Tài liệu Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của pepper yellow leaf curl việt nam virus

MỤC LỤC 1 ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................................11 1.1 Giới thiệu..............................................................................................................................11 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài........................................................................................12 1.2.1 Mục tiêu........................................................................................................................12 1.2.2 Yêu cầu.........................................................................................................................12 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................................13 2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua.................................................................................13 2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus................................................................................13 2.2.1 Đặc điểm hình thái.....................................................................................................14 2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus.......................................................................14 2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A..................................................................................15 2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B..................................................................................16 2.2.5 Đặc điểm của vùng IR...............................................................................................16 2.2.6 Phân loại các Begomovirus......................................................................................17 2.2.7 Tái sinh của Begomovirus........................................................................................17 2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus........................................................................18 2.2.9 Môi giới truyền bê ̣nh và ss lan truyền..................................................................19 2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra.............................................................20 2.2.11 Phòng chống................................................................................................................21 2.3 Một số begomovirus hại cà chua....................................................................................22 2.4 Một số begomovirus hại ớt..............................................................................................23 2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR........................................................................................23 2.5.1 Giới thiệu và nguyên lý.............................................................................................23 2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication).................................................................24 2.7 Kĩ thuâ ̣t Agroinoculation..................................................................................................25 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................28 3.1 Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................................28 3.2 Địa điểm nghiên cứu và thhi gian thsc hiê ̣n................................................................28 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu.................................................................................................28 3.3 Thhi gian thsc hiê ̣n............................................................................................................28 3.4 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................................28 3.4.1 Cây thí nghiệm:...........................................................................................................28 3.4.2 Thu thâ ̣p mâu...............................................................................................................29 3.4.3 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV..............................................................................................................................30 3.4.4 Chất kháng sinh.........................................................................................................32 3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm..........................................................................................32 3.4.6 Kit thương mại............................................................................................................33 3.4.7 Môi trưhng...................................................................................................................33 3.4.8 Các thiết bị chủ yếu...................................................................................................33 3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu...................................................................................................34 3.5 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................34 3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng..........................................................................34 3.5.2 Thí nghiê ̣m trong nhà lưới.......................................................................................35 3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR.................................................................35 3.5.4 Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)..................................37 3.5.5 Chạy điê ̣n di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng....................................39 3.5.6 Tinh chiết sản phẩm điện di.....................................................................................40 3.5.7 Xây dsng cấu trúc xâm nhiễm................................................................................40 3.5.8 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến.............................................................41 3.5.9 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt..............................................................................................................41 3.5.10 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trưhng chọn lọc..........42 3.5.11 Tinh chiết plasmid......................................................................................................42 3.5.12 Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells).......................43 3.5.13 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens khả biến... 44 3.5.14 Xác định trình ts gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng....45 3.5.15 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trưhng chọn lọc..........45 3.5.16 Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation.....................................46 3.5.17 Đánh giá tính gây bệnh.............................................................................................47 3.5.18 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn.........................................................................48 3.5.19 Kiểm tra các mâu bằng phản ứng ELISA.............................................................49 4 KÊT QUA VÀ THẢ LUẬN..................................................................................................53 4.1 Kết quả kiểm tra mô ̣t số loại virus gây hại trên ớt thu thâ ̣p trên cả nước giai đoạn 2012-2013..............................................................................................................................53 4.1.1 Kiểm tra virus gây hại thu thâ ̣p ngoài đồng tư các địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA........................................................................53 4.1.2 Kiểm tra virus gây hại thu thâ ̣p ngoài đồng tư các địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR...................................................................................55 4.2 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kĩ thuâ ̣t agroinoculation.....................................................................................................................58 4.2.1 Phục hồi các dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV..............................................................................................................................58 Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV ................................................................................................................................................................59 4.2.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.tumerfaciens trong môi trưhng LB-lỏng....60 4.2.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp Agroinoculation..........................................................................................................................61 4.2.4 Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation).......................63 4.2.5 Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng agroinoculation) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………66 4.3 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn .................................................................................................................................................69 4.3.1 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây cà tím nguồn bê ̣nh....................................70 4.3.2 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây ớt nguồn bê ̣nh...........................................71 4.4 Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đoàn giống ớt của AVRDC....71 4.4.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV...................................................72 4.4.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300...........................................................................74 5 KÊT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.........................................................................................................82 5.1 Kết luận................................................................................................................................82 5.2 Kiến nghị..............................................................................................................................82 6 TÀI LIỆU THAM KHẢ.......................................................................................................0 6.1 TÀI LIỆU TIÊNG VIỆT....................................................................................................0 6.2 TÀI LIỆU TIÊNG ANH.....................................................................................................0 6.3 CÁC TRANG WEB............................................................................................................4 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu A. tumefaciens AS ATP Bb CP CTAB ddNTP DNA Dntp dsDNA E.coli EDTA ICTV IR Kb LB ̉RF PCR RCA RE Rep RNA Rnase SDS SsDNA TAE Taq Vir β- ME Từ viết tắt Agrobacterium tumefaciens Acetosyringone Adenosine triphosphate Base pair Capsid protein Cetryl Ammonium Bromide Dideoxynucleoside triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Double strand DNA Escherichia coli Ethylene diamine tetra acetic acid International Committee on Taxonomy of Viruses Itergenic region Kilo base Luria and Bertani ̉pen reading frame Polymerase Chain Reaction Rolling circle amplification Restriction enzyme Replication protein Ribonucleic acid Ribonuclease Sodium Dodecyl Sulphate Singe strand DNA Tris – acetate – EDTA Thermus aquatic Virulence region Beta- Mercaptoethanol DANH MỤC BẢNG Bảng 3.4. Cây thí nghiê ̣m.........................................................................................43 Bảng 3.3. Các mâu ớt, cà tím thu thập (2013).........................................................44 Bảng 3.1. Thang phân cấp bệnh...............................................................................50 Bảng 3.6. Thí nghiệm lây nhiễm được thsc hiện với các công thức.......................62 Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra ELISA các mâu ớt thu được tại Việt Nam giai đoạn 2012-2013................................................................................................................68 Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra các mâu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1.....................................................................................................71 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống cà chua Hồng Lan (T20)........................................................................................................79 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống ớt Hiểm Lai F1-207................................................................................................................80 Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây chỉ thị.............................................................................................................................80 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giống cà chua Hồng Lan (T20).........................................................................82 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giống ớt Hiểm Lai F1-207................................................................................82 Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNAB trên cây chỉ thị......................................................................................................83 Bảng 7. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím nguồn bê ̣nh ..................................................................................................................................85 Bảng 8. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn bệnh.........85 Bảng 4.10. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC................................86 Bảng 4.3. Tóm tắt các bước xây dsng cấu trúc xâm nhiễm.....................................88 Bảng 4.4. Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp chiết khác nhau. .91 Bảng 4.5. Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA của PepYLCV..........................................................................................................93 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình thái của begomovirus......................................................................11 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus..............................12 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus............................................13 Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus............................................13 Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua..........................16 Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci...........................................................................18 Hình 3.1. Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A..................................................................28 Hình 4.32. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV.......................................................52 Hình 4.1. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Năng.....................54 Hình 4.2. Kiểm tra PCR các mâu đậu đỗ bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1..........................................................................................................54 Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV...........................................................................................................56 Hình 4.2. Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV nuôi trong LB – lỏng................................................................................................58 Hình4.6. Phương pháp tiêm trsc tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá...............................60 Hình 4.3. Sơ đồ các bước xây dsng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV sử dụng kỹ thuật RCA..................................................................................................70 Hình 4.4. Sơ đồ vector pCAMBIA2300..................................................................71 Hình 4.5.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi pCAMseqF1/R.........................................................................................................72 Hình 4.11. Điện di sản phẩm khi mở vòng pCAMBIA 2300 bằng BamHI.............72 Hình 4.8. Xử lý sản phẩm RCA mâu VNP1500 bằng cách cắt hoàn toàn với enzyme BamHI 10 u/µl............................................................................................74 Hình 4.9.Cắt không triệt để sản phẩm RCA ở các điều kiện khác nhau..................75 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua. Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thhi chúng tôi tiến hành lây nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn.. Dsa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thsc hiện trên một loạt các mâu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiê ̣n ss có mă ̣t của begomovirrus trên ớt tại miền Bắc. Chúng tôi đã tiến hành xây dsng thành công cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên tư Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNA-A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh. Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có thể được xác định dsa vào các phân tích phân tử Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thsc vật của Việt Nam vân còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập tư nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vân chưa có công bố nào cho thấy ss có mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mâu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trưhng ĐHNN Hà Nội) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử tư một mâu virus phân lập đầu tiên tư ớt thu thập tại Đà Năng (mâu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng nhiễm ts nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát hiện được một begomovirus gây hại ts nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan trọng cả về mặt khoa học và thsc tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các cây trồng quan trọng của Việt Nam. Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vân chưa được nghiên cứu. Dsa trên cơ sở khoa học và thsc tiễn trên, chúng tôi tiến hành thsc hiện đề tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus” 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu Xác định ss có mặt của PepLCVNV trên các mâu ớt và cà chua thu thập tại miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus. 1.2.2 Yêu cầu - Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội, Hưng Yên. - Thu thập mâu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình - Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mâu ớt và cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập tư trước. - Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị - Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng vector bọ phấn. 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua Cây ớt là mô ̣t loại quả của cây cây thuô ̣c chi Capsicum của họ Cà (Solanaceae). Ớt có nguồn gốc tư châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Đô ̣ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Viê ̣t Nam, ớt là mô ̣t gia vị thưhng xuyên có mă ̣t trong các bữa ăn, ngoài ra ớt còn có rất nhiều công dụng như: cải thiê ̣n hê ̣ tiêu hóa, giảm cân, chữa bê ̣nh ung thư, ngưa tai biến mạch, tăng sức đề kháng. Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc tư Nam Mỹ, nó được ngưhi Tây Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu. Cà chua là loài trái cây vưhn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vsc chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cũng như ớt, ở nước ta cà chua là mô ̣t gia vị hay có trong mỗi bữa ăn, bởi cà chua là mô ̣t thsc rất giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khoáng,và vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của caroténoïdes, như β-carotène cho một hoạt chất tiền vitamine A rất có lợi cho sức khỏe. 2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên tư Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (198 loài vào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài ts nhiên nhh bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Fauquet and Stanley, 2005). 2.2.1 Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương ts nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn thiện dân tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001). Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh: www.ncbi.nlm.nih.gov) 2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus Begomovirus là virus thsc vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A (Ha, 2007) Hình 2.2. ̣Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn ảnh: www.expasy.ch) 2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ̉RF (̉pen Reading Frame) được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2 mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm có 4 ̉RF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh (Rep protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAP- Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng cưhng tái sinh (REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha, 2007). Hình 2.3. ̣Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus (http://wcrc.confex.com) 2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B. DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ̉RF và cũng được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược kim đồng hồ chứa gen BC1. BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP. BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ. CR=Common Region CR DNA-B ~2.7kb BV1 (NSP) BC1 (MPB) Hình 2.4: ̣Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, ̣Coombs et al., 2008). 2.2.5 Đặc điểm của vùng IR Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này có chứa nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho ss nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng (stem-loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị trí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong quá trình tái sinh. Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng 150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng CR có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn gốc tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-B không thể ts tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có ss nhận biết và cắt- nối của protein Rep được mã hóa trên DNA-A (Ha, 2008) 2.2.6 Phân loại các Begomovirus Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Csu thế giới (̉ld world) là khu vsc Đông bán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999), (Rybicki, 1994) Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và csu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Csu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Csu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có mặt ở begomovirus của cụm Csu thế giới (Harrison and Robinson, 2005) Rybicki (1994) ds đoán rằng bọ phấn di chuyển tư Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay. Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Csu thế giới. 2.2.7 Tái sinh của Begomovirus Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thsc hiện trong nhân tế bào ký chủ (Gutierrez, Ramirez-Parra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996). Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vân chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhh vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vưa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh. 2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus Do virus phải dsa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào già cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngưng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trưhng, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thưhng triệu chứng xuất hiện sau 2-4 tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có thể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp khoảng một phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì những lý do trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thưhng gây thoái hoá. Ss huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trưhng và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở nước ta những năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012) Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng tư mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thưhng không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez et al., 1996). Bệnh thưhng xuất hiện vào các vụ có thhi tiết nóng như hè thu và xuân hè. Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua (httpwww.avrdc.org) 2.2.9 Môi giơi truyền bênh ̣ và sư lan truyền Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài ts nhiên nhh bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant). Bọ phấn Bemisa tabaci Gennadius (1989) thuô ̣c họ rầy phấn (Aleyrodidae), bô ̣ cánh đều (Homotera). Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được công nhâ ̣n đó là: Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy nhiều ở Hoa kỳ, Nhâ ̣t, Pháp, Colombia, Israel, Ai Câ ̣p, Trung Quốc, … Ss khác nhau giữa hai loài bọ phấn này là B. argentifolii ăn tạp, mắn đe hơn, gây rối loạn đô ̣c tố cho cây trồng. Theo Navot và cô ̣ng ss (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành mô ̣t vòng đhi khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiê ̣n thích hợp. Trung bình có khoảng 11 – 15 lứa/năm. Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiê ̣n khô và nóng, mưa nhiều làm giảm mâ ̣t đô ̣ bọ phấn, chúng thưhng chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều mát. Để tránh ánh sáng mă ̣t trhi bọ phấn núp vào mă ̣t dưới của lá, điều này phù hợp với phân bố chủ yếu ở khí hâ ̣u nhiê ̣t đới và câ ̣n nhiê ̣t đới. Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn. Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dân để hút dịch cây tư mạch phloem. Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Chúng hút dịch cây trong khoảng 15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 gih (thhi gian để virus nâng cao nồng đô ̣ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bê ̣nh, khoảng thhi gian để chúng truyền ngắn nhất là 15 phút (EPP̉/CABI, 1996). Thhi gian chích hút của bọ phấn dài hơn thhi gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thhi gian tiềm ẩn là 21 gih. Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng thành chúng có thể truyền nhiễm bê ̣nh virus theo hê ̣ thống và không truyền lại cho đhi sau. Có thể phát hiê ̣n thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọ phấn tư giai đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000). Triê ̣u chứng xuất hiê ̣n trên cây con khi bị xâm nhiễm tư 2 – 5 tuần. Virus không truyền qua chứng bọ phấn. Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci 2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones and Navas-Castillo, 2000).Các bệnh nguy hiểm tương ts là bệnh khảm lá sắn, bệnh cuốn lá bông (Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua. Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng. Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996). 2.2.11 Phòng chống Cho đến nay vân chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trư được trsc tiếp bê ̣nh do virus gây ra. Phòng trư begomovirus chủ yếu dsa vào 2 chiến lược chính là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh. - Phòng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thế giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mă ̣t quanh năm trên đồng ruô ̣ng. Đây là nguyên nhân khiến cho viê ̣c phòng trư bọ phấn gă ̣p nhiều khó khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đă ̣t bây dính bọ phấn theo dõi mă ̣t đô ̣ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Đô ̣) cho thấy: tư tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiê ̣t đô ̣ cao, cưhng đô ̣ ánh sáng lớn với ẩm đô ̣ trung bình tạo điều kiê ̣n cho bọ phấn sinh sôi nảy nở nhanh chóng nên mâ ̣t đô ̣ bọ phấn cao, tư tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều nên mâ ̣t đô ̣ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mâ ̣t đô ̣ bọ phấn khoảng tháng 11 đến tháng 1 năm sau. Tư đă ̣c điểm đó, nhiều kỹ thuật phòng trư bọ phấn được áp dụng tùy điều kiện: + Dùng giống kháng bọ phấn. + Dùng thuốc hóa học. + Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính. + Dùng bây hấp dân màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) . - Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhh 2 cơ chế: Tính kháng tư cây và tính kháng tư tác nhân gây bệnh (PRD). Những năm gần đây, cùng với tiến bô ̣ khoa học kĩ thuâ ̣t các nhà khoa học đã tạo ra các giống ớt có khả năng chống lại ss xâm nhiễm, tái tổ hợp của virus trong tế bào cây. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á (AVRDC) đã lai tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn Bemisia tabaci cũng như kháng bê ̣nh do begomovirus gây ra. Ở nước ta đang có ds án thí nghiê ̣m nghiên cứu tính kháng bê ̣nh virus (begomovirus) củ 34 giống ớt có nguồn gốc tư AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại Đồng Tháp bước đầu đã cho những kết quả rất khả quan, đây đều là các giống kháng chuyển gen dùng gen kháng tư cây. 2.3 Một số begomovirus hại cà chua Hiê ̣n nay có tới hơn 50 begomovirus phân lâ ̣p tư cà chua (có tư tomato ở đầu tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triê ̣u chứng giống nhau, điểm hình là cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đă ̣c biê ̣t ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiểm sớm còi cọc với tỷ lê ̣ đâ ̣u quả rất thấp. Danh tính virus gây bê ̣nh chỉ có thể biết được dsa vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000). Tại Viê ̣t Nam, bê ̣nh xoăn vàng lá được xem là bê ̣nh virus quan trọng nhất trên cà chua với tỉ lê ̣ nhiễm bê ̣nh trên các ruô ̣ng trồng cà chua thưhng rất cao, có khi tới 100%. Bê ̣nh đã được phát hiê ̣n thấy trên cà chua tư những năm 80. Mô ̣t số nghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thsc hiê ̣n trong thhi gian này nhưng bản chất thsc ss của virus vân chưa rõ. Gần đây dsa vào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiê ̣n gây ra bê ̣nh xoăn vàng lá cà chua ở Viê ̣t Nam. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Viê ̣t Nam virus (ToLCVNV) được phân phâ ̣p tư cây cà chua bị bê ̣nh xoăn vàng ngọn ở miền Bắc vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lâ ̣p đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiê ̣n trên cây cà chua ở Viê ̣t Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mâu Viê ̣t Nam là DQ169054, -55). Năm 2007, tư mô ̣t mâu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thu thâ ̣p tại Hà Nô ̣i, cùng với ToLCVV, mô ̣t loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lâ ̣p. Loài này được đă ̣t tên là Tomato yellow leaf curl Viê ̣t Nam virus (ToYLCKaV) (Hà et al., 2008). Trong số 3 virus trên có 2 virus được phân lâ ̣p trên mâu cà chua gây bê ̣nh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV. 2.4 Một số begomovirus hại ớt Theo (Green and Kim, 1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại trên ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiê ̣n thì có 12 loài gây hại trên ớt ở Châu Á Thái Bình Dương. Cho đến năm 2001 thì có đến 65 loài virus khác nhau đã được phát hiê ̣n trong đó có những loài thuô ̣c chi Begomovirus (AVRDC, 2001). Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triê ̣u chứng cuốn lá ớt trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl Virus (ChiLCV) gây ra. Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được phát hiê ̣n. Đã có hơn 9 loài virus thuô ̣c chi begomovirus gây hại trên các cây trồng khác ở Trung Quốc và Đài Loan Ở nước ta, tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được ss có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên hiện tại ở Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh virus hại ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng. Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm có: biến vàng, cuốn lá, khảm lá,...Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến dạng, bị cuốn mép. 2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng P̣CR Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cưhng, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vsc chẩn đoán bệnh virus. Ngoài các kỹ thuật chẩn đoán thông thưhng bằng mắt, chỉ thị, kháng nguyên- kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả chính xác và hiệu quả nhất. Trên thsc tế những loài tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1 họ sẽ gây ra những triệu chứng tương ts nhau, khó phân biệt. PCR giúp phân biệt chính xác đến loài nhh vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen. Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: