Tài liệu Sắc ký lớp mỏng dược liệu chứa saponin.ppt

GVHD: Ths. Đỗ Văn Mãi 1 I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG - Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. - Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm: Pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. 2 I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách. Hệ số di chuyển Rf được tính theo công thức: Trong đó: - a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. - b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. - Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. 3 I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi R f = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:  Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ.  Bề dày của lớp mỏng.  Chất lượng và độ tinh khiết của pha động. 4 I. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG - Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn.  Phương pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC). 5 II. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chọn chất hấp phụ: cũng tương tự như sắc ký cột có thể dùng các chất hấp phụ là silicagel, nhôm oxit, bột cellulose, tinh bột, sephadex... - Để cho chất hấp phụ bám chắc vào phiến kính, người ta cho thêm chất dính vào chất hấp phụ. Chất dính thường là CaSO4 với tỷ lệ khoảng 10%. 6 II. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chuẩn bị phiến kính và lớp mỏng chất hấp phụ trên kính: •Các phiến kính thường có cỡ 20x5 cm, 20x20 cm, 7,5x2,6 cm. Rửa sạch, sấy khô trước khi rải. • Cân 5g bột silicagel cho vào cối nghiền đều với 10ml nước cất, lượng này có thể rải trên 2 phiến kính cỡ 20x5cm. Sau đó rải ngay lên phiến kính bằng tay hoặc bằng máy. • Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó sấy ở 1000C từ 30 - 120 phút tuỳ theo yêu cầu. Độ dày chuẩn của lớp mỏng là 0,25 - 0,30 mm. 7 II. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chuẩn bị mẫu thử: cũng giống như sắc ký giấy, các mẫu thử cần có cách chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất và cô đặc mẫu. - Dùng ống vi quản chấm mẫu cách bờ dưới phiến kính khoảng 1-2 cm. Vết chấm phải nhỏ, đường kính 2 - 5 mm cách xa nhau ít nhất 1 cm. 8 Một số dụng cụ cho SKML  Bình triển khai 9 Một số dụng cụ cho SKML  Bảng mỏng tráng sẳn 10 Một số dụng cụ cho SKML Uv lamps cabinet 365, 254nm Mao quản 11 Máy sấy bảng mỏng III. Một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản mỏng silicagel-G: 1. Saponin triterpenoid: a) Chloroform – methanol – nước (65:35:10) b) Ethyl acetat – acid acetic – nước (8:2:1) c) n-butanol – ethanol 12 III. Một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản mỏng silicagel-G: 2. Saponin nhóm spirostan: a)Chloroform – methanol – nước (65:35:10) b) Chloroform – methanol (8:2) c) n-butanol bão hòa nước 13 III. Một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản mỏng silicagel-G: 3. Saponin kiềm: a) Chloroform – ethanol – dung dịch amoniac 1% trong nước (2:2:1) b) Ethanol – pyridin – nước (3:1:3) 14  Dung môi phải là loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 các dung môi. Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ether, ethyl acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước. 15 IV. Tiến hành SKLM  Chiết xuất và tinh chế sơ bộ Saponin.  Chấm dung dịch trên bản mỏng.  Triển khai SKLM.  Cách phát hiện. 16 17 Chấm mẫu thử  Kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản mỏng 1cm làm vạch xuất phát.  Dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó. Các vết phải cách nhau và cách mép bản mỏng ít nhất 1 cm. 18 Triển khai SKLM  Quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh.  Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi động nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động.  Sau khi dung môi chạy được nửa hay 2/3 bản mỏng ta lấy ra để khô hay sấy khô. 19 Cách phát hiện  Dựa vào tính phá huyết bằng cách tráng một lớp gelatin – máu (hòa tan 5 g gelatin trong 100 ml dung dịch NaCl 9% ở 600C.Khi nguội đến 400C thì thêm máu bò đã loại fibrin) hoặc phun dung dịch treo máu 2% đã loại fibrin trên bản mỏng.  Các vết saponin sẽ cho vết mầu nhạt trên nền hồng đỏ. 20