Tài liệu Thiết kế vector tet – on điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn:1. TS. Nguyễn Văn Hạnh Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. ThS. Vi Đại Lâm Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân. Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, tập thể cán bộ Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể các thầy, cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ năng quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS. Nguyễn Văn Hạnh – Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học, ThS. Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn trực tiếp đề tài, các thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài này. Tôi xin được cảm ơn nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên, cùng các anh, chị và các bạn sinh viên tham gia nghiên cứu tại – Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, thầy cô, bạn bè đã ủng hộ về mặt vật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, tháng 5 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Minh Thành ii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ARN Acid ribonucleic – Một trong hại loại acid nucleic CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid – Một trong 2 loại nucleic acid DOX Doxycycline dsRNA E.coli LB MLPA Double strand RNA – RNA sợi đôi Escherichia coli Lauria Broth Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (khuếch đại phụ thuộc mẫu dò) Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi tổng hợp PCR chuỗi polymer (Phản ứng khuếch đại DNA trong ống nghiệm) µl PCMV IE PTGS TeT-on Microlit ( 1 µl = 10-3 ml) Promoter encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site Posttranscriptional gene silencing ( làm bất hoạt gene sau phiên mã) Vector pTet – DualON TRE Tetracycline -responsive RNAi RNA interference SiRNA Small interfeing RNA RISC IRES2 RNP RNA-induced silencing complex ( phức hợp làm câm lặng do RNA) Internal ribosome entry site 2 Ribonucleoprotein iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1:Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài ..................................... 19 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-1.............................................. 24 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng cắt PJET1.2-2 ............................................. 24 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 26 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 27 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 27 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 28 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 29 Bảng 3.9: Thành phần phản ứng cắt ............................................................... 29 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng cắt.............................................................. 30 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối ............................................................. 31 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc của vector Tet- On ............................................................ 10 Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của vector Tet-On .............................................. 12 Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7].................................................. 13 Hình 3.1: Cấu trúc vector pJET1.2 ................................................................. 20 Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau khi được cắt bởi 2 enzyme HinIII và Acc65I ............................................................................................................. 32 Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau khi được cắt bởi 2 enzyme HindIII và Acc65I ........................................................................................................ 33 Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene 1 .................................................. 34 Hình 4.4: Kết quả so sánh với đoạn gene tra-2 ............................................... 34 Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 và đoạn DNA 2 trước khi nối T4 ....... 35 Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi được cắt bởi 2 enzyme 2) BamHI và HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn 2 sau khi nối (Đường chạy 1 và 36 Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi được cắt bởi 2 enzyme BamHI và HinIII sau khi được tinh sạch (đường chạy 1 và 2) ....................... 