VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
Đề tài:
PHÁT HIỆN ĐỘT BIÉN GEN RB1 Ở TRẺ EM
UNG THU NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC
Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Giáo viên hướng dẫn
: TS. Nguyễn Hải Hà
Sinh viên thực hiện
: Nguyền Thị Thanh Hoa
Lớp
: 1202-K19CNSH
Hà Nội - 2016
LÒI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyền Hải Hà - Phó
Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen. người thầy - người
chị không chi hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những
khó khăn cùng em trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà
còn trong cuộc sống hàng ngày.Thái độlàm việc chuyên nghiệp của chị đã
truyền cám hứng cho em và giúp em cài thiện bản thân mình rất nhiều sau
thời gian thực tập này.
Em cũng xin giri lòng cám ơn đặc biệt đến Ths.Nguyễn Phương Nhung,
Ths.Ma Thị Huyền Thương và CN.Phạm Nhật Khôi đã luôn theo sát giúp đờ
và chỉ bảo em trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.Qua đây em cũng xin
cảm ơn tất cả các cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ
em rất nhiều trong suốt thời gian em thực tập tại đây. Để có được những hiếu
biết về kiến thức chuyên ngàph, em xip chân thành <|ám ơn các thầy cô giáo
trong khoa Công nghệ sinh học- Viện Đại học Mớ Hà Nội đã truyên đạt cho
em những kiến thức bổ ích trong suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những người thân trong gia
đình và bạn bè đã luôn ùng hộ, khích lệ và động viên tinh thần em trong suốt
thời gian thực tập tốt nghiệp đề hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 6 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Hoa
MỤC LỤC
M Ở ĐÀU................................................................................................................... 1
PHÀN I: TỐNG QUAN TÀI L IỆ U ...................................................................... 4
1.1.
Giới thiệu về ung thư nguyên bào võng mạc........................................ 4
1.1.1. Tinh hình nghiên cứu ung thư nguyên bào võng mạc trên
thế giới và ờ Việt Nam............................................................................4
1.1.2. Phân loại ung thư nguyên bào võng mạc..................................4
1.1.3.
Các yếu tố nguy cơ gây ung thư nguyên bào võng mạc..........5
1.1.4. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ung thư nguyên bào võng
mạc............................................................................................................5
1.1.5. Chẩn đoán................................................................................... 6
1.1.6. Điều trị.........................................................................................8
1.1.7. ÍPtí vấh đì tVutyậrt.L).sU.hQ.Q..MQj.'ỈÀ.iN.ộl............................. 10
1.2.
Cơ chế gây bệnh ung thư nguyên bào võng mạc................................. 11
1.2.1. Tái tổ họp trong nguyên phân (Mitotic Recombination).......13
1.2.2. Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong tổng họp
DNA (Gen Conversion)........................................................................ 13
1.2.3. Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể
(Nondisjunction).................................................................................... 14
1.3.
Giới thiệu gen R B 1................................................................................14
1.3.1. Tên gọi....................................................................................... 14
1.3.2. VỊ trí, đặc điểm ......................................................................... 15
1.3.3. Chức năng..................................................................................15
1.3.4. Những thay đổi trong gen RB1 liên quan đến tình trạng sức
khỏe
16
1.3.5. Cơ chế gây bệnh của gen R B I ............................................... 16
1.4.
Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sứ dụng nhằm
xác định đột biến gen RB1 trên thế giới và Việt Nam.....................................17
1.4.1. Phương pháp kết hợp giữa PCR và giãi trình tự gen.............. 17
1.4.2. Phương pháp kết hợp giữa multiplex PCR định lượng và
giải trình tự............................................................................................. 17
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp biến tính (DHPLC) với
multiplex PCR định lượng cho các đoạn huỳnh quang ngấn
(QMPSF).................................................................................................18
1.4.4. Phương pháp PCR-RFLP với multiplex PCR định lượng và
giải trình tự gen...................................................................................... 18
1.4.5.
Phương pháp phân tích và giái trình tự m RNA.....................19
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ...................... 20
2.1.
Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Vật liệu nghiên cứu...'.........:.......'...........................
20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................20
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị..............................................................20
2.1.3. Hóa chất.....................................................................................20
2.2.
