Tài liệu Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai msh2 từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Mai PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2 TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Mai PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2 TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình Bảng ký hiệu các chữ viết tắt Lời nói đầu ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Những nét khái quát về ung thƣ, bệnh ung thƣ và gen ung thƣ ... 3 1.1.1. Ung thư và bệnh ung thư............................................................. 3 1.1.2. Gen ung thư (oncogene) .............................................................. 4 1.2. Những hiểu biết về ung thƣ đại trực tràng ...................................... 5 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ung thư đại trực tràng .................................. 5 1.2.2. Sơ lược về bệnh ung thư đai trực tràng....................................... 6 1.2.3. Cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng di truyền .................. 12 1.3. Hệ thống gen MMR và đột biến gen MSH2 với hội chứng ung thƣ đại trực tràng ...................................................................... 17 1.3.1. Hệ thống gen MMR .................................................................. 17 1.3.2. Gen MSH2 và đột biến gây ung thư đại trực tràng ................... 21 1.4. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng .................................................................................... 24 1.4.1. Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR................ 25 1.4.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn RFLP........... 25 1.4.3. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn SSCP ................................. 26 1.4.4. Kỹ thuật phân tích sợi đôi dị hợp HET ..................................... 27 1.4.5. Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính DGGE ......................... 28 1.4.6. Các phương pháp giải trình tự ADN ......................................... 28 1.5. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ................................................... 29 1.5.1. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................. 29 1.5.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................. 29 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 30 2.1. Vật liệu, địa điểm, hoá chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu30 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................... 30 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................. 30 2.1.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................... 30 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................. 31 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu ........................................................ 31 2.2.2. Tách ADN tổng số .................................................................... 31 2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số .................. 31 2.2.4. Nhân bản các exon nhờ phản ứng PCR .................................... 32 2.2.5. Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gây ung thư đại trực tràng ............................................................................................................. 34 2.2.6. Giải trình tự ADN ..................................................................... 37 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số...................................................... 39 3.2. Kết quả nhân bản 09 exon gen MSH2 ............................................ 40 3.2.1. Kết quả nhân bản exon 2 ........................................................... 40 3.2.2. Kết quả nhân bản exon 3 ........................................................... 