Tài liệu Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao từ sữa Người và Động vật.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CAO TỪ SỮA NGƢỜI VÀ ĐỘNG VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011 – 2015 THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CAO TỪ SỮA NGƢỜI VÀ ĐỘNG VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Trần Văn Chí ThS. Dƣơng Mạnh Cƣờng THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình. Trước hết, em xin chân thành cảm ơn TS. Trần Văn Chí, giảng viên Khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Dương Mạnh Cường, ThS. Bùi Tuấn Hà, ThS. Vi Đại Lâm giảng viên Khoa CNSH - CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai lầm giúp em hoàn thành tốt khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Hồng Ngọc ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic…………………………8 Bảng 2.2: Một số các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết đã được sử dụng để bổ sung khi lên men thực phẩm .......................................................... 14 Bảng 3.1: Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 22 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 23 Bảng 3.3: Môi trường thạch MRS (de Man,Rogosa and Sharpes) (g/l)..........23 Bảng 3.4: Công thức phối trộn cho lên men sữa chua .................................... 35 Bảng 3.5: Hệ số trọng lượng của các chỉ tiêu đánh giá .................................. 35 Bảng 3.6: Cơ sở đánh giá điểm cảm quan cho sản phẩm ............................... 36 Bảng 3.7: Mức chất lượng trong đánh giá cảm quan ...................................... 37 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái, Gram, catalase các vi khuẩn lactic phân lập .. 39 Bảng 4.2: Giá trị OD (mật độ quang) của các chủng vi khuẩn phân lập ........ 44 Bảng 4.3: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn lactic phân lập ............................................................................................................. 45 Bảng 4.4: Số liệu đo mật độ tế bào với đường Glucose, Lactose và Saccharose ở các nồng độ khác nhau của chủng P2(2) .......................................... 50 Bảng 4.5: Số liệu đo pH và độ chua Therner của các loại đường khác nhau ở nồng độ 2% đối với chủng P2(2)......................................................... 51 Bảng 4.6: Kết quả định danh sơ bộ chủng lactic phân lập .............................. 52 Bảng 4.7: Số liệu đo mật độ tế bào trên các môi trường thay thế của chủng P2(2) .................................................................................................... 54 Bảng 4.8: Số liệu đo pH và độ chua sau 30 giờ ............................................. 55 Bảng 4.9: Kết quả thử khả năng kết hợp với nấm men Pichia anomala 9a... 56 Bảng 4.10: Đánh giá cảm quan sản phẩm sữa chua ........................................ 56 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1: Quy trình sản xuất sữa chua ............................................................ 34 Hình 4.1: Khả năng phân giải CaCO3 của chủng khuẩn phân lập .................. 41 Hình 4.2: Đường cong sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic ................. 45 Hình 4.3: Thử nghiệm khả năng di động các chủng vi khuẩn lactic .............. 46 Hình 4.4: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của chủng P2(2) ............................ 47 Hình 4.5: Sản phẩm sữa chua lên men ............................................................ 57 iv DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ATP : Adenosin Triphosphat DNA : Deoxyribonucleic acid GRAS : Generally Recognized As Safe LAB : Lactic acid Bacteria MRS : de Man, Rogosa and Sharpes OD : Optical Density ONPG : o nitrophenyl-β-D-glucoside v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 1.4.1.Ý nghĩa khoa học .................................................................................................... 2 1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................... 2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) ......................................................... 3 2.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 3 2.1.2. Lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn lactic (LAB) ....................................... 3 2.1.3. Đặc tính chung ........................................................................................ 4 2.1.4. Phân loại vi khuẩn lactic ......................................................................... 4 2.1.5. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 6 2.2. Enzyme lactase ........................................................................................... 6 2.2.1. Lactose .................................................................................................... 6 2.2.2. Lactase và chức năng .............................................................................. 7 2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic .......................................... 7 2.3.1. Đặc điểm sinh lý .................................................................................................... 7 2.3.2. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic ............................................................. 8 2.3.3. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic ............................................................ 10 2.3.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic.............................................................. 13 2.3.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................... 17 Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................... 