Phương pháp nghiên c ứ u ......................................................................21
2.2.1. Quy trình lấy m ẫu.................................................................... 22
2.2.2. Quy trình tách chiết genomic DNA........................................ 22
2.2.3. Kỹ thuật điện di trên gel agarose.............................................23
2.2.4. Thiết kế mồi cho PCR và sequencing......................................24
2.2.5. Quy trình thực hiện PCR..........................................................27
2.2.6. Quy trình thực hiện giải trình tự gen ...................................... 29
2.2.7. Phương pháp phân tích kết quà............................................... 31
PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 32
3.1.
Thu mẫu nghiên cứu............................................................................ 32
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân.........................................32
3.2.
Tách chiết DNA tồng s ố ..................................................................... 32
3.3.
PCR nhân các đoạn gen RB1...............................................................35
3.4.
Giải trình tự gen.....................................................................................36
3.4.1. Kết quá tinh sạch.......................................................................36
3.4.2. Kết quá giải trình tự .................................................................36
3.5.
Phân tích kết quả....................................................................................38
3.5.1. Phân tích biến đối gen.............................................................. 38
3.5.2. Phân tích mối tương quan kiểu gen-kiểu hình.......................46
KÉT LUẬN............................................................................................................. 49
KIẾN NGHI
Thư viện Viện Đai học Mở Hà Nội
50
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................50
DANH MỤC CÁC TỦ VIÉT TẤT
UTNBVM
Ung thư nguyên bào võng mạc
DNA
Deoxyribonucleic acid
RNA
Ribonucleic acid
cDNA
Complement deoxyribonucleic acid
rnRNA
Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin
bp
Base pair
dNTPS
Deoxyribonucleotide Triphosphate
PCR
Polymerase chain reaction
Taq
Thermus aquaticus
uv
Ultra violet
TAE
Thirviên.yiên
DaLhoc Mở Hà Nôi
Tris-axit axetic-EDTA
QM-PCR
Quantitative Mutiplex Polymerase chain reaction
DHPLC
Denaturing High Performance Liquid Chromatography
QMPSF
Quantitative multiplex Polymerase chain reaction of short
fluorescent fragments
PCR-RFLP
Polymerase chain reaction- Restriction Fragment Length
Polymorphism
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, HÌNH ẢNH
Bảng 1: Hướng dẫn pha dung dịch TAE 50X .................................................. 23
Bảng 2: Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR........................................... 27
Báng 3: Tóm tắt tình trạn» bệnh cùa đối tượng nshiên cứ u ...........................32
Bàng 4: Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tồng số mẫu bệnh nhi và bố mẹ
bệnh nhi................................................................................................................34
Hình 1: Hình ánh siêu âmcùa UTNB V M ........................................................... 7
Hình 2: Hình ánh chụp cắt lóp vi tính cùa UTNBVM.......................................7
Hình 3: Soi đáy mát trước điều...........................................................................10
trị hóa chất giảm tế bào..................................................................................... 10
Hình 4: Soi đáy mát sau điều trị hóa chất giảm tế bào..................................... 10
Hình 5: Giải thích về mặt di truyền đột biến mất chứcnăng gen Rb................ 12
Hình 6: Tái tổ hợp'trong nguyên
13
Hình 7: Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong sao chép DNA .. 14
Hình 8: Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể trong nguyên phân ....... 14
Hình 9: Vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13 ..............................................15
Hình 10: cấu trúc gen và protein RB1............................................................... 15
Hình 11: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu
máu bệnh nhân và gia đình.................................................................................33
Hình 12: Ảnh minh hoạ kết quả đo quang phổ DNAtổng số..........................35
Hình 13: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩmPCR của mẫu KVM 35............36
Hình 14: Ánh minh hoạ kết quả giải trình t ự .................................................. 37
Hình 15: Ket quà so sánh trình tự vùng điều khiền gen và vùng mã hoá gen
RBJ của 2 mẫu UTNBVM với trình tự chuẩn. ATG: mã khởi đầu; K là G
hoặc T; M là T hoặc C; TGA: mã kết thúc.......................................................44
Hình 16: Ket quả dự đoán chức năng của đột biến 470 I > L ..........................44
Hình 17: Đột biến có ý nghĩa lâm sàng của RBI phát hiện ở mẫu KVM 35.