41 3.2.3. Kết quả nhân bản exon 6 ........................................................... 42 3.2.4. Kết quả nhân bản exon 7 ........................................................... 43 3.2.5. Kết quả nhân bản exon 8 ........................................................... 44 3.2.6. Kết quả nhân bản exon 12 ......................................................... 45 3.2.7. Kết quả nhân bản exon 13 ......................................................... 46 3.2.8. Kết quả nhân bản exon 14 ......................................................... 47 3.2.9. Kết quả nhân bản exon 15 ......................................................... 48 3.3. Kết quả phân tích đột biến trên 09 exon gen MSH2 ..................... 50 3.3.1. Kết quả phân tích đột biến exon 2 ............................................ 51 3.3.2. Kết quả phân tích đột biến exon 3 ............................................ 53 3.3.3. Kết quả phân tích đột biến exon 6 ............................................ 55 3.3.4. Kết quả phân tích đột biến exon 7 ............................................ 56 3.3.5. Kết quả phân tích đột biến exon 8 ............................................ 57 3.3.6. Kết quả phân tích đột biến exon 12 .......................................... 59 3.3.7. Kết quả phân tích đột biến exon 13 .......................................... 60 3.3.8. Kết quả phân tích đột biến exon 14 .......................................... 61 3.3.9. Kết quả phân tích đột biến exon 15 .......................................... 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 66 Kết luận .................................................................................................... 66 Kiến nghị .................................................................................................. 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68 Tài liệu tiếng Việt .................................................................................... 68 Tài liệu tiếng Anh.................................................................................... 68 Các trang Web ........................................................................................ 72 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và Amsterdam II trong chẩn đoán lâm sàng HNPCC Bảng 3: Các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng Bảng 4: Tỷ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 Bảng 5: Nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen liên quan đến HNPCC so với các cá thể bình thường Bảng 6: Trình tự các cặp mồi dùng để nhân bản 09 exon quan tâm Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR Bảng 8: Tỷ lệ các thành phần của PAGE 12% trong kỹ thuật SSCP Bảng 9: Quy trình nhuộm bạc và thành phần các dung dịch nhuộm Bảng 10: Kết quả tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản các exon nghiên cứu DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Sơ đồ cấu tạo ruột kết và sự hình thành polyp bên trong Hình 2: Cơ chế MMR ở E. Coli Hình 3: Cơ chế MMR ở người Hình 4: Sơ đồ cấu tạo NST số 2 và vị trí gen MSH2 Hình 5: Vị trí gen MSH2 trên NST số 2 Hình 6: Sơ đồ gen MSH2 Hình 7: Sơ đồ các phần của phân tử protein được mã hóa bởi gen MSH2 Hình 8: Tỷ lệ các dạng đột biến thường gặp trên gen MSH2 Hình 9: Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gen MSH2 Hình 10: Kết quả tách chiết ADN tổng số Hình 11: Kết quả nhân bản exon 2 Hình 12: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 3 Hình 13: Kết quả nhân bản exon 6 Hình 14: Kết quả nhân bản exon 7 Hình 15: Kết quả nhân bản exon 8 Hình 16: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 12 Hình 17: Kết quả nhân bản exon 13 Hình 18: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 14 Hình 19: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 15 DANH MỤC CÁC HÌNH (tiếp theo) Hình 20: Kết quả SSCP exon 2 Hình 21: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 35 so với đối