22 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ........................................................... 22 vi 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 22 3.3. Hoá chất và thiết bị sử dụng ..................................................................... 22 3.3.1. Hoá chất ................................................................................................................. 22 3.3.2. Thiết bị sử dụng ................................................................................................... 23 3.4. Môi truờng sử dụng .................................................................................. 23 3.5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24 3.6. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24 3.6.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic ...................................... 24 3.6.2. Phương pháp định danh sơ bộ .......................................................................... 25 3.6.3. Phương pháp đếm tế bào vi khuẩn lactic ....................................................... 27 3.6.4. Phương pháp đo pH ............................................................................................ 29 3.6.5. Phương pháp định lượng acid lactic ............................................................... 29 3.6.6. Phương pháp đo sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic bằng cách đo chỉ số OD trên máy quang phổ UV – Vis .................................................. 30 3.6.7. Phương pháp nghiên cứu môi trường thay thế ............................................. 31 3.6.8. Phương pháp thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn lactic với chủng nấm men ............................................................................................................................ 32 3.6.9. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm lên men sữa chua ........................... 33 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38 4.1. Kết quả phân lập chủng khuẩn lactic có khả năng lên men, tăng sinh khối mạnh ................................................................................................................ 38 4.2. Kết quả tuyển chọn chủng khuẩn lactic có khả năng lên men, tăng sinh khối mạnh ........................................................................................................ 41 4.3. Kết quả định danh sơ bộ chủng khuẩn lactic phân lập ............................ 52 4.4. Kết quả nghiên cứu môi trường thay thế môi trường MRS ..................... 52 4.5. Thử khả năng kết hợp của chủng lactic phân lập được với chủng nấm men Pichia anomala 9a .................................................................................. 55 4.6. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm lên men sữa chua .................................. 56 vii 4.6.1. Công thức phối trộn trong lên men sản xuất sữa chua ............................... 56 4.6.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm sữa chua ......................................................... 56 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 58 5.1. Kết luận .................................................................................................... 58 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 60 Tài liệu Tiếng việt ........................................................................................................... 60 Các thông tin từ mạng .................................................................................................... 62 Tài liệu Tiếng Anh .......................................................................................................... 62 PHỤ LỤC 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Vi khuẩn lactic (LAB) có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men, tạo hương vị và bảo quản thực phẩm. Đặc biệt LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm lên men bao gồm các sản phẩm sữa như sữa chua, pho mát, các sản phẩm thịt, các sản phẩm bánh mì và rượu vang [19]; (Pannapa Powthong và cs, 2015) [31]. Trong quá trình lên men, LAB sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Đặng Thị Thu Thảo, 2011) [15]. LAB thường tồn tại ở môi trường sống giàu chất dinh dưỡng như sữa, phô mai, thịt, đồ uống và các loại rau. Chúng có thể cũng phân lập từ đất, ao hồ, đường ruột của động vật và con người (Schillinger và cs, 1989) [35]; (Tserovska và cs, 2006) [37]. Nhiều nghiên cứu gần đây không chỉ hướng đến việc tìm ra chủng LAB làm chất phụ gia an toàn (GRAS), kiểm soát sự phát triển của mầm bệnh, hay cả việc sản xuất các kháng sinh “bacteriocins, đã được đánh giá cao. Mà hiện nay các chủng LAB vẫn được nghiên cứu chuyên sâu tìm ra nguồn nguyên liệu sữa khi phân lập thu được lượng acid lactic cao nhất. Với mục đích tìm ra các chủng LAB có khả năng sinh acid lactic cao nhất ứng dụng trong sản xuất công nghiệp thực phẩm, em tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao từ sữa Người và Động vật”. 2 1.2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn đươc chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao từ sữa Người và Động vật. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ sữa Người và động vật (bò, dê, lợn…). - Tuyển chọn một số chủng có khả năng lên men và tăng sinh khối mạnh nhất. - Định danh sơ bộ chủng vi khuẩn mà mình phân lập được. - Nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế: môi trường nước rau cải, môi trường giá đỗ... - Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn phân lập được với chủng nấm men. 1.4. Ý nghĩa của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. - Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. 