Tài liệu Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN ----------------------- DƢƠNG THU HƢƠNG SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN KỊ KHÍ Ở CÁC BỆNH NHÂN BỊ CHẢY MÁU DẠ DÀY Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN ---------------------- DƢƠNG THU HƢƠNG SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN KỊ KHÍ Ở CÁC BỆNH NHÂN BỊ CHẢY MÁU DẠ DÀY Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chƣơng trình cao học và viết luận văn này, ngoài nỗ lực học tập, nghiên cứu, tìm tòi của bản thân, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, góp ý nhiệt tình của các Quý thầy cô, những ngƣời làm công tác khoa học, cũng nhƣ của bạn bè, đồng nghiệp, ngƣời thân. Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh – ngƣời thầy đã tận tâm, dành rất nhiều thời gian và tâm huyết nhiệt tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ này. Qua đây, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Guillermo I. Perez-Perez, trƣờng Đại học Tổng hợp New York vì những nhiệt tình hỗ trợ của ông trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại Mỹ. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Phòng Sau đại học, cùng các thầy cô trong Khoa Sinh học đã tận tình truyền dạy cho tôi suốt thời gian học tập tại trƣờng. Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học. Xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Luận văn này đánh dấu một bƣớc trƣởng thành mới của riêng bản thân tôi. Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2014 Học viên Dương Thu Hương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng toàn bộ những nội dung và số liệu trong luận văn này do tôi tự nghiên cứu, khảo sát và thực hiện, bên cạnh sự giúp đỡ, hỗ trợ của các thành viên trong nhóm nghiên cứu thuộc đề tài Nghị định thƣ hợp tác với Mỹ, và đã nhận đƣợc sự đồng ý cho phép sử dụng những số liệu chung của nhóm nghiên cứu. Học viên thực hiện Luận văn Dương Thu Hương MỤC LỤC MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------------------ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------------------- 3 1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI ----------------------------------- 4 1.1.1. Các Microbiota bản địa ---------------------------------------------------------- 5 1.1.2. Các Microbiota bệnh ------------------------------------------------------------- 6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA -------------------------- 7 1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển ----------------------------------------------------------------- 7 1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử -------------------------------------------------- 7 1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển và phƣơng pháp hiện đại --------- 9 1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI --------------------------------------------------- 9 1.3.1. Microbiota bản địa dạ dày ngƣời khỏe mạnh -------------------------------- 10 1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh -------------------------------------------- 11 1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY ---------------------------------------------- 12 1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày ------------------------------------- 12 1.4.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày ---------------- 13 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------------------------------ 15 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU -------------------------------------------------------- 16 2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ---------------------------------------------------- 16 2.2.2. Hóa chất, thiết bị máy móc ----------------------------------------------------- 16 2.2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu ------------------------------------------------ 17 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU---------------------------------------------------- 18 2.3.1. Khám lâm sàng ------------------------------------------------------------------- 19 2.3.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm ------------------------------------------------------- 19 2.3.3. Đo pH dịch vị dạ dày ------------------------------------------------------------ 19 2.3.4. Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn ----------------------------------------- 20 2.3.5. Nhuộm Gram và quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng ------------------------ 21 2.3.6. Test Helicotest -------------------------------------------------------------------- 21 2.3.7. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết --------------------------------- 21 2.3.8. Xác định HPstatus của các bệnh nhân ---------------------------------------- 21 2.3.9. PCR nhân gen 23S rARN của H. pylori --------------------------------------- 22 2.3.10. PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn -------------------------------------- 23 2.3.11. Giải trình tự --------------------------------------------------------------------- 23 2.3.12. Định tên vi khuẩn--------------------------------------------------------------- 24 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ------------------------------------------------------------------ 25 3.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN ---------------------------------------------------- 26 3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày --------------------------------------------- 26 3.1.2. Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân ---------------------------------- 27 3.2. XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN ----------------------------- 28 3.3. PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ -------------------------- 31 3.4. NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN --------------------------------------------------- 35 3.4.1. Xác định Gram của các chủng phân lập -------------------------------------- 35 3.4.2. Định tên vi khuẩn ---------------------------------------------------------------- 35 KẾT LUẬN -------------------------------------------------------------------------------------- 44 KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------------------------- 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO -------------------------------------------------------------------- 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính ……………….. 26 Bảng 2. Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H. pylori của 27 bệnh nhân ………………………………………………….................................................. 30 Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn …………………………………………… 31 Bảng 4. Tên các loài vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm …………………………….....39 Bảng 5. Một số đặc điểm của các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí từ Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu ……………………………... 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ và ngƣời già ……………….. 5 Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN ……………………………………………… 8 Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời ……………………………………… 10 Hình 4. Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết …………………………........ 13 Hình 5. Đĩa môi trƣờng thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn ……………………... 17 Hình 6. Hộp giấy đo pH 0~14 (EMD-Mỹ) ………………………………………….. 19 Hình 7. Hệ thống bình nuôi cấy kị khí …………………………………………….... 20 Hình 8. Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ……….. 27 Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân …………………………….. 28 Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân……………………………………………………………………………………31 Hình 11. Hình ảnh các khuẩn lạc đƣợc nhận định ban đầu giống với H. pylori ….......32 Hình 12. H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học ………………33 Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest ……………………………...33 Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori ……………..33 Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí …………………………...34 Hình 16. Một số chủng vi khuẩn đƣợc phân lập và làm sạch ở điều kiện kị khí ….….34 Hình 17. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi Olympia ……………...35 Hình 18. Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN ………………………………36 MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu Toàn cầu đi kèm với suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trƣờng làm thay đổi toàn diện, sâu sắc các hệ sinh thái tự nhiên, dẫn đến sự thay đổi nhiều bệnh đã biết cũng nhƣ sự xuất hiện của nhiều bệnh mới. Đây là những thách thức lớn nhất của nhân loại trong thế kỷ 21. Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là một Hội chứng hay gặp ở ngƣời trƣởng thành - lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực từ công việc lao động, xã hội và gia đình cũng nhƣ dễ nhiễm những thói quen sinh hoạt có hại cho sức khỏe nhƣ hút thuốc lá, nhậu nhẹt và rƣợu chè. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, cả những ngƣời 20 tuổi cũng bị chảy máu dạ dày. Nguyên nhân sự dịch chuyển về tuổi tác của Hội chứng chƣa đƣợc xác định. Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là đợt tiến triển cấp tính của viêm dạ dày mạn tính, có thể biểu hiện bất ngờ và gây ảnh hƣởng nặng nề đến khả năng lao động cũng nhƣ chất lƣợng cuộc sống của ngƣời bệnh. Hội chứng có tỷ lệ tái phát cao sau khi điều trị. Nguyên nhân chính gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu vẫn đang còn là vấn đề tranh cãi [6], [30]. Mối liên quan giữa các bệnh lý viêm loét dạ dày và biến chứng chảy máu dạ dày với vi khuẩn Helicobacter pylori đã đƣợc thừa nhận. Các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu đƣợc điều trị khỏi nhờ liệu pháp kháng sinh. Tuy nhiên thực tế y học lâm sàng đã xác nhận, có nhiều trƣờng hợp bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu không nhiễm H. pylori, nhƣng khi phác đồ điều trị có kháng sinh thì mang lại kết quả tốt. Vấn đề đặt ra là, ngoài H. pylori trong dạ dày ngƣời còn có thể có các loài vi khuẩn nào khác liên quan mà khoa học chƣa biết? Hiện tại, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về viêm dạ dày cấp tính chảy máu và vì thế có ít thông tin về thành phần 1 Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh. Sự hạn chế này có thể ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả điều trị – theo dõi diễn biến bệnh cho bệnh nhân. Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và phục vụ công tác chẩn trị các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam", với mục tiêu là góp phần tìm hiểu thêm về các vi khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí. 2. Xác định tỷ lệ nhiễm H. pylori của các bệnh nhân. 3. Định tên các vi khuẩn bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN. 4. Tham khảo các đặc tính của các vi khuẩn đƣợc phân lập qua các dữ liệu trên Internet. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI Microbiota đƣợc định nghĩa là quần thể vi sinh vật sống trong cùng một ổ sinh thái hoặc ở một giai đoạn địa lý riêng biệt. Trong cơ thể ngƣời, các Microbiota gồm khoảng 1000 loài khác nhau. Số lƣợng vi khuẩn trong các ổ sinh thái cộng lại khoảng 1014 tế bào vi khuẩn, có khối lƣợng khoảng 2 kg, nhiều gấp 10 lần số tế bào cơ thể ngƣời. Microbiota đƣợc hình thành trong quá trình phát triển của con ngƣời, đạt cao điểm ở tuổi trƣởng thành và thoái hóa ở tuổi già. Nhƣ đã biết, sự ra đời của trẻ sơ sinh gắn liền với sự hình thành nhanh chóng của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa với số lƣợng lên tới 1011 vi khuẩn trên một gram phân: chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loài vi khuẩn nhƣ Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium và Staphylococcus đã xuất hiện trong phân của trẻ. Hình 1 giới thiệu sự khác biệt của các Microbiota ở ngƣời trẻ và ngƣời già trên 100 tuổi [24]. Thành phần các vi sinh vật trong các Microbiota có thể thay đổi dẫn đến bệnh tật [24]. Chẳng hạn, các bệnh nhân bị tiểu đƣờng tuýp 2 có Microbiota đƣờng ruột bị thoái hóa. Các vi khuẩn sản xuất butyrate, đóng vai trò quan trọng trong cung cấp năng lƣợng cho các tế bào biểu mô và điều khiển các đáp ứng của tế bào chủ giảm đáng kể, trong khi đó các vi khuẩn gây bệnh mang chức năng khử sulphate và kháng với stress oxy hóa lại tăng [54]. Còn rất nhiều điều chƣa biết về thành phần các Microbiota của ngƣời, do khoảng 99% các loài vi khuẩn không thể nuôi cấy đƣợc trong các phòng thí nghiệm [12]. Hiện nay, các nhà khoa học đang áp dụng Metagenomic kết hợp với Genomic, Tin sinh học để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Metagenomics cho phép xác định các loài vi sinh vật có trong quần thể vi sinh vật Microbiota phức tạp không cần nuôi cấy chúng. Phân tích Metagenomic cho thấy, mặc dù các Microbiota có thể khác nhau về thành phần do các chế độ ăn uống, nhƣng mỗi ngƣời đều mang một số vi khuẩn đặc trƣng và không thay đổi theo thời gian, bao gồm 400 loại ở ngƣời khỏe mạnh [36]. 