chứng exon 2 Hình 22: Kết quả giải trình tự mẫu số 35 exon 2 Hình 23: Kết quả SSCP exon 3 Hình 24: Kết quả giải trình tự mẫu 14 exon 3 Hình 25: Kết quả SSCP exon 6 Hình 26: Kết quả SSCP exon 7 Hình 27: Kết quả SSCP exon 8 Hình 28: Mô hình điện di sai khác của các mẫu 31, 34, 36 exon 8 Hình 29: Kết quả SSCP exon 12 Hình 30: Kết quả SSCP exon 13 Hình 31: Kết quả SSCP exon 14 Hình 32: Kết quả SSCP exon 15 Hình 33: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 19 exon 15 Hình 34: Kết quả giải trình tự mẫu 19 exon 15 gen MSH2 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Deoxiribonucleic Acid Axit deoxiribonucleic APS Amonipersulphate Amonipersulphate ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic bp Base paire Cặp bazơ CRC Colorectal Cancer Ung thư đại trực tràng DGGE Denaturing Gradient Gel Điện di gel Gradient biến tính Electrophoresis dNTP Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotide triphosphate triphosphate FAP Adenomatous Polyp tuyến theo dòng họ Familial Polyposis HET Heteroduplex Analysis HNPCC Hereditary Phân tích sợi kép dị hợp Non-polyposis Ung thư ruột kết không polyp di Colorectal Cancer truyền HPV Human Papilloma Virus Virut gây ung thư cổ tử cung ở người IHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dịch Kb Kilobase 1000 bazơ nitơ LOH Loss of Heterozygosity Mất tính dị hợp tử MMR Mismatch Repair Sửa chữa bắt cặp sai MSI Microsatellite Instability Bất ổn vi vệ tinh MSH2 MutS Homolog 2 Gen MSH2 Nhiễm sắc thể NST NCBI OD260/280 National Center for Trung tâm quốc gia về thông tin Biotechnology Information công nghệ sinh học (Mỹ) Optical Density Đo mật độ quang phổ ở bước sóng 260 và 280nm PAGE Gel Điện di trên gel polyacrylamide Polyacrylamide Electrophoresis PCR Polymerase Chain Reaction SSCP Single Strand Phản ứng chuỗi trùng hợp Conformation Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn Polymorphisms Trình tự lặp lại đơn giản SSR Simple Sequence Repeats RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài các đoạn cắt giới Polymorphism hạn Transcription- Kỹ thuật PCR phiên mã ngược Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse TAE Tris-Acetic acid-EDTA Đệm điện di TAE TEMED N,N,N’,N’- Tetramethylenediamine tetramethylenediamine WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân LỜI NÓI ĐẦU Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mới mắc ung thư. Cũng theo tổ chức này cho biết, mỗi năm có khoảng 6,7 triệu người chết do ung thư. Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong tổng số các nguyên nhân gây tử vong ở người. Các loại ung thư hàng đầu được tổng kết ở nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; ở nữ giới là ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi [30]. Trong hơn một thập niên trở lại đây, tỷ lệ mắc ung thư có xu hướng gia tăng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Qua các kết quả thống kê cho biết, hiện toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang sống chung với bệnh ung thư. Con số này ước tính lên tới 30 triệu người vào năm 2020 nếu như chúng ta không tìm ra liệu pháp can thiệp và chữa trị kịp thời. Riêng ở Việt Nam, mỗi năm có trên 150.000 người mắc ung thư. Trong đó, khoảng 100.000 người chết vì căn bệnh quái ác này. Riêng số ca tử vong do ung thư đại trực tràng ước tính khoảng 55.000 trường hợp. Đây được xem là những con số đáng báo động và là thách thức lớn lao đối với Y học nước nhà. Hiện nay, trên thế giới ung thư đại trực tràng chiếm khoảng 11,5% tổng số các trường hợp ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số trường hợp tử vong có nguyên nhân từ ung thư. Loại ung thư này được nhận định là liên quan đến chế độ ăn uống và lối sống, thường gặp ở các nước phát triển và có xu hướng tăng nhanh ở các nước đang phát triển. Căn bệnh này thường xuất hiện ở những người có độ tuổi trên 50 và có xu hướng dần “trẻ hóa” trong hơn một thập niên trở lại đây. Đặc biệt, những người có tiền sử viêm đại trực tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có người bị ung thư đại trực tràng thì nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng xảy ra cao hơn. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, một bộ phận ung thư đại trực tràng có xu hướng chung di truyền theo dòng họ liên quan đến các gen gây đột biến (mutator gene) [4]. Học viên Khóa 2010 – 2012 1 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Trong ung thư đại trực tràng, hội chứng HNPCC – ung thư ruột kết không polyp di truyền còn gọi là hội chứng Lynch chiếm khoảng 15%. Hội chứng này cũng được xem là một bệnh di truyền tương đối phổ biến và gần đây được biết đến như một căn bệnh riêng biệt [30]. Bên cạnh đó, HNPCC là hội chứng có khuynh hướng ung thư không chỉ ở đại trực tràng mà còn liên quan đến các bệnh ung thư ở các cơ quan khác nhau như dạ dày, ruột non, não, tụy, buồng trứng, cổ tử cung và da. HNPCC là hội chứng có tính chất di truyền, vì nó có liên quan mật thiết đến sự sai hỏng một trong các gen thuộc hệ thống gen sửa chữa bắt cặp sai MMR. Hệ thống này gồm 6 gen chính là MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS2, PMS6. Trong đó, MLH1 và MSH2 được cho là hai gen có liên kết chặt đến sự hình thành HNPCC. Bởi vì, nếu MLH1 tham gia vào quá trình sửa chữa sự sai hỏng thì MSH2 lại đóng vai trò nhận diện các lỗi sai hỏng trong tái bản ADN. Khoảng 40% các trường hợp mắc hội chứng Lynch với một đột biến được xác định có liên quan đến đột biến gen MSH2. Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến ung thư đại trực tràng cũng như các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC [22]. Mặc dù ung thư đại trực tràng, trong đó có ung thư đại trực tràng mang khuynh hướng di truyền là một trong những dạng ung thư có tỷ lệ mắc phải ở Việt Nam khá cao nhưng những nghiên cứu về gen liên quan đến căn bệnh này chưa nhiều, đặc biệt là những nghiên cứu về gen MSH2. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành “Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 từ bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng” nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MSH2 ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, nghiên cứu mới về các gen MMR khác nhằm phục vụ có hiệu quả trong việc chẩn đoán cũng như phát hiện sớm bệnh ung thư đại trực tràng đang có xu hướng ngày một gia tăng tại Việt Nam. Học viên Khóa 2010 – 2012 2 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NHỮNG NÉT KHÁI QUÁT VỀ UNG THƢ, BỆNH UNG THƢ VÀ GEN UNG THƢ 1.1.1. Ung thƣ và bệnh ung thƣ Ung thư là sự phân chia một cách bất thường của một nhóm tế bào tạo thành những khối u. Các khối u này là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau, chúng có khả năng phân chia không kiểm soát. Chính vì thế, thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các tổ chức mô xung quanh gồm các tế bào bình thường [4]. Để phân biệt giữa khối u lành và khối u ác tính ta dựa vào khả năng xâm lấn của các tế bào bất thường đối với các tế bào xung quanh nó. Nếu là khối u lành, nó chỉ hình thành nên những tổ chức tế bào có khả năng sinh sản bất thường, khi tiếp xúc với mạch máu hay mạch bạch huyết cũng không có khả năng di chuyển tới một vị trí, một mô hay bất kì một cơ quan nào khác [4]. Ngược lại, nếu là khối u ác tính sẽ có thể di chuyển (di căn) tới bất cứ vị trí nào và tiếp tục tăng sinh mạnh ngay tại vị trí mà chúng chuyển tới. Các u di căn có khả năng gây ra những rối loạn cục bộ chức năng của các mô, thậm chí cả các mô liên đới và có thể dẫn đến tử vong. Các khối u thường phát sinh từ một tế bào ban đầu bị biến đổi di truyền nhất định khiến chúng có khả năng tăng sinh mạnh, được gọi là quá trình phát sinh ung thư hay sự phát sinh ung thư. Các khối u thường bắt nguồn từ những u nhỏ lành tính sau đó chuyển sang trạng thái ác tính và di căn. Các khối u này có xu hướng tích lũy các