1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng LAB cho khả năng tạo acid lactic cao, ứng dụng trong ngành công nghiệp sữa, cũng như các sản phẩm len men khác. Đem lại năng suất, chất lượng cao. - Sau nghiên cứu xác định được khả năng kết hợp giữa chủng LAB đã định danh với vi khuẩn khác. Tạo một hướng nghiên cứu mới sau này. - Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) 2.1.1. Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chúng là trực khuẩn ngắn hay que và cầu khuẩn không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, axit lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng (Lê Thị Hồng Vân, 2008) [20]; [21]. 2.1.2. Lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn lactic (LAB) Từ xa xưa, con người đã sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản và chế biến các loại thức ăn. Cho đến năm 1780, nhà bác học Thuỵ điển Carl Wilhelm Schaele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1874, Bloudean xác nhận axit lactic (CH3CHOHCOOH) là sản phẩm cuối cùng của sự lên men. Mười năm sau, năm 1857, L.Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Đến năm 1878, Joseph Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic, ngày nay gọi là Streptococcus lactic. Công nghệ sản xuất axit lactic ra đời năm 1881, từ đó đến này đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn lactic cũng như quá trình lên men lactic được thực hiện. Các nhà khoa học cũng liên tục phân lập được các loài vi khuẩn lactic khác nhau (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6]; (Huỳnh Ngọc Thạch và cs, 2002) [14]. 4 2.1.3. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính và là vi khuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes (trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc). Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và axit. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành axit lactic trong môi trường, và sức chịu axit (hay độ bền axit) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit lactic cao hơn (khoảng 2÷3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8÷4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH=5,5÷6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25÷350C, ưa nhiệt là 40÷450C và ưa lạnh là thấp hơn 5oC. Khi gia nhiệt khoảng 60÷800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút [21]; (Moussa M.E. Salem, 2013) [30]; (Sawsan Abdelaziz Abdullah và cs, 2010) [34]. 2.1.4. Phân loại vi khuẩn lactic Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau. Để phân loại người ta dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau, căn cứ vào đặc điểm hình thái, phương thức lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu acid hay kiềm. 5 Theo bản phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que, trong đó các giống sau đây là chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella.Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp [21]. 2.1.4.1. Phân loại theo hình dạng tế bào (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6] Sau nhiều nghiên cứu và dựa trên những đặc điểm hình dạng tế bào các nhà khoa học đã phân chia vi khuẩn lactic thành các loại sau:  Hình que: Lactobacillus, Carnobacerium.  Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus.  Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que), Bifidobacterium Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus). Hình dạng và sự sắp xếp tế bào có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy… 2.1.4.2. Phân loại theo cách thức lên men (Espina. F và cs, 1979) [25] Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng acid lactic tạo ra chủ yếu 85 – 90%. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolaza nhưng không có enzyme phosphoketolaza. Nhóm vi khuẩn này gồm các cầu khuẩn Streptococcus lactic như là Streptococcus cermoris, các trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium bulgaricus. Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng acid lactic lên men chiếm tỷ lệ thấp khoảng 50%, các axit hữu cơ khác như axit acetic, axit 6 formic... và CO2. Nhóm vi khuẩn này không có enzyme aldolaza nhưng lại có enzyme phosphoketolaza. Ví dụ: Leucnostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus. 2.1.5. Đặc điểm hình thái Tế bào của vi khuẩn lactic có thể là hình que hoặc hình cầu. Kích thước và sự sắp xếp tế bào thay đổi tuỳ thuộc từng loài khác nhau. Chi Lactobacillus là các trực khuẩn phổ biến nhất bao gồm 52 loài. Tế bào của chúng có thể thay đổi từ hình bầu dục đến hình que dài, Lactobacillus plantarum có tế bào hình que kích thước 0,7-1,1×3-8µm, xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, trong khi Lactobacillus bulgaricus lại có dạng que dài, mảnh (0,7-0,9×5-20µm) đứng riêng lẻ, cặp đôi hay tạo các chuỗi ngắn. Chi Streptococcus là các cầu khuẩn. Tế bào có thể hình tròn hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5-1µm. Các tế bào thường tạo các chuỗi dài hoặc xếp đôi, ít khi đứng đơn lẻ. Tế bào của giống Leuconostoc thường có dạng hình que ngắn hoặc hình ovan (0,5-0,8×1,6µm). Cũng có khi chúng hình tròn đường kính từ 1 - 3µm, sắp xếp thành chuối và không tạo thành một đám tập trung. Giống Lactococcus có hình dáng tế bào tương tự như Leuconostoc song chúng lại thường xuyên quy tụ tạo thành đám lớn (Huỳnh Ngọc Thạch và cs, 2002) [14]. 2.2. Enzyme lactase 2.2.1. Lactose Lactose (β-D-galactopyranosyl – (1,4)-α-D-glucopyranose) là đường đôi có ở sữa của động vật có vú, ngoại trừ một vài loài, nồng độ trong khoảng 2 – 10%. Sữa mẹ có hàm lượng lactose cao khoảng 6,95% (Rohit Sharma và cs, 2013) [32]. Hàm lượng lactose trung bình ở sữa bò khoảng 4,8%, khoảng 4,4 – 5,2% (theo Ganzle, 2008) [21], trâu 4,86%, sữa dê 4,7% (Sawsan Abdelaziz Abdullah và cs, 2010) [33]. 