(A) Đột biến thay thế nucleotide T thành G tại vị trí 1494 (1494T>G) trên 1
alen cùa gen RBÌ phát hiện bằng phưong pháp giải trình tự Sanger chiều đọc
ngược. (B) Hậu quà của đột biến 1494T>G tạo mã kết thúc tại codon 498. (*)
mã kết thúc..........................................................................................................46
Thư viên Viên Đai hoc Mở Hà Nôi
MỞ ĐẦU
Ung thư nguyên bào võng mạc(retinoblastoma, UTNBVM) là bệnh u
ác tính mắt thường gặp ở trẻ cmdưới 5 tuổi. UTNBVM xuất hiện với tý lệ
khoảng 1/200000 ở Mỹ[3]và ở nhiều khu vực trên thế giới. Bệnh xày ra cân
bằng ờ cà hai giới tính nam và nữ, không phụ thuộc nguồn gốc, chủng tộc.
UTNBVM có thể xuất hiện ờ dạng di truyền(~40%) hoặc không di
truyền(~60) [4].Dạng di truyền thường xảy ra ờ hai mắt và nhiều khối u trong
khi dạng không di truyền chi xảy ra ở một mắt và một khối u. Cả 2 dạng này
của UTNBVM đều liên quan đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp
chế khối u RB1 (retinoblastoma 1) nằm trên nhiễm sắc thể số 13. Dạng di
truyền do một alen của RBÌ bị bất hoạt có nguồn gốc từ dòng mầm (germline)
và một alen bị bất hoạt sinh dưỡng|5,13,14|. RB1 protein có vai trò quan
trọng đối với sự điều khiển chu kỳ tế bào và quá trình biệt hóa tế bào, tham
gia vào sự chuyển pha Gl/S bằng cách ức chế yếu tố phiên mã E2F cần thiết
cho sự khới đầu của pha S.Sự bất hoạt qùa RB1 có tác động lớn nhất đến một
quần thể nhỏ các tế bào tiền thân cùa tế bào nón trong quá trình phát triển
võng mạc.Sự biếu hiện cao cùa RB trong nhóm tế bào này chứng tò nó có vai
trò rất lớn trong việc hạn chế phân chia và tăng sinh tế bào[7|.
GenRB1 nằm tạivị trí 13ql4.2gồm 27 exon và 26 intron.Cho đến nay,
hơn 900 đột biến đã được phát hiện trên gcnRBÌ ở các bệnh nhân UTNBVM
[8].Các phương pháp tiếp cận kết hợp giữa multiplex PCR định lượng và giải
trình tự, sắc ký lỏng cao áp biến tính (DHPLC) với multiplex PCR định lượng
cho các đoạn huỳnh quang ngắn (QMPSF) hay PCR-RFLP với multiplex
PCR định lượng và giải trình tự gen cho phép phát hiện được các đột biến tái
phát, các mất đoạn/thêm đoạn lớnvà các đột biến điềm trên vùng promoter,
trên các exon và cả vùng nối intron-exon của genRBJ[6,9,10,49].Việc xác
định đột biến genRB1 trên các bệnh nhân UTNBVM và gia dinh mang lại các
thông tin cần thiết đề thực hiện điều trị hiệu quả và bảo tồn thị lực cho bệnh
1
nhân. Ngoài ra, đây cũng là cơ sở đê Ihực hiện tư vấn di truyền cho người
thân các bệnh nhân.
