Tài liệu Quy trình công nghệ sản xuất insulin.

Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học LỜI NÓI ĐẦU Có thể nói thế kỉ 21 là thế kỉ của công nghệ sinh học, thế kỉ ứng dụng ngày càng nhiều khoa học công nghệ . Nó không chỉ có ý nghĩa cách mạng hoá đối với sự phát triển sinh học, mà còn tạo quyền lực to lớn cho con người trong việc cải tạo sinh giới và bản thân mình. Công nghệ sinh học đã được phát triển và ứng dụng từ rất lâu. Tuy nhiên công nghệ sinh học chỉ thực sự phát triển từ thập niên 70 của thế kỉ XX, cùng với sự ra đời và hỗ trợ của của các ngành khoa học khác, đặc biệt công nghệ thông tin.Từ đó cho đến nay công nghệ sinh học đã phát triển như vũ bão và rất xứng đáng được mang danh cho thế kỉ mới: Thế kỉ công nghệ sinh học! Công nghệ sinh học là gì? Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng các hệ thống sinh học, các tế bào sinh vật, động vật, thực vật và các dẫn xuất của chúng để tạo ra các sản phẩm cải biến hoặc các quá trình chuyên hóa phục vụ lợi ích con người. Công nghệ sinh học là một ngành khoa học quan trọng, đang phát triển trên cơ sở các kĩ thuật mới mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩ thuật nuôi cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu này đang chuẩn bị cho một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành kinh tếkĩ thuật. Công nghệ vi sinh được coi là một trong những ngành mũi nhọn của công nghệ sinh học, có tác động to lớn đến đời sống con người do việc sử dụng vi sinh vật để tạo ra hàng loạt các sản phẩm như rượu, bia, axit hữu cơ, axit amin, các chất điều vị, dung môi hữu cơ, vitamin, kháng sinh, vacxin…. Công nghệ vi sinh còn được sử dụng để xử lý phế thải và làm sạch môi trường…. Vi sinh vật đã trở thành công cụ chuyển gen lý tưởng mà giá trị của nó là cùng một công cụ nhưng có thể tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao và giá thành rẻ. Công nghệ sản xuất Insulin là một trong những công nghệ ứng dụng công nghệ sinh học vi sinh trong sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Insulin là một dạng hoocmon điều chỉnh lượng đường trong máu người và động vật, thiếu Insulin sẽ gây ra bệnh tiểu đường sau đó dẫn đến các bệnh lý khác. Cũng như Insulin, các chất có hoạt tính sinh học cao như Interferon, hoocmon sinh trưởng GVHD: TS Trần Văn Lư -1- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học người( HGH), somatostatin …rất cần thiết cho việc phòng chống và chữa bệnh cho người. Thông thường các hợp chất có hoạt tính sinh học như trên được tổng hợp với một lượng nhỏ trong tế bào của cơ thể người và động vật bình thường. Một số người thiếu hụt các hợp chất trên đã gây ra các bệnh lý và cần điều trị bổ sung vào cơ thể. Ngày nay người ta đã sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng công nghệ di truyền với số lượng lớn, tinh sạch và có tính an toàn cao. Ý nghĩa đó, công đầu là của ngành công nghệ sinh học nói chung, công nghệ vi sinh nói riêng. Với lý do đó, tôi đã chọn đề tài : “ Quy trình công nghệ sản xuất Insulin” để làm rõ vấn đề trên. Vì thời gian có hạn nên chắc chắn tiểu luận này còn rất nhiều thiếu sót, rất mong quý thầy cô và các bạn góp ý để tiểu luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. NỘI DUNG GVHD: TS Trần Văn Lư -2- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học 1. INSULIN: 1.1. Sơ lược về lịch sử phát hiện Insulin Bệnh tiểu đường từng được biết đến từ thời cổ đại. Những tài liệu cổ của người Ai Cập từ 1.500 năm trước Công nguyên đã mô tả một bệnh suy mòn với tình trạng nước tiểu của người bệnh có vị ngọt. Từ những năm 1850 trở đi, các cuộc khám nghiệm tử thi trên bệnh nhân bị bệnh tiểu đường đã gợi ý, bệnh xuất hiện là do tuyến tụy không bảo đảm được chức năng bình thường. Nhiều bác sĩ cho rằng các tế bào biệt hóa, được gọi là tiểu đảo Langerhan, sản sinh ra một hóa chất giúp cơ thể điều hòa nồng độ đường trong máu. Bệnh tiểu đường xuất hiện khi hóa chất này không được sản sinh. H1 - Loại thuốc trị tiểu đường được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred Banting và Charles Best tìm ra năm 1922. Quá trình nghiên cứu sản xuất insulin có sự đóng góp rất quan trọng của các chú chó. Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học Tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng thành công chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người. Vào thời điểm đó, người bị bệnh tiểu đường phải vật lộn với căn bệnh để tồn tại và chưa có biện pháp điều trị hiệu quả nào. Bệnh nhân nhanh chóng trở thành những bộ xương di động và thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng. Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, và hậu quả là chúng bị tiểu đường (thử nghiệm này nghe có vẻ tàn nhẫn, nhưng đã giúp cứu sống hàng triệu con người). Họ đã cố gắng tinh chế ra một hoóc môn hóa học từ tụy và chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan. Sau đó, những chất này được tiêm vào chó bị bệnh tiểu đường để thử nghiệm và họ nhận thấy bệnh tiểu đường đã bị đẩy lùi. GVHD: TS Trần Văn Lư -3- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất và thường gây những tai biến nguy hiểm. Một đội ngũ các nhà khoa học đã phối hợp nghiên cứu và tạo ra được tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử nghiệm trên người bệnh. Vào tháng 5 năm 1922, Leonard Thompson, 14 tuổi, đã được điều trị thành công ở Bệnh viện Toronto bằng tinh chất này (được gọi là insulin). Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã chứng minh rằng insulin là một protein.Tin tức về sự thành công của Banting và Best đã nhanh chóng lan rộng và ngay sau đó phòng thí nghiệm của họ đã không thể đáp ứng đủ nhu cầu về loại thần dược mới này. Quy trình sản xuất thương mại insulin bắt đầu bằng việc chiết suất chất này từ tụy của bò và lợn thịt (hiện vẫn là nguồn insulin quan trọng đối với y học). Quá trình biến đổi hóa học đã làm cho insulin này giống với hoóc môn của người và cũng tạo cho nó những đặc tính thuận tiện hơn cho việc sử dụng. Ban đầu, insulin được tiêm 3-4 lần/ngày trước bữa ăn. Sau đó, loại insulin có tác dụng kéo dài được ra đời, vì vậy số lần tiêm đã giảm xuống. Năm 1955, Frederick Sanger, người đoạt giải thưởng Nobel, đã tìm ra chuỗi axit amin của insulin người. Điều này đã cho phép các nhà khoa học tạo ra một gene insulin, dùng để tạo ra chủng vi khuẩn biến đổi di truyền có khả năng sản sinh ra số lượng lớn insulin với độ tinh khiết cao. Ngày nay, chúng ta đều biết rằng insulin giúp các tế bào của cơ thể hấp thu đường từ thức ăn đã được tiêu hóa. Gan có vai trò đặc biệt quan trọng trong quy trình điều hòa nồng độ đường máu của cơ thể. Insulin giúp cho gan có thể tiếp nhận đường (glucose) sau bữa ăn và lưu trữ dưới dạng glycogen. Glycogen sau đó sẽ được chuyển hóa thành glucose và trở lại máu khi nồng độ đường máu bắt đầu giảm. 1965, người ta đã tổng hợp nhân tạo hai chuỗi polipepetit A và B rồi tạo ra Insulin nhân tạo nhưng giá thành quá đắt. Năm 1978, lần đầu tiên Insulin được tổng hợp nhờ vi khuẩn E.Coli bằng công nghệ di truyền. Người ta đã tạo ra các dòng plasmic tái tổ hợp bằng cách gắn các đoạn gen tổng hợp chuỗi polipeptit A và B vào các vật chất di truyền của tế bào E.Coli , sau đó gắn hai loại chuỗi polipeptit với nhau tạo ra phân tử Insulin có hoạt tính dùng trong chữa bệnh GVHD: TS Trần Văn Lư -4- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Từ năm 1982, Insulin sản xuất bằng công nghệ gen đã trở thành thương phẩm. 1.2. Cấu trúc Insulin: Insulin là một hoocmon protein do các tế bào tuyến tụy beta của đảo Langerhans sinh ra. Phân tử Insulin tương đối nhỏ, có khối lượng khoãng 6000 Dalton, được cấu tạo bởi hai chuỗi polipeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết nhau bằng cầu nối disulfua, ngoài ra còn có một cầu nối disulfua nằm trong chuỗi A. Ở hầu hết các loài, chuỗi A gồm 21 axitamin còn chuỗi B gồm 30 axitamin. Mặc dù trình tự các aaxitamin khác nhau giữa các loài nhưng một số đoạn nhất định của phân tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó có chứa 3 cầu nối disulfua, cả hai đầu của chuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B. Sự tương đồng trong tình tự axitamin dẫn đến cấu trúc 3 chiều của Insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau. Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác Các phân tử Insulin có xu hướng tạo thành dạng dime trong dung dịch do hình thành các liên kết H giữa các đầu COOH của các chuỗi B. Ngoài ra, khi có mặt ion kẽm, các dime insulin liên kết tạo thành hexame. Các mối tương tác này có ý nghĩa rất quan trọng trong điều trị. Dạng monome và dime dễ dàng khuếch tán vào trong máu, trong khi đó dạng hexame khuếch tán rất kém. Do đó, sự hấp thụ các thuốc chứa hàm lượng hexame cao thường bị chậm và ngừng hẳn. Vấn đề này đã thúc đẩy sự ra đời của một số loại chất insulin giả tái tổ hợp. Loại chất đầu tiên như thế được bán trên thị trường là insulin lispro, phân tử chất này có trật tự lisin và prolin trên đầu COOH của chuỗi B bị đảo ngược, làm giảm khả năng hình thành dạng dime và hexame. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng “preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SPB-C-A. Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết GVHD: TS Trần Văn Lư -5- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học giữa chuỗi B và peptide C và sau đó bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng là tạo thành insulin. H.2 – Cấu trúc phân tử Insulin 1.3. Vai trò của Insulin: Insulin là một trong những hoocmon điều hòa nồng độ Glucose trong máu. Chức năng cân bằng nội môi và năng lượng sinh học này cực kỳ quan trọng bởi vì Glucose là nguồn nguyên liệu chính của hô hấp tế bào và nguồn khung Cacbon quyết định cần cho tổng hợp các chất hữu cơ. Cân bằng trao đổi chất phụ thuộc vào việc duy trì Glucose máu ở gần một điểm ổn định,khoãng 90mg/ml ở người ( Theo Campbell) 1.3.1. Insulin và trao đổi Hidratcacbon: Glucose được giải phóng từ tinh bột, saccarose….nhờ thủy phân khi tiêu hóa thức ăn, sau đó được hấp thụ vào máu ở ruột non. Nồng độ Glucose cao trong máu kích hoạt sự giải phóng Insulin và Insulin hoạt động trong các tế bào khắp cơ thể nhằm thscđẩy sự hấp thụ, sử dụng và dự trữ Glucose. Tác động của Insulin lên trao đổi Glucose thay đổi tùy theo mô đích. Các phân tử Insulin tuần hoàn theo dòng máu cho tới khi chúng gắn vào thụ thể của chúng trên màng tế bào. Khi đó, phức hợp thụ thể -Insulin khởi phát GVHD: TS Trần Văn Lư -6- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học một chuỗi truyền tín hiệumang thông tin được phát ra từ Insulin : chuyển glucose ra khỏi huyết tương. H 3 – Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào và tuần hoàn trong máu Trong một loạt các đáp ứng tế bào do sự hoạt hóa Insulin gây ra thì bước chìa khóa trong trao đổi chất Glucose GLUT4 glucose transporter. Nhờ sự vận chuyển thuận lợi glucose vào trong các tế bào, các GLUT4 đã loại glucose ra khỏi dòng máu một cách hiệu quả. Những thay đổi như vậy kéo dài từ vài phút đến vài giờ. GLUT4 có mặt trên màng tế bào của nhiều loại mô trong cơ thể như mô cơ xương( đốt cháy Glucose làm năng lượng), mô mỡ ( chuyển glucose thành tryglyxerit để dự trữ) và mô gan. Insulin thúc đẩy gan dự trữ Glucose để hình thành Glycogen. Phần lớn Glucose được hấp thụ ngay tại ruột non vào các tế bào gan, chuyển hóa thành chất dự trữ glycogen. Insulin có nhiều tác động trong gan thúc đẩy sinh tổng hợp glycogen. Đầu tiên nó hoạt hóa enzym hexokinaza, chất này photphorin hóa glucose, nhờ đó glucose bị bẩy vào trong tế bào. Insulin còn ức chế hoạt động của Glucose-6-phosphatase. Insulin cũng hoạt hóa nhiều enzym liên quan trực tiếp đến sinh tổng hợp glycogen, bao gồm phosphofructokinase và glucogen syntase. Khi không có mặt Insulin, tổng hợp Glycogen trong gan dừng lại và các enzym chịu trách nhiệm phân hủy Glycogen sẽ hoạt động. GVHD: TS Trần Văn Lư -7- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học H.4 – Insulin điều hòa lượng glucose trong máu Vì Insulin ngăn cản mức độ tăng quá cao của đường máu nên không được phép có quá nhiều Insulin. Một bước trong kiểm soát mức độ Insulin là enzym Insulinnase ( được tìm thấy trong gan và thận ) phân hủy Insulin đang tuần hoàn trong máu, làm cho hoocmon này phân hủy với thời gian bán rã khoãng 6 phút. Quá trình này bảo đảm mức độ Insulin lưu hành trong máu được điều chỉnh và mức độ glucose máu không giảm xuống thấp đến mức nguy hiểm. 1.3.2. Insulin và trao đổi lipit: Insulin có tác động quan trọng lên quá trình trao đổi lipit. Các tác động đó bao gồm: 1.3.2.1. Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp axit béo trong gan: Khi lượng Glycogen tích tụ trong gan quá cao ( > 5% khối lượng thô của gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Khi gan bão hòa Glycogen thì bất kỳ lượng Glucose nào được hấp thụ thêm vào tế bào gan đều phải chuyển sang con đường tổng hợp axit béo, sau đó được vận chuyển ra khỏi gan dưới dạng lipoprotein. Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do cho các mô, như mô mỡ ( tế bào tạo mỡ) để tổng hợp triglyxerit. 