37 Hình 4.8: Kết quả vector pTRE – Tight – BI được tạo rỗng bằng 2 enzyme BamHI và HindIII ........................................................................................... 38 Hình 4.9: Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight – BI được cắt bởi 2 enzyme BamHI và HinIII (đường chạy số 2) .................... 39 Hình 4.10: Kết quả cắt vector pTet – DualON bằng 2 enzyme NsiI và XhoI (Đường chạy số 1 và 2) ................................................................................... 40 v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................... 3 1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 3 1.2.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................... 3 1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 4 1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 4 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 4 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 5 2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 5 2.1.1 Muỗi biến đổi gene................................................................................... 5 2.1.2. Công nghệ RNAi ..................................................................................... 6 2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi) ...................................................................................... 8 2.1.4. Vector Tet – On ..................................................................................... 10 2.1.5. Vector pTRE-Tight-BI .......................................................................... 13 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước ..................................... 15 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15 2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................... 16 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 17 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 17 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 17 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 17 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 17 vi 3.2.2. Thời gian tiến hành ............................................................................... 17 3.3. Hóa chất, thiết bị và vật liệu .................................................................... 17 3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 17 3.3.2. Thiết bị .................................................................................................. 19 3.3.3. Dụng cụ ................................................................................................. 19 3.3.4. Vật liệu .................................................................................................. 20 3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20 3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 21 3.5.1. Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính trên muỗi Aedes aegypti ............................................................................................................. 21 3.5.2. Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào vector pTRE – Tight – BI ............................................................................................ 26 3.5.3. Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh............................................................ 29 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 32 4.1. Kết quả tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti .................................................................................................. 32 4.1.1. Kết quả tạo đoạn DNA 2 từ vector pJET1.2-2...................................... 32 4.1.2. Kết quả tạo vector pJET1.2-1 rỗng ....................................................... 33 4.2. Kết quả chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector ........................................................ 35 4.2.1. Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau khi nối đoạn DNA 2 .................................................................................................... 35 4.2.2. Kết quả vector pTRE – Tight – BI được nhân với số lượng lớn, cắt bằng enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính ................................................................................... 