Hàng năm ờ bệnh viện Mắt trung ương phát hiện khoáng 40 ca ung thư
võng mạc mới.Phần lớn các bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ
cơ hội điều trị bảo tồn mắt.Trong số đó, nhiều bệnh nhân được sinh ra trong
các gia đình có tiền sử bệnh UTNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di
truyền đối với khả năng sinh bệnh. Năm 2005 Nguyền Công Kiệt và Nguyễn
Trí Dũng đã nghiên cứu đặc điểm di truyền trên 30 ca ung thư võng mạc ờ
Việt Nam. Tuy nhiên, do nhữn» hạn chế về phương pháp nghiên cứu, các tác
giả mới chi xác định được một trường hợp bệnh nhân có mất đoạn ờ vị trí
NST 13ql4[2].Năm 2014, Nguyễn Hải Hà và cộng sự đã xây dựng hoàn thiện
quv trình giãi trình vùng promoter, vùng nối intron-exon và các exon của gen
RBI và phát hiện ra hai đột biến di truyền gây bệnh trên hai bệnh nhi trong đó
có một đột biến hoàn toàn chưa dược công bố[l l].Cho đến nay, việc điều trị
cho bệnh nhân ung thứ võng mậc ơ gíâỉ đổạií sớm đã được thực hiện khá hiệu
quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử và nguyên nhân di
truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tư vấn di truyền hầu
như chưa được thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho gia đình
bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có người mắc bệnh như cha/mẹ hay
anh/chị em ruột..
Do nhu cầu thực tiền của bệnh nhân UTNBVM, khóa luận: “Phát hiện đột
biến genRB1 ờ trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc” được tiến hành với
nội dung nahiên cứu như sau:
1. Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UTNBVM ở Bệnh viện Mắt
trung ương, và người thân trong gia đình như mẫu bố/mẹ, anh chị em
ruột (nếu có).
2
2. Sử dụng kỹ thuật PCR đế nhân các đoạn gen R BI, giái trình tự chuồi
DNA tại vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang
mã củagcn RBI.
3. Phân tích kết quả giái trình tự nhàm phát hiện đột bien gen ờ bệnh nhân
UTNBVM tại Việt Nam.
>
Mục tiêu của đề tài: Phát hiện đột biến di truyền gây bệnh trên gen RBI
ờ trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc.
>
Ý nghĩa của đề tài: Kết quả thu được có thế làm sáng tỏ nguyên nhân
gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn đoán, chữa
trị và tư vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình người bệnh
UTNBVM.
Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
3
PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Giói thiệu về ung thư nguyên bào võng mạc
1.1.1. Tình hình ung thư nguyên bào võng mạctrên thế giói và ỏ- Việt
Nam
Ung thư ờ trẻ em chiếm tỷ lộ 1-2% trên tổng số các ca ung thư.Một
trong số các ung thư trẻ em phải kể đến là UTNBVM.Ở Mỹ và các nước Bắc
Âu, tỷ lệ bệnh khoảng 1/15000 đến 1/16600 trẻ được sinh ra.Theo Cuộc điều
tra ung thư Quốc gia lần thứ 3 (1969-1971), ờ Mỹ tỷ lệ mắc trung bình là 11
trường hợp mới trên 1 triệu trẻ dưới 5 tuổi.
Ở Việt Nam, chưa có sổ liệu đầy đủ về tý lệ mắc bệnh hàng nãm.Theo
ghi nhận của GS.Nguyền Chấn Hùng (từ năm 1995 đến năm 1997) UTNBVM
đứng hàng thứ 4 ở trẻ em dưới 15 tuổi, số lượng bệnh nhân tại Bệnh viện Mắt
có chiều hướng gia tăng.Một thống kê từ năm 1990 đến năm 1998 trung bình
có 27 trường hợp/năm.Một ghi nhận khác từtháng9/1999 đến 9/2001 có 84
trường hợp, trung bình 42 trường hợp/năm.Đen năm 2006, theo thống kê
Bệnh viện Mắt, con số trẻ em bị UTNBVM là 89, tăng gấp 2 lần so với năm
2001.Theo nghiên cứu cùa thạc sỹ Phạm Thị Việt Hương, tại bệnh viện K tuối
bị bệnh trung bình là 11,6 tháng, tối thiếu phát hiện bệnh ngay sinh ra, tối đa
gặp 50 tháng tuồi.Tuồi trung bình lúc chẩn đoán là 18,3 thángl 1].
1.1.2. Phân loại ung thư nguyên bào võng mạc
Bệnh này có 2 loại:
Loại 1 (sporadic retinoblastoma): xuất hiện ở trẻ em trong gia đình
không có tiền sứ bị bệnh, khối u thường chỉ xuất hiện trong 1 mắt thường
được chừa khói bằng phương pháp phẫu thuật cắt bỏ khối u và không có nguy
cơ bị ung thư ở những nơi khác trên cơ thế[ 13,27,42,51 ].