1.3.2.2. Insulin ức chế phân hủy chất béo trong mô mỡ: Bằng cách ức chế quá trình thủy phân triglyxerit thành glyxerol và axit béo tự do. Enzim nhạy GVHD: TS Trần Văn Lư -8- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học cảm với hoocmon này trở nên hoạt động khi được photphorin hóa. Insulin ngăn cản quá trình này khi nó kết hợp với các thụ thể trên màng tế bào, làm tăng sự tích tụ glyxerit trong các tế bào mỡ. 1.3.3. Insulin và các tác động khác: - Insulin làm tăng tính hấp thụ các axitamin - Insulin làm tăng tính thấm của tế bào đối với ion Kali, Magie, photphat vô cơ , tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình photphorin hóa và sử dụng glucose H5-Insulin làm tăng tính thấm ion K, Mg và photphat vô cơ 1.4. Tổng hợp tự nhiên Insulin trong cơ thể: Insulin được tổng hợp bởi các tế bào tuyến tụy beta. Các tế bào beta sắp xếp thành các bó gọi là các đảo Langerhan trong tụy. insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để đảm bảo sự gấp nếp đúng. H.6 - Tổng hợp Insulin trong cơ thể GVHD: TS Trần Văn Lư -9- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học ANRm tiến hành dịch mã một protein gọi là preproinsulin. Preproinsulin bao gồm một trình tự tín hiệu đầu amin giúp tiền chất hoocmon này đi qua màng lưới nội chất tham gia vào quá trình sau dịch mã. Tại quá trình sau dịch mã, trình tự tín hiệu đầu amin không cần thiết nên preproinsulin bị thủy phân tạo thành proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu nối disunfua một số peptitdase sẽ phân cắt proinsulin tạo insulin hoàn chỉnh và hoạt động. Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết, tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích hoạt để giải phóng. H 7 – Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử Insulin 2. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG: 2.1. Dịch tễ học: Tiểu đường ( diabetes ) là bệnh rối loạn về chuyển hóa cacbohydrat, trong đó đường trong máu không bị oxi hóa để giải phóng năng lượng mà tích tụ trong máu ở mức cao (> 1,2g/l) gọi là tăng đường huyết. Ở Mỹ, hằng năm có khoãng 17 triệu người ( 6%) dân số mắc bệnh tiểu đường, gây tử vong cho 400.000 cư dân Hoa Kỳ và đứng thứ 6 trong các bệnh gây chết người. Tiểu đường phổ biến nhất ở độ tuổi trên 45 tuổi, đối với những người béo phì, ít hoạt động, những người có người thân bị mắc bệnh và những GVHD: TS Trần Văn Lư - 10 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học người Châu Phi, Tây Ban Nha, người Mỹ bản xứ. Tỉ lệ mắc bệnh ở nữ giới cao hơn nam. Tại Việt Nam, trong 4 thành phố lớn Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng, tỷ lệ bệnh tiểu đường là 4%, riêng quận Hoàn Kiếm (Hà Nội) lên tới 7%. Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn, hệ thống dự phòng, phát hiện bệnh sớm nhưng chưa hoàn thiện. Vì vậy, mỗi năm có trên 70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị. Tỷ lệ mang bệnh tiểu đường ở lứa tuổi 3064 là 2,7%, vùng đồng bằng, ven biển 2,2%, miền núi 2,1%. Nếu không được phòng chống và cứu chữa kịp thời, bệnh dễ biến chứng, 44% người bệnh đái tháo đường bị biến chứng thần kinh, 71% biến chứng về thận, 8% bị biến chứng mắt. Hiện trên thế giới ước lượng có hơn 190 triệu người mắc bệnh tiểu đường và số này tiếp tục tăng lên. Ước tính đến năm 2010, trên thế giới có 221 triệu người mắc bệnh tiểu đường. Năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ bệnh tăng lên ở các nước phát triển là 42%, nhưng ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) sẽ là 170%. 2. 2. Phân loại, nguyên nhân, triệu chứng và hướng điều trị: Ở những bệnh nhân bị tiểu đường, hàm lượng glucose trong máu cao, làm tăng áp lực thẩm thấu nhưng quá trình hấp thụ glucose vào máu lại yếu. Khi hàm lượng glucose cao vượt quá ngưỡng hấp thụ của thận thì cơ quan này sẽ đào thải glucose theo nước tiểu dẫn đến nước và ion cần thiết cho sự trao đổi chất qua màng tế bào ra ngoài. Có hai loại tiểu đường chính: 2. 2.1. Tiểu đường typ I: * Tiểu đường typ 1 hay còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin ( IDDMInsulin Dependent Diabetes Mellitus). * Triệu chứng: xuất hiện đột ngột, nhanh như ăn nhiều, uống nhiều, sút cân nhanh, giảm thị lực, nóng tính, mệt mỏi…thường gặp ở tuổi thanh niên (< 30 tuổi), chiếm từ 10-15% số ca * Nguyên nhân: các tế bào beta ở tuyến tụy bị phá hủy, dẫn đến thiếu hụt tổng lượng insulin. Các tế bào này bị phá hủy có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau. Do bệnh tự miễn, khi cơ thể tiếp xúc hay bị nhiễm một loại virut tiềm ẩn , chất độc…cơ thể đáp lại bằng cách tạo kháng thể chống tác nhân gây hại đó. GVHD: TS Trần