37 4.2.3. Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI ................................................. 38 vii 4.3. Kết quả tạo vector Tet – on hoàn chỉnh .............................................................. 40 4.3.1. Kết quả vector pTet – DualON được nhân với số lượng lớn, cắt bằng enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi........................................................ 40 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 42 5.1. Kết luận .................................................................................................... 42 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue). Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lây lan trên 100 nước khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới. Châu Mỹ cao nhất là 42 nước, châu Phi 20 nước, khu vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đông Nam Á 7 nước và Địa Trung Hải 4 nước [1]. Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành. Từ những năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển với số mắc bệnh và chết ngày một tăng. Bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch [4], [5]. Dịch bệnh không có chu kì rõ rệt, giữa các đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch vẫn xảy ra rải rác. Để giải quyết vấn đề trên nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi biến đổi gene sẽ được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tạo ra thế hệ muỗi con bị khuyếm khuyết và chết trước khi trưởng thành. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu đã biến đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không có khả năng tìm kiếm mục tiêu để hút máu. Nhóm nghiên cứu cho rằng muỗi có cơ quan thụ cảm khứu giác gọi là orco, được xem là bộ phận cần thiết để phối hợp với 2 protein đặc biệt liên quan đến việc hình thành cơ chế ngửi mùi. Khi orco bị biến đổi cơ quan thụ cảm mất cân bằng khiến chúng không phân biệt được mùi người với động vật có máu nóng khác, đáng lưu ý là hai loại muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết ở người là Anopheles gambiae và Aedes aegypti rất thích mùi của con người, kết quả biến đổi orco khiến muỗi bị mất cân bằng nghiêm trọng trong việc phân biệt mùi người và mùi khác. Đáng lưu ý là muỗi đã bị biến đổi orco càng không phân biệt được mùi trong môi trường không có khí carbonic (CO2) [16] [22]. Trong nghiên cứu này nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller mới chỉ dừng lại ở vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không tìm kiếm người để hút máu chứ chưa làm giảm hoặc tiêu diệt toàn bộ quần thể muỗi Aedes aegypti. Hiện nay có một số nghiên cứu về vector điều khiển tính trạng giới tính trong đó có vector Tet – On được các nhà khoa học sử dụng để điều khiển tính trạng giới tính của quần thể sinh vật ví dụ như ruồi giấm [10] [15]. Đến nay, vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và vắc xin phòng bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue cũng như bệnh do virus Zika, nên việc phòng chống bệnh chủ yếu dựa vào việc phòng và diệt muỗi truyền bệnh. Vai trò và khả năng truyền bệnh của một số loài muỗi thuộc giống Aedes mà chủ yếu là Aedes aegypti đã được biết từ lâu, song mỗi vùng, mỗi địa phương với những phong tục tập quán và hoạt động của người dân, nhất là điều kiện sống khác nhau ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng truyền bệnh [3]. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhằm giảm sự truyền nhiễm của muỗi và sinh sản của chúng trên thế giới như các phương pháp sử dụng tia X tia gamma để dời một đoạn nhiễm sắc thể hay phương pháp đưa DNA ngoại lai vào côn trùng tạo côn trùng biến đổi gene [9]. Nhưng các biện pháp này chỉ giảm thiểu phần nào quần thể muỗi bằng cách tác động vào hệ gene của chúng. Cụ thể hơn là tác động vào hệ gene giới tính của nó. Một khi chúng ta 3 điều khiển được hệ gene giới tính của muỗi, chúng ta có thể tạo ra được một quần thể mới toàn cá thể muỗi đực hoặc toàn cá thể muỗi cái. Từ đó chúng ta có thể ứng dụng trong việc tạo ra các dòng muỗi triệt sản hoặc mang các gene giới tính có khả năng ức chế, gây chết tế bào trứng của muỗi cái trong quần thể tự nhiên. Xuất phát từ mục tiêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti”. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu của đề tài * Mục tiêu lâu dài của đề tài Tạo được vector TET – ON có khả năng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. * Mục tiêu trƣớc mắt Mục tiêu cần đạt trong khuôn khổ thời gian thực hiện khóa luận là nắm được mục đích, ý nghĩa của việc nghiên cứu điều khiển tính trạng ở côn trùng và thực hiện các thí nghiệm để nắm được các phương pháp để tạo vector định hướng điều khiển giới tính. - Tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti thông qua vector pJET1.2-1 và pJET1.2-2. - Bước đầu gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTRE-Tight-BI để chuẩn bị gắn vào vector đích Tet-On. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài Có thông tin về khả năng tạo được vector TET – ON có khả năng hoạt động định hướng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. 4 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Điều khiển chủ động tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti, tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sự biểu hiện tính trạng trên muỗi Aedes aegypti. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới giúp tiêu diệt hoặc làm giảm số lượng quần thể muỗi Aedes aegypti trong tự nhiên 5 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cơ sở khoa học 2.1.1 Muỗi biến đổi gene Thành công ban đầu từ những cuộc thử nghiệm trên muỗi biến đổi gene đã đặt ra kì vọng biến chúng thành phương pháp tiêu diệt hoặc làm giảm tác hại của loài muỗi gây bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất châu Á và châu Mỹ La Tinh hiện nay. Sự lạc quan dường như cũng thể hiện rõ ở nhiều nhà khoa học, nhưng sự thành công chưa trọn vẹn của phương án này cũng đặt ra không ít lo ngại. Muỗi chuyển gene được bổ sung hai đặc điểm mới so với loại muỗi thường là chúng chứa gene phát huỳnh quang và gene gây chết có điều kiện (còn gọi là gene làm giảm sức đề kháng). Đặc điểm phát huỳnh quang hoạt động như một dấu hiệu để nhận diện muỗi biến đổi gene trong khi gene gây chết sẽ làm muỗi và các ấu trùng chết trong những điều kiện nhất định. Khi muỗi biến đổi gene đực giao phối với muỗi cái trong tự nhiên, gene gây chết sẽ được truyền lại cho thế hệ con cháu và các ấu trùng, kết quả là chúng sẽ chết trong điều kiện thiếu vắng kháng sinh tetracycline [9]. Sở dĩ “công nghệ” muỗi chuyển gene nhận được nhiều sự đồng tình là do việc sử dụng loại muỗi này - theo đánh giá của những người ủng hộ quan điểm muỗi chuyển gene - là an toàn và thân thiện hơn nhiều so với việc dùng hóa chất. Các nhà khoa học thậm chí còn dự tính sẽ tạo ra hàng loạt các thế hệ côn trùng, ong, sâu, ruồi mang “thương hiệu” biến đổi gene, nhằm chống lại những căn bệnh có tính chất đại dịch vốn lây lan qua côn trùng, đồng thời tạo điều kiện cho việc tăng năng suất cây trồng và các sản phẩm nông nghiệp, giúp ổn định an ninh lương thực. Muỗi chuyển gene được kì vọng là phương án sẽ tạo nên bước đột phá trong ngành y học và nông nghiệp [20]. Thời gian 6 gần đây có nhiều báo cáo cho rằng có thể tạo ra muỗi chuyển gene nhờ công nghệ tiên tiến mới, là công nghệ RNAi. 2.1.2. Công nghệ RNAi 2.1.2.1. Đặc điểm công nghệ RNAi Công nghệ RNAi có tính đặc thù cao, đầy sức mạnh và hiệu quả, chỉ cần một lượng nhỏ phân tử ARN sợi kép (dsRNA) trong một tế bào là đủ để gây bất hoạt gene. Rất nhạy cảm (phản ứng nhanh và mạnh đối với các RNA xâm nhiễm như virus), có thể làm bất hoạt gene ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cá thể ở mức độ nhất định có thể truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, từ mô này sang mô khác như kiểu “di căn” [2] [6]. 2.1.2.2. Vai trò của công nghệ RNAi RNAi có khả năng hoạt động như một chất xúc tác (catalyst) và các enzyme có bản chất RNA được gọi là ribozyme. Quan điểm trước đó cho rằng RNAi chỉ đóng vai trò trung gian giữa DNA và protein. Các nghiên cứu sau đó cho thấy RNA có thể tự xúc tác để tự sao chép và tổng hợp các phân tử RNA khác. Hiện nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng ribosomal RNA xúc tác tạo liên kết peptide giữa các amino acid trong quá trình dịch mã, phát hiện sau đó còn cho thấy RNA không chỉ như chất xúc tác, mà còn đóng vai trò quan trọng hơn nữa trong biểu hiện gene. Một số lượng lớn các phân tử RNA nhỏ không đóng vai trò như mã di truyền mà liên kết với protein để tạo ra phức hợp ribonucleoprotein (RNP). Các ribonucleoprotein (RNP) ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình phiên mã (transcription), dịch mã (translation), nhân bản DNA và cấu trúc nhiễm sắc thể (ví dụ gây xoắn sợi nhiễm sắc thể). Trong những năm đầu của thập kỷ 1980, người ta đã phát hiện thấy các phân tử nhỏ (dài khoảng 100 nucleotide) trong vi khuẩn Escherichia coli có thể bám vào trình tự tương đồng trong 7 mRNA và ức chế phiên mã. Một loạt các nghiên cứu về RNAi được công bố và đã chỉ ra rằng ARNi có thể là chiến lược để chống lại virus [2]. Sự bất hoạt gene có thể xảy ra ở mức độ phiên mã và sau phiên mã. Kết quả nghiên cứu vào những năm 1990 cho thấy một gene biến nạp (gene chuyển) vào hệ gene có thể kìm hãm biểu hiện gene tương tự của nó trong cây [2]. Ứng dụng RNAi có giá trị cả trong nuôi cấy tế bào và trong các sinh vật sống, vì tổng hợp RNA mạch kép đưa vào tế bào chọn lọc, có thể gây ức chế gene cụ thể cần quan tâm. RNAi có thể được sử dụng cho các mô hình có quy mô lớn có thể giúp xác định các thành phần cần thiết cho một quá trình tế bào cụ thể hoặc một sự kiện như phân chia tế bào. RNAi cũng được sử dụng như một công cụ thiết thực trong công nghệ sinh học, y học và thuốc trừ sâu [2]. 2.1.2.3. Cơ chế hoạt động của RNAi Ngay sau khi khám phá ra RNAi thì người ta đã biết được rằng quá trình làm bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) ở thực vật có liên quan tới một quần thể các RNAs có kích thước nhỏ (dài khoảng 25 nucleotide) và người ta cũng biết rằng những RNA này chứa cả trình tự RNA sense và trình tự antisense (trình tự có nghĩa và trình tự đối nghĩa). Người ta đã giả định rằng loại RNA này là yếu tố quyết định của quá trình PTGS. Sau khi khám phá ra các RNAi ở tế bào động vật người ta đã biết rằng RNA ở dạng sợi đôi cũng có khả năng bắt đầu quá trình PTGS ở thực vật [6]. Sinh hóa của quá trình RNAi được làm sáng tỏ trong một hệ thống in vitro thí nghiệm trên các phôi của ruồi Drosophila, cũng có thể nói rằng dsRNA (RNA dạng sợi đôi) được xử lý thành những đoạn dsRNA dài từ 2123 nucleotide những đoạn này có sự tương đồng khá cao với các dữ liệu về quá trình PTGS ở thực vật người ta đã giả đỉnh rằng những dsRNA này và siRNA (small interfering RNA) có vai trò định hướng trong sự phân cắt phân tử mRNA. Ở điều kiện in vivo, Fire and Mello đã cho rằng các dsRNA dài bị 8 cắt thành các RNA nhỏ dài khoảng 25 nucleotide, các RNA antisense gây ra quá trình phân hủy của mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA. Như vậy, các dsRNA đã được kết hợp với những yếu tố ảnh hưởng có khối lượng phân tử thấp [6]. Cơ chế phân tử có liên quan trong quá trình RNAi đã được chỉ ra. Trong một hệ thống in vitro được xây dựng trên các tế bào Drosophila được nuôi cấy, đã chỉ ra rằng có một phức hợp lớn gọi là RISC (RNA-induced silencing complex) nhắm tới phân tử mRNA thông qua một đoạn RNA antisense ngắn, phân tử mRNA bị nhắm tới, bị phân cắt rồi bị phân hủy. Phức hợp RISC chứa ít nhất một thành viên trong họ “protein argonaute”, họ protein này hoạt động như một endonuclease và các phân tử mRNA bị cắt từ các trình tự ở bên trong chuỗi (có thể gọi là chức năng làm “câm”). Người ta cũng đã chỉ ra rằng một nuclease giống như là một ribo nuclease III gọi là Dicer có liên quan tới quá trình xử lý các RNA thành các RNA ngắn. Trong các hệ thống nhất định hoặc là các thực vật cụ thể các loại giun hoặc các loại nấm phát hiện một RNA (lệ thuộc vào RNA polymerase (RdRP)) đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo thành hoặc khuếch đại siRNA [6]. Vì thế chỉ trong một vài năm một tập hợp lớn các thông tin về các protein hoặc các phức protein chuyên biệt có liên quan tới quá trình RNAi và các thông tin ở mức phân tử tại các bước của quá trình này được xây dựng. Nó là bằng chứng cho một sự khởi đẩu của những phát hiện đáng kể về quá trình RNAi [6]. 