biến đổi di truyền và tạo nên các đặc tính mới. Sự tích lũy các gen ung thư ở các tế bào khối u chính là nguồn gốc phát sinh ung thư [4]. Bệnh ung thư được dùng để chỉ một nhóm bệnh đa dạng nào đó ở người. Và trong số đó, một vài bệnh chỉ đơn thuần gây nên những biến đổi nhỏ về sinh lí, còn phần lớn là gây ra những rối loạn sinh lí nghiêm trọng. Các bệnh ung thư phổ biến ở Học viên Khóa 2010 – 2012 3 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân người trưởng thành là các bệnh như ung thư biểu mô (caxinôm), ung thư mô liên kết (sacôm), ung thư bạch huyết và bạch cầu còn gọi là các khối u dạng lỏng [4]. Các bệnh ung thư đều phát sinh do sự biến đổi các gen tạo nên các alen đột biến. Trong thực tế, sự phát sinh các bệnh ung thư lại liên quan đến nhiều nhân tố. Nhờ những tiến bộ về khoa học kĩ thuật với các công cụ nghiên cứu và phân tích di truyền hiện đại đã dần làm sáng tỏ cơ chế phát sinh ung thư. Đặc biệt, những nghiên cứu trong khoảng 20 năm trở lại đây đã mang lại những kiến thức thiết thực và nhất quán. Những nghiên cứu này đã hình thành nên các nguyên lý di truyền học ung thư. Tuy nhiên, mãi tới đầu thế kỉ XIX ung thư mới thật sự được ghi nhận [4]. 1.1.2. Gen ung thƣ (oncogene) Gen ung thư là một dạng đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy quá trình phát sinh ung thư. Ngoài ra, gen ung thư cũng có thể được coi như các dạng alen đặc biệt do các gen bình thường xuất hiện các đột biến [4]. Còn gen gây ung thư được coi là một dạng đặc biệt của gen ung thư. Nếu gen ung thư sinh ra bởi đột biến, thì gen gây ung thư chỉ làm thay đổi chứ không làm mất chức năng sản phẩm của protein mà gen đó tạo ra. Trong quá trình tăng trưởng, các khối u tích lũy dần các gen ung thư. Sự tích lũy này chủ yếu theo ba con đường sau: 1. Sự tích lũy truyền qua các tế bào dòng sinh dục. 2. Sự tích lũy do đột biến tự phát trong tế bào sôma. 3. Sự tích lũy đột biến do lây nhiễm virut. Trong đó, gen ung thư dòng sinh dục chiếm tỉ lệ nhỏ (từ 0,1 – 10%) nhưng lại rất đáng kể trong các trường hợp gây ung thư ở người [4]. Còn gen ung thư dòng tế bào sôma đươc gọi là các đột biến sôma. Đột biến sôma dùng để chỉ quá trình phát sinh đột biến cũng như sản phẩm do quá trình đột biến đó tạo ra. Học viên Khóa 2010 – 2012 4 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Cả hai loại đột biến dòng sinh dục và đột biến sôma đều có thể làm biến đổi một gen bình thường tạo nên dạng alen đột biến. Nhưng không phải tất cả mọi đột biến gen đều dẫn đến phát sinh ung thư. Riêng dạng tích lũy gen ung thư trong cơ thể do nhiễm virut thì ít phổ biến hơn và thường giới hạn trong một số bệnh nhất định (ví dụ virut viêm gan B, C gây ung thư gan, virut HPV gây ung thư cổ tử cung...). Ở dạng phát sinh ung thư này, virut đóng vai trò quan trọng. Nó không chỉ là nhân tố truyền gen ung thư mà còn trực tiếp làm biến đổi môi trường mà ở đó các gen ung thư có thể được nhân lên nhanh chóng và được phát tán rộng rãi. 1.2. NHỮNG HIỂU BIẾT VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng Ung thư đại trực tràng là bệnh lý khá phổ biến trong các bệnh ung thư có liên quan đến hệ tiêu hóa. Trong đó, ung thư đại trực tràng không polyp di truyền được xem là hội chứng thường gặp nhất khi nhắc đến ung thư đại trực tràng. Vào cuối thế kỉ XIX (năm 1895), ung thư đại trực tràng được phát hiện bởi Aldred Warthin. Theo quan sát của ông trên một gia đình làm thợ may, có rất nhiều người bị chết bởi ung thư đại trực tràng hoặc ung thư nội mạc tử cung [34]. Tuy nhiên, ông chỉ dừng lại ở việc quan sát mà chưa đi sâu vào nghiên cứu những ghi chép của mình nên đặc tính di truyền của hội chứng này chỉ được biết đến sau những công bố của bác sĩ Henry Lynch. Theo kết quả của ông cho biết, ở các thế hệ đầu, ung thư dạ dày chiếm ưu thế. Càng về sau, ung thư đại tràng xuất hiện càng nhiều hơn. Sự thay đổi này phản ánh những biến đổi của môi trường có liên quan đến từng giai đoạn phát