Tài liệu Tách chiết enzyme prôtêaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật I- GIỚI THIỆU Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Ngoài số enzyme đa được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôtêaza…), còn có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế. Trước đây, các enzyme dùng nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường thu nhận từ động vật, thực vật. Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi sinh vật. Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước phương đông( Trung Quốc, Nhật Bản…). Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm enzyme . Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên sự phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau. Một số loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hay một số protesae nhất định có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng. Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào( protease nội bào ) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy( protease ngoại bào ). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào. Trang: 1 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kĩ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học. Trong bài này chúng tôi xin giới thiệu một phương pháp tách chiết enzyme prôtêaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. II- CHUẨN BỊ GIỐNG – TẠO SINH KHỐI 2.1. Phân lập giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae. Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì khác nhau hoàn toàn. Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất. Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện . 2.1.1. Vai trò của giống trong công nghệ enzyme. Trang: 2 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định: - Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy. - Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt tính enzyme). - Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất. - Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm. Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV. 2.1.2. Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme. Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là: - Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng. - Giống phải cho năng suất sinh học cao. - Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. - Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động. Trang: 3 Công nghệ protein – enzyme - Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. - Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống. - Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.  Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết. 2.1.3. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Aspergillus oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những Trang: 4 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. 2.1.4. Quá trình phân lập giống VSV. VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao. VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất. Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3 cách phân lập: + Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất + Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Trang: 5 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau đây là 1 số ưu điểm: a. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên. Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh. Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn. Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết. Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần. Trang: 6 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein trong tự nhiên. Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp. b. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất. Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm. Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại. Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao. c. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng. Trang: 7 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá. Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt. 2.2. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme protease này là protein. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm phân lập: Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây. Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu. Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo. Trang: 8 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar). Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày. Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột. Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ). Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm. Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù. Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm. KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1 NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 KCl 0,5 hồ tinh bột 20 PH = 6,5 Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem Trang: 9 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp. III: CÔNG NGHỆ LÊN MEN TẠO ENZYME PROTEASE 3.1. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống. 3.1.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là: - Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. - Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. - Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. Trang: 10 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật - Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích. a. Môi trường lỏng. Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O 2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV. Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trang: 11 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý. b.Môi trường đặc. Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV. VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae. 3.2. Sản xuất nấm mốc giống – nuôi cấy tạo sinh khối. 3.2.1. Môi trường cho sản xuất mốc giống: Trang: 12 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật dùng môi trường tổng hợp Môi trường Benhamin. Bột ngô 20g Glucose 10g Pepton 10g Cao Nấm men 4g Nước 1000ml 3.2.2. Chuẩn bị mốc giống. Nuôi cấy giồng bao gồm: Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm. Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ). Trên sàng, khay (nhân giống lớn). 3.2.3. Nuôi cấy tạo sinh khối . Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác. Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng. Tiếp tục nhân giống và nuôi cấy cho đến khi đạt được sinh khối theo mong muốn. 3.3. Thu nhận enzym protease từ nấm mốc Aspergillus Oryzae. 3.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp protease từ nấm. Trang: 13 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Khi nuôi VSV tạo protease có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp protease tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme protease kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời Nuôi với cấy sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau. Tuy Thu nhận phế phẩm nhiênenzyme theo ýthôkiến Chế phẩm ezyme thô đem sử dụng của nhiều tác giả, sự tạo thành protease cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh Chế phẩm enzyme thô trưởng của hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme protease trong canh đemVSV tinh chế trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. Nghiền mịn 3.3.2.Qui trình Trích lythu nhận enzyme protease. Lọc Kết tủa enzyme Dùng trong chăn nuôi Bã Cồn hoặc Sulfat amon Thu nhận kết tủa Sấy kế tủa Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết tinh khiết Trang: Enzyme 14 Sử dụng chế phẩm ezyme tinh sạch Công nghệ protein – enzyme Trang: 15 Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Thuyết minh qui trình: Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: -Nhiệt độ tăng rất chậm. -Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. -Khối môi trường còn rời rạc. -Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trang: 16 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. - Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. - Môi trường được kết lại khá chặt. - Độ ẩm môi trường giảm dần. - Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. - Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. - Enzym protease được tổng hợp mạnh. -Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30 0C là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzym Trang: 17 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. Thu nhận sản phẩm: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo cho chế phẩm enzym protease không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục). Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-40 0C. Enzym protease ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau: Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng Trang: 18 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV. Trích ly: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này. Quá trình kết tủa enzym protease: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7 OC) theo thời gian, các Trang: 19 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W). Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn protease ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần phụ lục). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta quan tâm. II.Kết luận Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ. Ví dụ, chế phẩm enzyme mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ enzyme protease. Trang: 20