2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi) Gene Transformer-2 (Tra-2) là gene tác động đến giới tính của loài côn trùng nói chung và loài muỗi nói riêng. Tra-2 tác động vào tế bào soma và sự sinh tinh trong tế bào của con mầm đực. Tra-2 là một trong số ít gene 9 quy định giới tính ở ruồi giấm Drosophila melanogaster, chức năng của Tra-2 là cần thiết trong tế bào soma của con cái nơi mà chúng hoạt động cùng với gene transformer (tra) cần thiết cho việc biểu hiện gene doublesex (dsx) hoạt động cùng với gene transformer ở trong cái con đường biệt hóa tạo ra con cái. Việc thiếu hụt chức năng của Tra-2 hoặc transformer dẫn đến một số thay đổi trong việc biểu hiện chuyên hóa giới tính đực của gene dsx. Nó dẫn đến sự biến đổi giới tính của con cái thành những con đực không có khả năng sinh sản vì thế gọi là “con đực giả”. Những đột biến “null” ở tra hoặc tra-2 không ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa giới tính ở các tế bào soma của con đực (XY). Quá trình biểu hiện chuyên hóa giới tính đực của gene dsx là điển hình ở những con đực ở dạng hoang dại “wild type” không biểu hiện protein tra [15]. Việc điều hòa của gene dsx xảy ra ở mức độ “chế biến” RNA. Sản phẩm phiên mã của gene dsx ở con đực và con cái là giống nhau trong 3 exon đầu tiên nhưng khác nhau ở hầu hết các exon ở đầu 3’. Nhưng sản phẩm phiên mã khác nhau của gene dsx chuyên hóa cho việc xác định giới tính mã hóa cho các protein mà có đầu N giống nhau, nhưng có đầu C khác nhau. Ở những con cái thì các protein mã hóa bởi gene Tra hoặc Tra-2 có liên quan trực tiếp tới quá trình cắt nối phân tử tiền mRNA của dsx và tạo ra một phân tử mRNA dsx trưởng thành chuyên hóa cho giới tính cái [15]. Gene Tra-2 ở muỗi không giống như gene Tra-2 ở Drosophila, Ceratitis Capitata and Anastrepha, mà gene Tra-2 ở muỗi có liên quan đến quá trình biệt hóa giới tính, quá trình hình thành tinh trùng và việc bất hoạt gene Tra-2 không gây ra được biến đổi con cái thành con đực giống như đã được biết ở những loài côn trùng thuộc loài Dipteran khác. Bởi vì một ảnh hưởng nhất thời từ dsRNA không thể kéo dài từ giai đoạn trứng đến giai đoạn trưởng thành để gây ra một cái ảnh hưởng bất hoạt tới các giai đoạn của quá trình hình thành tinh trùng và những hậu quả ở thế hệ sau đó, vì vậy tất cả 10 những cố gắng để chuyển các dsRNA nhằm thu được những ảnh hưởng cục bộ bền vững hơn sẽ là không thể. Để ức chế thành công gene Tra-2 ở muỗi thì cần phải tạo ra các dòng chuyển gene lâu dài với nhiều cấu trúc Tra-2 RNAi bằng cách đó những cái tác động can thiệp sẽ được biểu hiện bền vững trong suốt quá trình hình thành tinh trùng. Việc bất hoạt gene Tra-2 ở muỗi Culiciane có thể gây chết các tinh trùng có liên quan tới nhiễm sắc thể X từ con đực và chỉ những tinh trùng có nhận được nhiễm sắc Y của con đực mới sống sót, và tạo thành thế hệ con non toàn bộ là con đực. Những con đực này về mặt di truyền có mang nhiễm sắc thể Y, những con đực được tạo thành từ phương pháp này là không phải là vô sinh nhưng chúng chỉ tạo ra nhũng tinh trùng mà mang nhiễm sắc thể Y. Về mặt lý thuyết, những con đực non sẽ trưởng thành liên tục phát tán cấu trúc Tra-2 RNAi vào quần thể tự nhiên cho đến khi những quần thể này bị tuyệt diệt [9]. 2.1.4. Vector Tet – On Cấu trúc của vector Tet - On Cấu trúc của vector Tet-On được thể hiện dưới hình 2.1. Hình 2.1: Cấu trúc của vector Tet- On 11 Vị trí và từng tính năng: - PCMV IE (Promoter của cytomegalovirus): 7 – 606 - Tet – On Advanced: 634 – 1380 - IRES2 (vị trí tương tác với ribosome thu nhận từ encephalomyocarditis): 1389–1973 - ZsGreen1 (protein Zoanthus sp protein huỳnh quang màu xanh): 1979-2674 - SV40 dấu hiệu PolyA: 2712-2901 - ColE1 ori (khởi đầu sao chép): 3077-3501 - Ampr (Gene kháng ampicillin; b-lactamase): 3842-4837 (bổ sung) pTet – DualON đồng biểu hiện chất kích hoạt phiên mã được kiểm soát bởi tetracycline và protein fluorescent xanh có tên ZsGreen1. Tet – On Advanced là một tổ hợp của Tet repressor (chất ức chế Tet) và 3 domains lấy từ protein VP16 của virus herpes có vai trò kích hoạt phiên mã kiểu type “F”. Gene mã hõa cho Tet – On advanced được tổng hợp hoàn toàn chứa vị trí cắt nối mARN và sử dụng các bộ ba của người để hỗ trợ cho việc ổn định trên các tế bào động vật có vú. ZsGreen1 là một biến thể đã được tối ưu hóa bởi các codon của người có nguồn gốc từ protein fluorescent xanh ZsGreen lấy từ san hô Zoanthus sp đã được xử lý để cho tín hiệu huỳnh quang phát ra mạnh hơn (mức kích thích và mức phát xạ tối đa: 493 và 505nm). Vector đồng biểu hiện ZsGreen1 và Tet-On Advanced từ một sản phẩm phiên mã mRNA dạng bicistronic (có thể mã hóa cho 2 protein được biểu hiện độc lập). Quá trình biểu hiện có thể đạt được nhờ sử dụng promoter (PCMV IE) lấy từ cytomegalovirus. Một vị trí có tên là IRES2 có vai tò tương tác với ribosome có nguồn gốc từ virus encephalomyocarditis (EMCV), có vị trí giữa Tet- On Advanced và ZsGreen1 hỗ trợ cho việc dịch mã độc lập ZsGreen1 từ một vị trí khởi đầu nằm bên trong đoạn nối của IRES2 và