triển của bệnh ung thư cũng như loại ung thư, đồng thời khẳng định, sự biến đổi môi trường là một trong những nhân tố quan trọng dẫn đến ung thư đại tràng [4]. Học viên Khóa 2010 – 2012 5 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hội chứng Lynch được chia thành hội chứng Lynch I và hội chứng Lynch II để phân biệt các gia đình chỉ có ung thư đại tràng với các gia đình có cả ung thư đại tràng lẫn các loại ung thư khác. Ngày nay, người ta cho rằng, các gia đình có các bệnh ung thư liên quan tới ung thư ruột kết đều được coi là HNPCC [17]. Đến năm 1993, một sai hỏng mới và hiếm gặp trong hệ thống gen MMR của một bệnh nhân mắc ung thư ruột kết được phát hiện đã cung cấp một đầu mối quan trọng trong quá trình nghiên cứu ung thư đại trực tràng di truyền. Nghiên cứu được tiến hành trên những đột biến mất đoạn và đột biến khuếch đại gen nhằm chỉ ra các gen ung thư và gen áp chế khối u mới. Kết quả, đã tìm thấy các biến đổi sôma về độ dài các trình tự lặp lại được biết đến như các vi vệ tinh [19], [36]. Một nghiên cứu khác cũng tìm thấy những biến đổi liên quan đến sự hình thành khối u ở đoạn đầu ruột kết. Gần đây nhất, người ta đang nỗ lực lập bản đồ cho các vùng bị mất tính dị hợp tử LOH và cũng đã phát hiện được các đột biến ở trình tự vi vệ tinh. Nhờ đó người ta đã khám phá ra bản chất di truyền của ung thư đại trực tràng và khẳng định, hội chứng này do một số gen xảy ra các đột biến khác nhau, được di truyền qua các thế hệ và biểu hiện rõ rệt ở một số dòng họ. Ngoài ra, tính hỗn tạp của các gen gây ung thư ở các bệnh nhân ung thư ruột kết di truyền cũng được biết đến như là một tác nhân gây khó khăn trong chẩn đoán và phát hiện bệnh [20]. 1.2.2. Sơ lƣợc về bệnh ung thƣ đại trực tràng Ung thư đại trực tràng là một loại ung thư biểu mô, chiếm 11,5% tổng số các ca ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số các trường hợp tử vong vì ung thư. Loại ung thư này thường liên quan đến chế độ ăn uống và lối sống, gặp nhiều ở các nước phát triển, đặc biệt là các nước phương Tây và đang có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển [4]. Riêng ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng là một trong ba loại ung thư phổ biến hay gặp đối với hệ tiêu hóa. Do đó, ngày càng có nhiều dự án tập trung những nghiên cứu nhằm tìm ra nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng này. Theo thống kê Học viên Khóa 2010 – 2012 6 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân của Hội Ung thư Thành phố Hồ Chí Minh, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5 bệnh ung thư có số người mắc cao nhất. Một khảo sát mới nhất về tình trạng ung thư tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, ung thư đại trực tràng xếp thứ 4 ở nam giới (sau ung thư gan, phổi, dạ dày) và xếp thứ 3 ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung và ung thư vú). Hiện nay, y học chưa biết chính xác nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, có những yếu tố dẫn đến nguy cơ chắc chắn làm dễ mắc bệnh hơn tuổi tác. Vì trên 9% bệnh nhân ung thư đại trực tràng là trên 50 tuổi, có tiền sử bị polyp, viêm loét đại tràng và bệnh Crohn (một loại bệnh do hồi tràng – đoạn cuối ruột non bị tổn thương) trong gia đình có người mắc ung thư đại tràng hay đường ruột. Ung thư đại trực tràng là hội chứng khá phổ biến và được phân chia thành 3 loại chính, gồm: hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ (FAP) (Hình 1), hội chứng HNPCC và các bệnh ung thư khác có liên quan đến hệ tiêu hóa. Trong đó, hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ đặc trưng bởi bệnh nhân mang hội chứng này hình thành rất nhiều polyp trong ruột già từ khi còn khá trẻ. Các khối u có thể quan sát được chiếm tỷ lệ rất nhỏ, số ít trong đó có khả năng hình thành u ác tính. Hội chứng HNPCC đặc trưng bởi không xuất hiện các polyp mà thay vào đó là sự xuất hiện u tuyến. Chính những u tuyến này có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn nhiều [4]. 