4 Ngƣời trẻ 24-40 tuổi Ngƣời Ngƣời trăm trăm tuổi tuổi 99-104 99-104 tuổi tuổi Một số số vi vi Một khuẩn tạo tạo khuẩn butyrate và và butyrate loại gây gây loại bệnh bệnh Nhiều vi khuẩn tạo butyrate Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ và ngƣời già [24] Các Microbiota đƣợc chia thành hai loại dựa theo tiêu chí, liệu chúng có gây hại hay không đối với con ngƣời: - Các Microbiota bản địa, bao gồm các vi sinh vật cộng sinh cƣ trú thƣờng xuyên ở mắt và da, đƣờng hô hấp trên, đƣờng tiêu hóa trên và dƣới, đƣờng tiết niệu và sinh sản của phụ nữ và nam giới, dịch cơ thể và máu. - Các Microbiota bệnh, bao gồm các vi sinh vật cơ hội gây hại cho ngƣời. Các loài vi khuẩn sống trong các Microbiota có thể là loài cƣ trú thƣờng xuyên, loài vãng lai và loài đi ngang qua ổ sinh thái. Trong một số điều kiện đặc biệt, các vi sinh vật cơ hội có thể xuất hiện. 1.1.1. Các Microbiota bản địa Microbiota của ngƣời khỏe mạnh hay còn đƣợc gọi là bản địa bao gồm các vi 5 sinh vật không gây bệnh, chủ yếu là vi khuẩn và một vài loại nấm, prostist sống ở khoang miệng, thực quản, đƣờng tiêu hóa, mũi, họng, da và vùng gần quanh mắt. Các loài vi sinh vật này giúp đỡ bảo vệ cơ thể ngƣời chống lại các loài vi sinh vật gây bệnh do: i. ganh đua gắn với các tế bào biểu bì hoặc tế bào niêm mạc của ngƣời. ii. tranh giành vị trí sinh thái. iii. tranh giành thức ăn để sống. iv, tiết ra các chất giết các loài gây bệnh. Các vi sinh vật trong quần thể Microbiota bản địa gồm (i) các loài vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên không gây hại và có mối quan hệ tƣơng hỗ với ngƣời; (ii) các vi sinh vật vãng lai bao gồm các vi sinh vật chỉ tồn tại một thời gian ngắn từ một vài ngày đến vài tuần trong cơ thể ngƣời do không thể cạnh tranh với các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, bị hệ miễn dịch của chủ tấn công và các điều kiện ở mới thích hợp cho sự phát triển của chúng; (iii) các vi sinh vật đi ngang qua một Microbiota đến một Microbiota khác. 1.1.2. Các Microbiota bệnh Trong điều kiện bình thƣờng, các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vãng lai cũng nhƣ các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota bản địa không gây tác hại cho con ngƣời. Tuy nhiên khi Microbiota bản địa thay đổi do nhiều lý do nhƣ bị tổn thƣơng trong các trƣờng hợp viêm nhiễm và các bệnh tự miễn (bệnh Crohn, bệnh loét ruột kết, bệnh viêm khớp, bệnh tiểu đƣờng loại 1, bệnh đa khớp, bệnh béo phì...), một vài trong số các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vãng lai và ngay đến các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota có thể trở thành vi sinh vật cơ hội gây bệnh. Theo y học hiện đại, các nguyên nhân dẫn đến sự hình thành Microbiota bệnh mang các vi sinh vật cơ hội gây bệnh gồm ba khả năng: 1. Hệ miễn dịch của con ngƣời làm việc sai lệch, các quần thể bản địa có thể phát triển vƣợt và chuyển đến các vùng khác của cơ thể. Ví dụ Escherichia coli thƣờng sống 6 trong ruột non, một khi đi vào bàng quang sẽ gây các bệnh đƣờng tiết niệu. 2. Sự mất cân bằng của các vi sinh vật bản địa xảy ra khi các bệnh nhân dùng kháng sinh phổ rộng. 3. Các vi sinh vật bản địa di dời vào vùng trƣớc kia chúng không ở nhƣ trƣờng trong các vết thƣơng phẫu thuật. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA 1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển Để nghiên cứu một hệ vi sinh vật, phƣơng pháp tiếp cận đầu tiên thƣờng đƣợc sử dụng là nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật, sau đó dựa trên các đặc điểm kiểu hình cũng nhƣ đặc điểm hình thái, các đặc tính sinh lý, sinh hóa… mà định tên và sắp xếp chúng vào các nhóm [38]. Trong y học, nuôi cấy thành công đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự có mặt của một loài vi khuẩn nào đó trong bệnh phẩm. Mặt khác, qua nuôi cấy có thể thu đƣợc các chủng vi khuẩn dùng cho các nghiên cứu hệ gen vi khuẩn, xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn... 1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử Vào những năm 1960, các nhà khoa học chú ý đến gen 16S rARN vì chúng bảo tồn cao ở các loài vi khuẩn và cổ khuẩn [20]. Các nghiên cứu cho thấy, đột biến của gen 16S rARN xảy ra với tần số thấp [57]. Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện trên gen 16S rARN có một vùng riêng đặc thù cho vi khuẩn và một vùng chung đặc trƣng cho tất cả các sinh vật sống. Gen 16SrARN còn chứa 9 vùng siêu biến, ký hiệu V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 và V9 cung cấp các tín hiệu để định danh vi khuẩn. Vùng siêu biến VI có nghĩa trong phân loại. Dựa trên tính chất này, ngƣời ta thiết kế một vài cặp mồi để khuếch đại gen 16S rARN từ bất cứ loài vi khuẩn nào [19]. Sản phẩm PCR là một đoạn ADN có phân tử lƣợng khoảng 1,5 kb. Phân tích, so sánh trình tự của gen 16S rARN của một chủng vi 7 khuẩn các gen đã biết trên Genbank cung cấp là cơ sở để xác định tên của chủng cũng nhƣ xác định quan hệ phát sinh chủng loại của các taxon bậc trên loài [39]. Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN Giám định gen 16S rARN nhằm định tên vi khuẩn là một phƣơng pháp tốt và hữu ích, nhƣng vẫn có những nhƣợc điểm nhất định. Đôi khi, các loài vi khuẩn khác nhau có cùng một trình tự gen 16S rARN. Do vậy, khi quyết định tên vi khuẩn cần cân nhắc cẩn thận các kết quả nhận đƣợc sau khi giải trình tự gen. Trong các trƣờng hợp chƣa rõ ràng, để định tên chủng vi sinh vật có trình tự gen 16S rARN tƣơng tự 100% với gen tƣơng ứng của các loài khác, các nghiên cứu thêm bao gồm các đặc điểm hình 8 thái, các đặc điểm sinh lý sinh hóa, giải trình tự toàn bộ một phần hoặc toàn bộ genome của vi khuẩn cần đƣợc tiến hành bổ sung nếu thấy cần thiết. Theo các nhà khoa học: hơn 99% các loài vi khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên chƣa đƣợc định tên do không thể nuôi cấy đƣợc bằng các phƣơng pháp cổ điển trong phòng thí nghiệm [12]. Hiện nay, kỹ thuật Metagenomic kết hợp Genomic, Tin sinh học đang đƣợc sử dụng để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Đây là kỹ thuật mới và mạnh nhất cho phép giải mã thông tin di truyền các quần thể vi sinh vật phức tạp không cần thông qua nuôi cấy và phân lập từng sinh vật đơn lẻ. 1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển và phƣơng pháp hiện đại Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp sinh học phân tử có nhiều ƣu điểm nhƣng vẫn có những nhƣợc điểm nhất định do khó phân biệt các ADN có nguồn gốc từ các vi sinh vật sống hay chết. Các nhà khoa học đánh giá cao việc phối hợp sử dụng cả hai phƣơng pháp truyền thống (nuôi cấy) lẫn hiện đại (Metagenomic) để định tên các vi sinh vật, qua đó nghiên cứu thành phần của Microbiota [19]. Tác giả Clarridge J. (2004) lƣu ý một số điểm sau khi định tên vi sinh vật [19]: - Khi đối tƣợng định tên là các vi sinh vật mới tìm thấy, cần thiết giải toàn bộ trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn và trình tự không chứa hơn 1% các base không xác định. - Trình tự 16S rRNA quyết định chủ yếu tên của chủng vi khuẩn. Đối với một chủng chƣa biết, khi mối tƣơng quan giữa trình tự gen 16S rRNA và các đặc điểm kiểu hình (đặc tính sinh hóa, hình thái vi khuẩn…) không thống nhất, trình tự gen quyết định tên và vị trí phân loại của chủng xem xét. 1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI Hệ tiêu hóa của ngƣời bao gồm nhiều ngăn với các hệ vi sinh vật Microbiota khác nhau. Số lƣợng và chủng loại các vi sinh vật trong Microbiota hệ tiêu hóa tăng dần khi đi xuống phần dƣới, với số lƣợng nhiều nhất ở manh tràng, trực tràng và ít nhất 9 ở dạ dày-nơi có độ pH khoảng 1-2 do dịch dạ dày tiết ra [47], [48] (Hình 3). Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời [47] Microbiota dạ dày đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con ngƣời nhƣ hỗ trợ tiêu hóa, khử độc, đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh… Tuy nhiên, sự thành phần của Microbiota bản địa dạ dày có thể bị biến đổi do nhiều nguyên nhân nhƣ ngoại cảnh, điều kiện môi trƣờng, tuổi tác, chế độ ăn uống, các yếu tố miễn dịch, việc sử dụng kháng sinh, thuốc điều trị... [33]. 