4
Loại 2 (familial retinoblastoma):xuất hiện ở trẻ em trong gia đình có
tiền sử bị bệnh, khối u xuất hiện trên cả hai mắt và sau phẫu thuật cắt bỏ vẫn
có nguy cơ bị một số bệnh ung thư khác[ 13,27,42].
1.1.3. Các yếu tố nguv cơ gây ung thu' nguy ên bào võng mạc.
Các yếu tố nguy cơ liên quan đến lối sống, như trọng lượng cơ thể, hoạt
động thê chất, chế độ ăn uống,tiếp xúc với hóa chất độc hại tại nơi làm việc
và sử dụng thuốc lá được xem là có vai trò quan trọng đối với bệnh ung thư
nói chung.Tuy nhiên, những yếu tố này thường mất nhiều năm đe ảnh hưởng
tới nguy cơ mắc ung thư,vì vậy nó thường không được xem là đóng nhiều vai
trò trong UTNBVM[17].CÓ rất ít các yếu tố nguy cơ được biết đến gây ành
hưởng tới ung thư nguyên bào võng mạc.Trong đó có 2 yếu tố sau đóng vai
trò quan trọng:
* Tuổi: Hầu hết trẻ em được chấn đoán bị UTNBVM là ít hơn 3
tuỗi.UTNBVM hiếm ở .trẻ trượng thành và người lớnL17h,
* Di truyền: Khoảng 1/3 UTNBVM gây ra bời đột biến trên gen RBI
được di truyền từ bố mẹ.Hầu hểt số còn lại xảy ra là do một genRB1 ngẫu
nhiên bị đột biến và chỉ xảy ra trong một tế bào của một mắt. Đột biến này
không di truyền từ bố mẹ và những đứa con của chúng sau này không có nguy
cơ cao bị UTNBVM [17],
1.1.4. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ung thư nguyên bào võng mạc.
Các biểu hiện lâm sàng thường gặp ờ UTNBVM:
* Đồng tử trắng: 56% trường hợp bệnh được phát hiện nhờ dấu hiệu
này.Cha mẹ và người thân thường mô tả nó bằng nhiều từ khác nhau như
"mat mèo", "mắt thú", "mắt có ánh sáng lập lòe", "mắt có ánh sáng lấp lánh,
rực rỡ".Khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào ban đêm
hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cùng có thể thấy 1 hoặc 2 đồng
5
tử
màu
trắng
hay
vàng
khi
chụp
ảnh
buổi
tối
có
dùng đèn
flash[l,13,26,27,38].
* Lé: 34% trường hợp bệnh được phát hiện nhờ dấu hiệu này.Đặc biệt,
nếu
bé
bị
lé
trong
vòng
6
tháng
tuổi
thì
nên
nghi
ngờ có
UTNB VM[1,13,26,38].
* Thị lực kém: 8% trường hợp bệnh được phát hiện vì có dấu hiệu
này[ 1,13,26,38],
* Ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các triệu chứng khác như: Mắt
đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ. lồi mất, viêm tồ chức quanh
hốc mát, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mong mất dị sắc, tăng nhãn áp, trẻ
chậm phát triển...[1,13,38].
1.1.5. Chẩn đoán
* Chẩn đoán lâm sàng.
XVnr viôn Viôn F)íri hnr Mnr Hà N™
Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng đế chẩn đoán bệnh. Tổn
thương ở võng mạc có biếu hiện khác nhau tùy theo hướng phát triển của
u.Các phương pháp chẩn đoán hình ánh giúp xác định chẩn đoán. Khám siêu
âm và chụp cắt lớp có thế thấy rõ kích thước và vị trí khối u hoặc thấy hình
ảnh canxi hóa trong khối u - dấu hiệu đặc trưng của UTNBVM. Ngoài ra còn
có thể xác định sự phát triền của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội
sọ[ 13,27], Chụp MRI cho phép khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và
não[ 12,16,271. Chụpxương có thế giúp nhận biết nếu UTNBVM đã lan đến
xương sọ hoặc các xương khác.Hầu hết trẻ em bị UTNBVMkhông cần phải
tiến hành chụp xương. Nó thường chì sử dụna khi bị nghingờ rằng UTNBVM
có thề đã lan rộng ra khỏi mất[ 17],
6
Hình 1: Hình ảnh siêu âmcủa
Hình 2: Hình ảnh chụp cắt lóp vi
UTNBVM[1].
tính của UTNBVM[1].