Văn Lư - 11 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Nhưng kháng nguyên virut lại giống với kháng nguyên tế bào tuyến tụy nên kháng thể được hình thành để chống tác nhân gây hại cũng chống lại mô tuyến tụy, gây phá hủy tế bào beta. Đây là phản ứng tự miễn. Các nhà khoa học đã xác định được 20 gen đóng vai trò mẫn cảm với tiểu đường typ 1 , mặc dù chức năng của nó còn đang được nghiên cứu. Đối với hệ tiểu đường typ 1, để điều trị, chỉ cần bổ sung thêm insulin là có thể duy trì được sự sống cho người bệnh. Đối với những bệnh nhân bị tiểu đường typ 1 không thể kiểm soát tốt đường huyết bằng các loại thuốc uống thì sử dụng liệu pháp Insulin tích cực là chìa khóa để bệnh nhân kiểm soát đường huyết của mình và ngăn ngừa các biến chứng do bệnh gây ra. Liệu pháp insulin tích cực có thể ngăn ngừa hoặc làm chậm tiến triển các biến chứng mạn tính của bệnh ĐTĐ, đặc biệt là các biến chứng thận, mắt, tim mạch... Kết quả các nghiên cứu cho thấy, liệu pháp insulin tích cực có thể: làm giảm nguy cơ bị biến chứng mắt tới hơn 75%; làm giảm nguy cơ bị biến chứng thần kinh tới 60%; và ngăn ngừa hoặc làm chậm tiến triển các biến chứng thận tới 50%. Ngoài ra, nó còn đem lại nhiều lợi ích khác. Ví dụ các bệnh nhân điều trị insulin tích cực, kiểm soát tốt đường huyết thường cảm thấy khỏe hơn, tăng cân và tăng khả năng hoạt động thể lực, làm việc... Liệu pháp insulin tích cực là một phương pháp điều trị tích cực được thiết kế nhằm kiểm soát đường huyết của người bệnh càng gần mức của người bình thường. Liệu pháp này đòi hỏi người bệnh phải tiêm nhiều mũi insulin và kiểm tra đường huyết thường xuyên hằng ngày. Về mục tiêu, các bệnh nhân điều trị insulin tích cực nhằm kiểm soát đường huyết trong mức lý tưởng là: đường huyết trước bữa ăn từ 90 – 130 mg/dL; đường huyết sau bữa ăn 2 giờ nhỏ hơn 180 mg/dL; hemoglobin A1C (chỉ số đánh giá kiểm soát đường huyết trong vòng 3-4 tháng) dưới 6,5%. Ngoài ra, theo tờ MedNews, 5/2007, một số nhà khoa học đã có một công trình nghiên cứu về phương pháp sử dụng tế bào gốc để điều trị bệnh tiểu đường typ 1 bằng cách phục hồi chức năng của tế bào tuyến tụy beta. Khi một người lần đầu tiên được chẩn đoán là mắc bệnh tiểu đường, ở người đó vẫn còn một số tế bào bêta còn khả năng thực hiện chức năng sản xuất insulin, bởi vậy các nhà khoa học tìm cách ngăn chặn sự phá huỷ tiếp theo. GVHD: TS Trần Văn Lư - 12 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Những công trình nghiên cứu trước đây về các kháng thể phong toả những tế bào miễn dịch bị phá huỷ đã chứng tỏ là thành công trong một thời gian nhất định. Ở một công trình nghiên cứu mới đây, liệu pháp miễn dịch đã được kết hợp với các tế bào gốc cấy vào bệnh nhân, xem ra đã cải thiện được chức năng của các tế bào bêta. Ở công trình nghiên cứu này, do các nhà khoa học ở trường Đại học Sao Paulo, Braxin và Northwestern, Chicago thực hiện, các tế bào gốc đã thu được từ máu của bệnh nhân. Tiếp đó, chúng được tiến hành một dạng hoá trị liệu để khỏi bị tế bào miễn dịch tiêu diệt. Sau khi các bệnh nhân được tiêm tế bào gốc, họ được theo dõi về mức độ phụ thuộc insulin và chức năng của tế bào bêta. Kết quả cho thấy 13 trong số 15 bệnh nhân được điều trị bằng phương pháp này đã có thể không cần phải tiêm bổ sung insulin trong khoảng thời gian từ 9 tháng đến 3 năm. Các chuyên gia cảnh báo rằng những kết quả trên vẫn còn mang tính sơ bộ và cần phải tiến hành nhiều nghiên cứu hơn nữa. Tuy nhiên, đó là một phương pháp đầy hứa hẹn, vì xem ra nó không gây ra các tác dụng phụ và do đó rất đáng được tiến hành. Phép điều trị này chỉ có công hiệu đối với những bệnh nhân mới bị mắc bệnh, bởi vì họ vẫn còn các tế bào bêta nguyên vẹn để thực hiện chức năng. Các nhà khoa học cũng đang tìm kiếm các liệu pháp khác cho những bệnh nhân mắc bệnh đã lâu. Tiểu đường typ 1 nếu không được điều trị có thể ảnh hưởng đến cơ chế chuyển hóa chất béo. Do cơ thể không chuyển hóa glucose thành năng lượng, nên chất béo sẽ được dùng để cung cấp năng lượng. Điều này dẫn đến tăng hàm lượng các hợp chất có tính axit trong máu ( thể ketone) can thiệp vào quá trình hô hấp nội bào. 2.2.2. Tiểu đường typ II: * Tiểu đường typ II, còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin (NIDDM-non-insulin-dependent-diabete mellitus. * Nguyên nhân: Khi giải phẫu bệnh lý vi thể ở đảo tụy cho thấy: chỉ có 25% bệnh nhân tiểu đường có giảm tiết Insulin, 25% không giảm tiết và 50% tế bào