1.3.1. Microbiota bản địa dạ dày ngƣời khỏe mạnh Môi trƣờng dạ dày đƣợc coi là quá khắc nghiệt đối với các loài vi sinh vật do dịch vị dạ dày (pH 1-2) quá axit, các loài vi sinh vật trôi rửa từ phía trên thực quản và khoang miệng cũng nhƣ từ phía dƣới ở tá tràng không thể xâm nhập và tồn tại trong dạ dày. Trƣớc kia dạ dày đƣợc coi là vô khuẩn, nhƣng năm 1984, Helicobacter pylori đƣợc chứng minh là loại vi khuẩn cƣ trú thƣờng xuyên trong Microbiota bản địa dạ dày [45]. Ngoài ra, Microbiota bản địa dạ dày còn chứa các vi sinh vật khác nhƣ Veillonella sp., Lactobacillus sp., và Clostridium sp. [68], [13]. 10 Bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN, một tập hợp các loài vi khuẩn phong phú đa dạng hơn đƣợc tìm thấy trong dạ dày. Các chi vi khuẩn khác không phải là Helicobacter pylori bao gồm các chi Lactobacillus, Streptococcus, Prevotella, Veillonella, Stomatococcus [50] và Rothia [14], [43]. Lactobacilli và streptococci là hai trong những loài đƣợc nuôi cấy từ dạ dày và cả hai chi này đều bao gồm các loài chịu đƣợc pH thấp [55], [56], [43]. Tóm lại, ở ngƣời trƣởng thành có chế độ tiết dịch axit bình thƣờng, ngoài H. pylori còn có vô số các loại vi khuẩn khác sống trong Microbiota bản địa dạ dày [64], trong đó chủ yếu là các vi khuẩn sinh axit lactic chịu axit. 1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh Lớp chất nhày (mucus) trong dạ dày là hàng rào bảo vệ ngăn chặn vi khuẩn làm tổ ở lớp biểu mô cũng nhƣ ngăn chặn sự khuếch tán của các hóa chất độc và axit dạ dày đến bề mặt biểu mô. Do đó, một khi vi khuẩn xâm nhập vào lớp chất nhày hoặc lớp chất nhày bị phân hủy thì viêm nhiễm của đƣờng tiêu hóa xẩy ra [60]. Tính di động và khả năng xâm nhập vào lớp chất nhày phụ thuộc rất cao vào sự vận động và hình dạng của vi khuẩn [61] và khả năng phân hủy chất nhày của chúng [22]. Nhiễm H. pylori thời gian dài dẫn đến thay đổi cấu trúc niêm mạc dạ dày, làm giảm tiết axit, tạo ra môi trƣờng kiềm , dẫn đến sự xâm nhập và phát triển vƣợt trội của các vi sinh vật khác trong dạ dày. Khi pH dạ dày trở nên kiềm, độ nhớt của lớp chất nhầy giảm, dễ dàng để các vi sinh vật thâm nhập [32]. Theo Giáo sƣ Zboril (2002), Microbiota dạ dày bản địa của ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh không chứa vi khuẩn kị khí [67]. Từ dạ dày của các bệnh nhân nhiễm H. pylori lâu ngày và bị viêm, loét, ung thƣ dạ dày, các loại vi sinh vật nhƣ nấm, vi khuẩn đã đƣợc phân lập [51], [14], [23]. Năm 1990-1991, vi khuẩn Gastrospirillum hominibee đƣợc phát hiện trong dạ dày ngƣời bệnh viêm dạ dày mạn tính [44], [65]. Ở Việt Nam, năm 2004, GS. Giao và cộng sự đã công bố một số vi khuẩn phân lập ở điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày của ngƣời bệnh Việt Nam [5]. Nấm Candida 11 krusei, trƣớc kia đƣợc cho là chỉ có ở các bệnh nhân bị HIV/AIDS đã đƣợc tìm thấy trong thƣợng và hạ vị của các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày [29]. Nấm Candida parapsilosis cũng đã đƣợc tìm thấy trong Microbiota dạ dày của các bệnh nhân bị viêm dạ dày mãn tính [10]. 1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là hậu quả của các tổn thƣơng viêm loét dạ dày cấp hoặc mãn tính không đƣợc điều trị triệt để. Y học hiện đại cho rằng, viêm dạ dày cấp tính chảy máu không phải là một bệnh mà là một hội chứng. Chảy máu ở đây thƣờng khởi phát đột ngột, ồ ạt, diễn biến nhanh, có thể nguy hiểm đe dọa tính mạng ngƣời bệnh, do đó đòi hòi phải theo dõi kỹ càng để xử trí kịp thời [16]. 1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày [9], [16], [30] * Triệu chứng lâm sàng a, Xuất huyết tiêu hóa: Khi chảy máu dạ dày xảy ra, bệnh nhân có thể nôn ra máu đỏ hoặc màu cà phê, đi ngoài phân đen. b, Rối loạn tiêu hóa, chán ăn, buồn nôn, nôn. c, Đau vùng thƣợng vị: Tùy trƣờng hợp mà bệnh nhân có thể bị đau tức, cồn cào nóng rát đến đau bụng quặn thành cơn dữ dội. d, Hiện tƣợng chóng mặt có thể xảy ra, bệnh nhân mệt mỏi và yếu, nhợt nhạt, thở ngắn, mạch nhanh và huyết áp giảm. * Triệu chứng cận lâm sàng Dịch dạ dày đục, niêm mạc phù nề, có các vùng trợt và xuất huyết. Xuất huyết có thể là những nốt hoặc đốm xảy ra riêng lẻ hoặc tập trung tạo thành những đám, mảng máu tụ đen hoặc hơi rỉ máu trên niêm mạc. Vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm mạc hoặc phân bố khƣ trú ở thân vị và hang vị. Hình 4 giới thiệu hình ảnh nội soi một số trƣờng hợp chảy máu dạ dày của một số bệnh nhân Việt Nam (a, b, c) và nƣớc ngoài (d, e, f). 12