* Kiểm tra mô bệnh học và phân tích nhiễm sắc the
Mô bệnh học. Chẩn đoán UTNBVM có thể được xác định bằng kiểm
tra mô bệnh học. Kiểm tra cẩn thận các dây thần kinh thị giác là cần thiết để
xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối uf 13].
Phân tích nhiễm sắc thế. Phân tích di truyền học tế bào lympho máu
ngoại vi được sử dụng đề phát hiện mất đoạn hay sắp xếp lại liên quan đến
13ql4.1-I4q2, tìm thấy trên khoảng 5% các trường hợp bị UTNBVM một bên
mắt và khoảng 7.5% các trường hợp bị cà hai bên mắt[ 13].
* Kiểm tra di truyền phân tử
Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triền UTNBVM là rất quan trọng
đế bảo tồn cuộc sống và thị lực.Vì vậy, khá năng bảo tồn phụ thuộc vào việc
chẩn đoán sớm [22],Xét nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan trọng
của việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UTNBVM./?/?/ là gen duy nhất
mà đột biến gây UTNBVM được xác định vào năm 1986[ 13,23,41 ].Phần lớn
các dột biến RB1 là riêng cho từng gia đình, và được phân bố khắp các
genRB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã hóa exon, và khu vực nối của
intron [24,25,53],
* Chẩn đoán phân biệt
Cần phân biệt UTNBVM với một số bộnhkhác về mắt ở trẻ em cũng có
dấu hiệu đồng tử trắng:
Bệnh Coats, những biến đôi mạch máu (giãn mạch) ờ ngoại vi võng
mạc, dịch dưới võng mạc nhiều, không có can xi, thường ờ hai mắt, không có
yếu tố di truyền.
Bệnh võng mạc trẻ đẻ non: gặp ở trẻ đè non có cân nặng khi sinh thấp
và được điều trị bố xung oxy.Tăng sinh xơ mạch và bong võng mạc làm cho
đồng tử có màu trắng.
Viêm màng bồ dào bẩm sinh: thường có dính bờ đồng tử. có thề kèm
theo đục thề thủy tinh.
Đục thể thủy tinh bấm sinh: đục ngay sau mon g mắt, có thể kèm theo
lác, rung giật nhãn cầu.
Bệnh giun toxocara: có hình ánh một u hạt trong võng mạc hoặc viêm
nội nhãn, các dái xơ co kéo trong dịch kính có thế gây bong võng mạc Ị1].
1.1.6. Điều trị
Mục tiêu đầu tiên cùa điều trịlà đảm bảo tính mạng của người bệnh và
sau đó là thị lực.Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa
chọn phương pháp điều trị dựa trên nhiều yểu tố bao gồm: số lượng các ồ
khối u (bị 1 bên và chi có 1 khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai
bên mát), vị trí và kích thước khối u trong mắt,có gieo mầm vào pha lê thể và
dưới võng mạc hay không, khả năng bảo tôn thị lực và tuổi bệnh nhân[l].Các
phương pháp được sử dụng trong điều trị UTNBVM bao gồm:
* Phẫu thuật khoét bỏ nhãn cầu
Thường chi định khi khối u lớn (hơn 60% thế tích nhãn cầu) không còn
thị lực, mù, mắt đau và/hoặc khối u xâm lấn vào thần kinh thị.Người ta hay
khoét bó nhãn cầu hơn cho những mắt đã thất bại với các phương pháp điều
trị bão tồn trước đó.Ngoài ra, khoét bò nhãn cầu được chi định cho trường
hợp tăng nhãn áp thứ phát, gieo mầm vào thủy tinh, hoặc xâm lấn ra tiền
phòng[ 1,29,40].