beta tăng tiết. Như vậy tiểu đường typ II đặc trưng bởi sự thiếu hụt insulin, GVHD: TS Trần Văn Lư - 13 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học hoặc phổ biến hơn là giảm tính đáp ứng của các tế bào đích đối với insulin do một số thay đổi ở thụ thể dành cho nó ở trên màng tế bào. * Triệu chứng: bao gồm các triệu chứng của tiểu đường typ I, và một số triệu chứng khác như viêm da, sự hồi phục vết thương chậm hoặc khó phục hồi, thường chỉ được phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu trước khi mổ hoặc khi có biến chứng như nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não; khi bị nhiễm trùng da kéo dài; bệnh nhân nữ hay bị ngứa vùng do nhiễm nấm âm hộ; bệnh nhân nam bị liệt dương Loại tiểu đường typ II chiếm khoãng 90% số ca bị bệnh tiểu đường. Tiểu đường typ II thường xuất hiện nhiều ở lứa tuổi trên 45. Do các triệu chứng của nó xuất hiện chậm nên người bệnh có thể không nhận biết được ngay họ đang mắc bệnh. Mặc khác, các nhà khoa học cho rằng có mối liên quan chặt chẽ giữa béo phì và tiểu đường typ II. Khoãng 80% số người béo phì bị tiểu đường typ II. Việc chữa trị loại bệnh này phải kết hợp giữa tập luyện và chế độ ăn uống để giảm sự kháng insulin và tăng cường việc tiết insulin. Chỉ dùng đủ lượng hidratcacbon cho nhu cầu cơ thể. Ngoài ra, sử dụng thêm thuốc hạ đường huyết như sunfamid hay biguanid. Trong trường hợp thất bại, cần phải điều trị bằng tiêm insulin đơn thuần hay phối hợp với thuốc viên uống. 2.3. Biến chứng: Tiểu đường typ I khi bị biến chứng có thể dẫn đến hôn mê đường huyết (một trạng thái vô thức gây ra do lượng đường cực kỳ cao trong máu) hoặc tử vong. Cả tiểu đường typ I và II đều có biến chứng mù, thận hư và bệnh tim. Tiểu đường có thể khiến các mạch máu nhỏ bị tắc; nếu điều này xảy ra ở các mạch máu ở mắt thì sẽ gây bệnh võng mạc, dẫn đến mù. Tiểu đường khiến cho thận mất khả năng lọc chất độc (khoãng 40%). Tắc mạch máu lớn dễ dẫn đến vấn đề về tim mạch (cao huyết áp, nhồi máu cơ tim và đột quỵ), nguy cơ cao gấp 2-4 lần ở những người không bị tiểu đường. Tiểu đường còn có khả năng gây tổn thương thần kinh ngoại biên, mất cảm giác, đặc biệt ở chân, tổn thương thần kinh thực vật và nhiễm trùng. 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN: GVHD: TS Trần Văn Lư - 14 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học 3.1. Quy trình sản xuất Insulin trước đây: 3.1.1. Đặc điểm quy trình: Sau khi hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G. Bantingvà Charles H. Best )phát hiện ra insulin và vai trò của chúng từ thí nghiệm về những chú chó, từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bò. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin. Nhược điểm của việc sản xuất Insulin dùng trong lâm sàng chủ yếu có nguồn gốc động vật ( bò và lợn). Tụy của động vật này sẽ được dùng để tách chiết insulin , vì thế cần một lượng lớn tụy mới có thể sản xuất một lượng nhỏ insulin. Việc insulin được sản xuất trực tiếp từ tụy động vật thường có cấu trúc không hoàn toàn giống với insulin người, hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin người , khả năng hấp thụ kém, có thể gây ra những phản ứng phụ. Mặt khác trong quá trình tách chiết, không thể loại bỏ hết đươc những tác nhân gây bệnh của động vật, quá trình tách chiết này đòi hỏi kỷ thuật cao, chi phí đắt, không thể sản xuất với qui mô rộng lớn, giá thành cao. 3.1.2. Nhược điểm quy trình sản xuất Insulin chiết xuất từ động vật: • Insulin động vật (bò và lợn) có cấu trúc không hoàn toàn giống cấu trúc Insulin ở người • Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin của người’ • Khả năng hấp thụ kém • Có thể gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể người( gây dị ứng) • Trong quá trình tách chiết, không loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh từ đông vật • Quá trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao GVHD: TS Trần Văn Lư - 15 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học • Chi phí đắt (do cần lượng lớn tụy để sản xuất insulin) • Không thể sản xuất lượng lớn trên quy mô lớn • Giá thành cao. 3.2 . Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất Insulin: 3.2.1. Khái quát về công nghệ AND tái tổ hợp: Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốn Những hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ hợp Kỹ thuật AND tái tổ hợp gồm các bước cơ bản sau: • Tách chiết tạo ra AND, ARN theo mong muốn ( phân lập gen) • Tạo vector tái tổ hợp ( chuẩn bị vector tách dòng, enzym cắt giới hạn và enzym nối) • Chuyển ( biến nạp) AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen • Sàng lọc và theo dõi sự hoạt động của gen được chuyển vào trong tế bào chủ, tạo số lượng lớn đoạn AND theo mong muốn để sử dụng vào mục đích khác nhau. 3.2.1.1. Phân lập gen: * Tách chiết AND:tùy theo nguồn axit nucleic,có những kiểu tách chiết khác nhau: - Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ protein bằng enzim, kết tủa và tinh sạch AND bằng hóa chất, dung môi, dịch chiết thích hợp. - Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết AND như trên. Tuy nhiên chúng ta trực tiếp lấy các mẫu sinh phẩm như lông, tóc, thịt, máu, nước bọt., mô thân , rễ, lá…. GVHD: TS Trần Văn Lư - 16 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học * Tách chiết ARN: quy trình tương tự tách chiết AND, dịch chiết sau khi làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy AND, kết tủa thu ARN. * Định lượng AND, ARN: sản phẩm sau khi tách chiết cần có độ tinh sạch và hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định chỉ số hấp phụ, tù đó đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết. Hoặc dùng phương pháp điện di trên gel thạch xác định băng AND, ARN, suy ra độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu. 3.2.1.2. Tạo vector tái tổ hợp: ► Vector tách dòng: là phân tử AND có kích thước nhỏ, có khả năng gắn các gen cần thiết, tự tái bản, tồn tại trong tế bào chủ và đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết trong tế bào chủ đã mang vector tái tổ hợp Các loại vector tách dòng thường dùng : ❖ Plasmid : phân tử AND dạng vòng, xoắn kép, có trong tế bào chất của vi khuẩn. ❖ Phagơ : phần lớn là phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài các gen khác nhau, giúp các gen này dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả năng và có khả năng sao chép nhanh. ❖ Virut của tế bào nhân thực: virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut herpes…được sử dụng trong tách dòng và chuyển gen ở tế bào động vật, thực vật ► Enzym cắt giới hạn: là enzym có khả năng nhận biết một đoạn trình tự trên phân tử AND và cắt AND ở những điểm đặc hiệu. Đồng thời cắt gen từ hệ gen nào đó, cắt vector tách dòng hoặc vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn các đoạn gen cần thiết. Các loại enzym giới hạn thường dùng : ❖ Enzym giới hạn cắt đầu so le ( đầu dính) là enzym có khả năng nhận biết đoạn trình tự nhưng lại cắt ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn, tạo đầu dính, nối các đoạn AND bị cắt lại với nhau. ❖ Enzym giới hạn cắt đầu bằng: là enzym nhận biết đoạn trình tự và cắt tại vị trí giới hạn, tạo đầu bằng nhau và chúng không tự nối lại được, cần sử dụng enzym nối để nối các đoạn cắt lại với nhau hoặc các đoạn nối chuyên dụng cho mỗi loại enzym. GVHD: TS Trần Văn Lư - 17 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học ► Enzym nối Ligasa: là những enzym quan trọng trong tế bào, chúng xúc tác hình thành các liên kết photphodieste để nối các đoạn axit nucleic với nhau. Có 3 loại enzym nối quan trọng trong Công nghệ di truyền: enzym E.Coli AND tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T4 AND và enzym T4 ARN tách chiết từ phage T4 . Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính adaptor ) cho các enzym đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn ADN do các enzym cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu sol. Các adaptor đặc trưng riêng cho mỗi loại enzym. Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn AND khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn sẽ tạo ra sản phẩm AND tái tổ hợp 3.2.1.3. Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen: - Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trực tiếp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ có thể là vi khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ bộ máy di truyền của tế bào chủ nhân bản AND tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn. - Những tế bào chủ chính thường dùng: ❖ Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, ít tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dòng AND tái tổ hợp nhanh. ❖ Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro; loại tế bào này thường dùng vào mục đích cụ thể; như nghiên cứu điều hòa hoạt động của gen, đột biến