80% người mắc ung thư ruột già dạng HNPCC có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng. Tuổi trung bình của người mắc bệnh ung thư ruột già đơn phát là 61, Học viên Khóa 2010 – 2012 7 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân trong khi các bệnh nhân HNPCC đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42, tức là sớm hơn 20 năm. Đối với phụ nữ, có khoảng 20 – 60% bệnh nhân HNPCC có nguy cơ mắc ung thư nội mạc tử cung. Tuổi trung bình cho chẩn đoán ung thư nội mạc tử cung là 46 – 62. Trong số những phụ nữ mắc HNPCC phát triển thành ung thư ruột kết và ung thư nội mạc tử cung, khoảng 50% xuất hiện ung thư nội mạc tử cung từ trước đó [17]. Có thể xem xét tỷ lệ mắc các bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC trong Bảng 1 dưới đây. Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC [17] Ung thƣ liên quan đến Tỷ lệ mắc Nguy cơ mắc Tuổi phát HNPCC HNPCC bệnh bệnh Đại trực tràng 5.5% 80% 44 Nội mạc tử cung 2.7% 20-60% 46 Dạ dày <1% 11-19% 56 Buồng trứng 1.6% 9-12% 42.5 Đường tiết niệu <1% 4-5% 55 Ruột non <1% 1-4% 49 Não bộ và hệ thần kinh TƯ <1% 1-3% 50 Căn cứ vào bảng số liệu trên có thể thấy, tỷ lệ người bị HNPCC dẫn tới mắc ung thư đại trực tràng là rất cao (khoảng 80%). Khi đó, chẩn đoán các mẫu mô trực tràng được phân lập để phân tích ADN là rất quan trọng và cần thiết. Nhờ tính phổ biến và dễ tiếp cận, các khối u đại trực tràng là mô hình lí tưởng để nghiên cứu các gen đóng góp vào quá trình phát sinh ung thư. Hơn nữa, độ tuổi mắc ung thư đại trực tràng cũng sớm hơn so với các dạng ung thư khác và thường nằm trong độ tuổi Học viên Khóa 2010 – 2012 8 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân 40 – 42. Trong một nhóm các bệnh nhân HNPCC cũng như các bệnh nhân ung thư đại trực tràng không đủ tiêu chuẩn HNPCC thì các cá thể mang đột biến dòng mầm ở một trong các gen MMR sẽ được xác định là mắc hội chứng Lynch. Để biết được một bệnh nhân có phải mắc hội chứng HNPCC không, người ta đã thiết lập các tiêu chuẩn để xác định các cá thể có nguy cơ cao với loại hội chứng này. Ngoài những chỉ dẫn của Bethesda cải tiến là dựa vào thông tin lâm sàng, lịch sử gia đình hoặc mô bệnh học hay các tiêu chuẩn Amsterdam I và II, người ta còn tiến hành các xét nghiệm di truyền các đột biến MMR. Tuy nhiên, các xét nghiệm này thường rất phức tạp, mất nhiều thời gian và chi phí tốn kém. Chính vì thế, người ta đã đưa ra khuyến cáo rằng các bệnh nhân có nguy cơ cao với hội chứng Lynch nên thực hiện phương pháp tiền sàng lọc với phân tích MSI và hóa mô miễn dịch IHC. Khi đó, các cá thể có khối u sẽ thể hiện mức độ bất ổn vi vệ tinh cao hoặc mất sự biểu hiện của các protein MMR bằng IHC sau đó tiến hành xét nghiệm đột biến dòng mầm. Nếu tuân thủ đúng việc sử dụng hướng tiếp cận từng bước này thì hầu hết các trường hợp mắc hội chứng Lynch đều được phát hiện và cho độ tin cậy rất cao [29]. 1.2.2.1. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, y học chưa xác định rõ đâu là nguyên nhân chủ yếu. Người ta chỉ biết rằng, có một số nguyên nhân khách quan khác ngoài yếu tố về tuổi tác hay yếu tố gia đình có tiền sử mắc các bệnh về đại trực tràng liên quan đến HNPCC, đó là cách thức ăn uống cũng như lối sống của chúng ta. Ăn quá nhiều chất béo, thịt, mỡ, thức ăn chứa nhiều Cholesterol sẽ làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng. Hay ăn ít hoặc không ăn các chất xơ như rau xanh, trái cây cũng là nguyên nhân dẫn tới sự hình thành bệnh. Ngoài ra, những người thừa cân, béo phì cũng rất dễ mắc loại bệnh này. Chính vì thế, để phòng tránh ung thư đại trực tràng, ngoài chế độ ăn uống hợp lý, tăng cường các hoạt động thể dục, thể thao thì từ 50 tuổi trở đi, mỗi người nên tới bác sĩ thăm khám định kỳ ít nhất 1 lần trong năm để kịp thời phát hiện những biến đổi tiềm ẩn giúp phòng tránh ung thư đại trực tràng. Học viên Khóa 2010 – 2012 9 Nguyễn Thị Mai