8
* Lạnh dông
Chi định cho khối u nhỏ cho những u nhỏ(< 6 mm đường kính và < 3
mm độ dày) và ờ phía trước.Biến chứng cũaphương pháp này gồm bong võng
mạc tơ huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc
và xơ hóa tiền võng mạc 11,27,201.
* Quang dông
Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chi dinh cho u nhỏ và ớ
phía sau.Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của laser Argon đế
phá hủy mạch máu nuôi dường tế bào khối u [1,27,29].
* Tia xạ
Tia xạ với nguồn tia từ ngoài vào (External beam radiotherapy viết tát
EBRT) là phương pháp điều trị bão tồn nhãn cầu đầu tiên trong
UTNBVM.Tia xạ có thế chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào
thủy tinh, các khối ử gần dây thẫn kínti'thị trong mắt có khả năng còn thị lực
hoặc nhiều khối u mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phương
pháp lạnh hoặc quana đông [1,27,29,40].
* Điều trị bằng các tấm có hoạt tính phóng xạ
Liệu pháp tia phóng xạ để gần (I - 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt tính
phóng xạ áp vào thành mắt ờ góc của khối u, có thể áp dụng như là phương pháp
điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu thuật.Tuy nhiên, không phải là tất cả các
bệnh nhân đều được điều trị bằng phương pháp này [ 1,27,29].
* Liệu pháp hóa học
UNBVM là một bệnh ác tính nhạy cảm với hóa chất.Hóa chất có hoạt
tính nhất như carboplatin, vincristin, có hoặc không có etoposide.
9
Hóa chất giám tế bào:Do hầu hết bệnh nhân có khối u lớn tại thời điềm
chẩn đoán nên người ta sử dụng hóa chất giảm tế bào đề giảm kích thước khối
u, giúp tăng hiệu quà của các phương pháp điều trị tại chỗ.Hóa chất giảm tế
bào trở thành một phần quan trọng trong điều trị ban đầu UTNBVM và làm
tăng khá năng bão tồn nhãn cầu.Hóa chất giảm tế bào còn nhằm chống lại sự
phát triền của UTNBVM ba bên [1,28,20.30].
Hình 3: Soi đáy mắt trưócđiều
Hình 4: Soi đáy mắt sauđiều trị
ril
trịhóa chât giảm tê bào[l].
hóa chất giăm tế bào[l].
h
.
. X .
...
.X . V
Các phương pháp điều trị trong tương lai: Đang được thử nghiệm và
nghiên cứu là nhiệt lạnh “qua đồng tử”, hóa chất liều cao kết hợp cấy ghép tể
bào gốc cho những trường hợp UNBVM ngoại nhãn, truyền hóa chất động
mạch mắt [1,15], sử dụng topotccan, tiêm hóa chất nội tủy, điều trị gen[l].
1.1.7. Tư vấn di truyền
Có đến 90% trẻ bị UTNBVM là con đầu trong gia đình từng bị ung thư
võng mạc.Khi UTNBVMtruyền từ bố mẹ sang con thì thường là bị cả 2
bên.Nếu bố mẹ bị cả hai mắt nguy cơ mà đứa trẻ được họ sinh ra bị
UTNBVM là 45%.Phần lớn trẻ có bố mẹ bị ung thư cả hai bên khi sinh ra
cũng bị cả hai bên (chỉ có 15% là bị 1 bên mắt).Nếu bố mẹ bị một bên, tỷ lệ 715% là con cái của họ bị UTNBVM.Điều đặc biệt là bố mẹ bị một bên mắt
sinh ra trẻ bị UTNBVM thì có tới 85% trường hợp trẻ này bị bệnh cá hai bôn
mắt.
Trường hợp bố mẹ mang genUTNBVM nhưng không có biểu hiện lâm
sàng thì có tới 45% trẻ do họ sinh ra bị bệnh.Điều đó giãi thích tại sao bố mẹ
không bị UTNBVM trên lâm sàng mà nhiều đứa trẻ họ sinh ravẫn bị
UTNBVM cả hai mắt.Neu cả bố và mẹ có gen bình thường tỷ lệ trẽ sinh ra có
nguy cơ u UTNBVM là 1/15.000-1/20.000 [1],
1.2.
Cơ chế gây bệnh ung thư nguyên bào võng mạc.
Dựa vào những biểu hiện lâm sàng của UTNBVM, người ra đưa ra các
giả thuyết về cơ chế phân tử của bệnh: chịu trách nhiệm cho sự hình thành
khối u là gen/?/?/.Protein RB (pRB) tác động vào chu kỳ tế bào.Khi gắn với
yếu tố phiên mã E2F. pRB ức chế sự sinh sàn tế bào.Khi không có pRB, các
phôi bào sinh sàn bất tận dẫn đến bệnh ung thư.Hoạt động tương tác giữa pRB
và E2Fđược điều hòa bời các yếu tố như cyclin D l,
cdk4 và
pl6[2,31,32,33,34].Một alenhoạt động của /?/?/ cũng có khả năng ngăn chặn
sinh ung thư.Vì vậy, UTNBVM là một trong các loại bệnh ung thư ở người
hình thành do có đột biến mất chức năng ờ o gen, được gọi là gen ung thư tính
lặn[2].Sự chuyển dạng ác tính cùa các tế bào võng mạc xảy ra khi câ 2 alen
của gen/?/?/bị đột biến mất chức năng.
Phát hiện này củng cố giả thuyết “two hít” của Knudson, cho
rằngUTNBVM hình thành cần có hai cú hích gây tôn thương di truyềndần 1
(đột biến dòng) đột biến xảy ra trên các exon của gen/?/?/, lần 2 (đột biến thế
soma) làm sai lệch sinh sản tế bào dẫn đến sự hình thành khối
u[2,19,20,35,42|. Cơ chế bệnh sinh này được giải thích tốt nhất bàng việc
khảo sát sự di truyền của UTNBVM. Các tế bào sinh dục có 2 alen: 1 alen
bình thường (alen kháng ung thư) và I alen bệnh.Alen bệnh có ý nghĩa là cú
hích 1 theo thuyết Knudson.Alcn thứ 2 bình thường có vai trò kiềm chế sự
sinh u.Sau đó đột biến xảy ra cho alen bình thường và ức chế hoạt động cùa
nó, tạo ra cú hích thứ 2 dẫn đến sự hình thành UTNBVM.
11
Với bệnh nhân mà gia đình không có tiền sử bệnh: ngay tại hợp tử
không mang gen/?/Một biến, tế bào cần trải qua hai sự kiện đột biến tế bào
soma trên 2 alen của cùng một gen RBI[\,2] ].Đoi với bệnh nhân mà gia đình
có tiền sử gày bệnh, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một
gen RB đột biến, chi cần trải qua một sự kiện đột biến trên tế bào soma là có
khâ năng gây nên kiều hình ung thư.Bất kế các đột biến ban đầu là do di
truyền hay do phát sinh trên tế bào soma, các tế bào võng mạc chi trở thành ác
tính khi bị mất bản sao bình thường còn lại của RB1 .Mất alen/?Â7 chức năng
thứ hai có thề là do một đột biển soma riêng biệt (-30% các khối
1993.]), hyperméthylation (tỷ lệ nhò các khối
U
U
IKato et al
[Greger et al 1994; Ohtani-
Fujita et al 1997]), hoặc mất trạng thái dị hợp tử (-70% các khối u).Mất trạng
thái dị họp xảy ra do tái tồ hcrp trong nguyên phân bào, phân bất thường cùa
nhiễm sắc thề, hoặc mất đoạn lớn[5].
UTNBVM du di liu.Gu
Uli bin
*“ ■
ÍÊ
Bi’nil
UTNBVM ugỈM nkiẻu
MỘI turn
Hình 5: Giải thích về mặt di truyền đột biến mất chức năng genRb [31].
Từ đó, người ta đưa ra một số giả thuyết gây nên hiện tượng đột biến
trên Rb gồm: Tái tổ họp trong nguyên phân (mitotic recombination), hoạt
động bất thường của DNA polymerase trong tổng hợp DNA (gen conversion)
và sự phân chia bất thường của nhiễm sac the (nondisjunction) [31 ]
- Xem thêm -