gen… - Những phương pháp chủ yếu được dùng để đưa AND tái tổ hợp vào tế bào nhận: ❖ Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( không có thành Xelulose) trong môi trường thích hợp ❖ Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ trên tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào chủ ❖ Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ AND vào tế bào chủ hoặc tế bào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi 4-8 tế bào GVHD: TS Trần Văn Lư - 18 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học ❖ Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen của tế bào chủ. Vi đạn là các hạt Volfram hoặc vàng trộn với gen cần chuyển và phụ gia, vi đạn được bắn vào viên đạn lớn hơn, khi bắn, viên đạn lớn được giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn. 3.2.1.4. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen: Việc chọn lọc đúng dòng tế bào như ý không đơn giản và tốn nhiều công sức. Khi xác nhận ADN tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và mang đúng gen cần thiết thì chúng được sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho gen biểu hiện ❖ Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau khi biến nạp ADN vào tế bào nhận, tạo nhiều dòng tế bào vi khuẩn khác nhau. Chúng được nuôi cây thành những dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tế bào vi khuẩn không nhận được plasmit, dòng nhận được plasmit không có gen lạ và dòng nhận đúng plasmit tái tổ hợp). Do đó muốn nhận đúng và tách đúng dòng gen từ thư viện ADN, người ta sử dụng phương pháp: - Lai axit nucleic: làm tan tại chỗ các khuẩn lạc vi khuẩn trên giấy lọc nitrocellulose và ADN thoát ra gắn với mẫu thử axit nucleic có mang dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu. Nếu hiện tượng bắt cặp bổ sung xảy ra có nghĩa là gen đã được chuyển vào tế bào nhận - Phát hiện kiểu hình: đòi hỏi dòng mục tiêu phải có biểu hiện ra ở dạng protein dễ phát hiện bằng các phép thử. - Phản ứng miễn nhiễm: khi tế bào nhận được plasmit có gắn đoạn ADN lạ thì tế bào vi khuẩn mất hoạt tính kháng tetracyclin, do đó khuẩn lạc chỉ mọc được trên môi trường có ampicilin, không mọc được trên môi trường có tetrecyclin. Đây là dòng tế bào cần chọn ❖ Sự biểu hiện của gen được tạo dòng: nói chung gen lạ sau khi được đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã phù hợp trên cơ sở là cơ chế điều hòa biểu biểu hiện của gen. Các vector này gọi là vector biểu hiện. 3.2.2. Ý nghĩa của sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin: GVHD: TS Trần Văn Lư - 19 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Trên thị trường hiện có 4 loại Insulin tổng hợp chủ yếu , được phân loại theo thời gian bắt đầu hoạt động , thời điểm đạt cực đại và thời gian kéo dài tác dụng của thuốc. Với vai trò của công nghệ ADN tái tổ hợp lượng Insulin được sản xuất ra vè cơ bản đã đáp ứng được nhu cầu Insulin của bệnh nhân tiểu đường. Theo Hiệp hội Tiểu đường của Mỹ, insulin tác động nhanh vào máu trong vòng 15 phút, đạt cực đại trong 30-90 phút và có thể kéo dài 5 giờ. Có loại Insulin tác dụng khá lâu, có thể tồn tại trog máu tư 20 – 24 giờ, hoặc hiện nay trên thị trường một số Insulin được bán ở dạng hỗn hợp hai loại cùng đóng trong một lọ, làm tăng hiệu quả điều hòa điều trị bệnh Hiện nay công nghệ sinh học đã trở thành phương tiện hữu hiệu và có rất nhiều ứng dụng vô cùng to lớn. sản xuất Insulin là một bước nhảy vọt trong việc chữ trị bệnh tiểu đường. Ngoài ra một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụng công nghệ này để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh tế. khi sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ khá nhiều mà chất luuwongj ssanr phẩm vãn bảo đẩm, chính là nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao của tế bào nhân tham gia quy trình con nghệ ADN tái tổ hợp. 3.2.3. Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ AND tái tổ hợp: Tổng hợp Insulin người là một quá trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm hai phương pháp 3.2.3.1. Phương pháp 1: Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh. ◆ Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11. Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó. Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác. Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN. GVHD: TS Trần Văn Lư - 20 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng