinh trưởng ở pH < 5, nhiệt độ là 28-32 0C và có thể tích lũy 4,5% acid acetic. Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động của vi khuẩn[5]. Acetobacter xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào. Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme. Enzyme này có thể polymer hóa glucose thành cellulose[5]. Polysaccharide của vi sinh vật thường được tích lũy đáng kể trong các môi trường lỏng. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide. Lượng các oligo và polysaccharide nội bào có thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào[5]. Tất cả oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide. Đơn vị monosaccharide được thêm vào tham gia phản ứng ở dạng nucleo tide, monosaccharide được hoạt hóa thường 18 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC là dẫn xuất của các uridin diphosphate (UDP-X) nhưng đôi khi cũng với các nucleotide, purin và các pirimidin khác[5]. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng sau[5]: ….X-X-X-X- + UDP-X = ….X-X-X-X-X + UDP n nhánh (n+1) nhánh Cơ chế quá trình sinh tổng hộp diễn ra theo sự tổng hợp các loại polysaccharide phân nhánh hiện chưa rõ[5]. Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào các enzyme transferase. Acetobacter xylinum sống thích hợp ở nhiệt độ 28-320C. Ở nhiệt độ này quá trình hình thành các sản phẩm trong đó có thạch dừa là tốt nhất[5]. II. Nguyên vật liệu và phương pháp tiến hành II.1 Nguyên vật liệu - Khay đựng thạch dừa - Ống đông - Nồi - Bếp - Nước dừa già 1l - Saccharose 5% - Acid acetic 12ml - KH2PO4 0,007% - (NH4)2SO4 5g - MgSO4.7H2O 1ml - Agar 2% II.2 Quy trình sản xuất thạch dừa 19 THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nước dừa già Xử lý Giống đã hoạt hóa Giống cấp 1 Giống cấp 2 Giống cấp 3 KH2PO4, K2HPO4 Thanh trùng môi trường Đường Phối chế (NH4)2SO4 Làm lạnh Đổ vào khay Lên men tĩnh Xử lý thạch dừa thô Cắt miếng Ngâm xả Nấu siro 20