7 2.2.2. Lactase và chức năng Enzyme thủy phân lactose có tên lactase, thuộc nhóm β-galactosidase. Enzyme này có hoạt tính chủ yếu là thủy phân liên kết β1-4 glucosidic của phân tử đường đôi lactose để tạo thành 2 phân tử đường đơn có độ ngọt cao hơn đường lactose. Do vậy, enzyme lactase chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp các sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, một thành phần cacbonhydrat chính trong sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả năng dung nạp rất kém và đặc biệt một số ít người lớn kể cả trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose [21]. Hoạt tính phân hủy lactose được xác định bằng 2 cách, hoặc là thông qua sự mất đi của cơ chất là lactose hoặc là thông qua sự tạo thành của sản phẩm đặc trưng cho phá vỡ liên kết glycosidic, thông thường dùng cơ chất đặc hiệu ONPG (o nitrophenyl-β-D-glucoside) và xác định lượng ONP (onitrophenyl) tạo thành. Lactase của các vi khuẩn ưa pH gần trung tính. Phần lớn lactase hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-450C (ưa nhiệt độ trung bình), một số khác từ 45-650C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác ở nhiệt độ lạnh 40C [21]. 2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 2.3.1. Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về mặt sinh lý tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử, hầu hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh axit lactic dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2009) [3] Khác với các vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra axit lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc; không chứa cytochrome, enzyme catalase; hô hấp tuỳ tiện. Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu cao về môi truờng dinh dưỡng 8 ngoài đường, muối khoáng, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) và các axit amin (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2009) [3]. Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn lactic thay đổi tuỳ từng loài, hình thái còn phụ thuộc vào điều kiện môi truờng, thời gian lên men, sự có mặt của oxi và các tác nhân khác. Bảng 2.1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6] Giống Tế bào Kiểu lên men DNA Hình Sắp xếp Streptococus Cầu Chuỗi Đồng hình 34 - 46 Leuconostoc Cầu Chuỗi Dị hình 36 – 43 Pedicoccus Cầu Tứ cầu Đồng hình 34 – 42 Lactobacsillus Que Chuỗi Đồng hình và dị hình 32 – 53 Bifidobacterium Khác nhau tuỳ Nhiều dạng Lên men lactic và acetic (%GC) 55 - 67 loại 2.3.2. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic [21] Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ… 2.3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, 9 maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ. 2.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton. 2.3.2.3. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… 2.3.2.4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit xitric, axit oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic, axit axetic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. 2.3.2.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. 10 Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. 2.3.2.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy. + Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP. + Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 2.3.3. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hoá đuờng thành axit lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, axit amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh duỡng giàu vitamin, axit amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit yếu pH từ 5,5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 – 50oC. Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80oC vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6]. Quá trình lên men lactic diễn ra trong tế bào của vi khuẩn lactic. Đầu tiên đường được hấp thụ vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ đi thẳng vào chu trình chuyển hoá, nếu phân tử là đường đôi hay các dạng 11 đường khác thì sẽ bị phân huỷ thành các monosaccharide rồi mới đi vào chu trình chuyển hoá tạo ra các sản phẩm là axit lactic, axit acetic, CO2… Dựa vào sản phẩm lên men sinh ra, chia lên men lactic thành hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6]; (Axelsson L.T, 2004) [22]. 2.3.3.1. Lên men lactic đồng hình Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình: C6H12O6  2CH3 – CHOH – COOH + 94 Kcal Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm tạo ra chủ yếu là axit lactic. Trong quá trình lên men, sự hình thành axit trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với sự tham gia của các enzyme tương ứng. Giai đoạn đầu xảy ra quá trình hoạt hoá hexose với sự có mặt của axit phosphoric để hình thành hexose diphosphat, sau đó diễn ra sự cắt mạch hexose để hình thành triosophosphat (dihydroxyaxeton-P và glycerađehye-3P) những hợp chất này chuyển hoá thành pyruvat, và pyruvat là chất nhận H+ từ NADH để chuyển hoá thành axit lactic (chu trình EMP) (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6]; (Khalisanni Khalid, 2011) [28]. Một số loài vi khuẩn lactic lên men lactic đồng hình: Streptococcus lactics: Là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Chúng là giống vi khuẩn ưa ấm, phát triển tốt ở 30-35oC, làm đông tụ sữa ở điều kiện này sau 10 – 12 giờ. Trong môi truờng tích tụ được 0,8 - 1% axit lactic. Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 10oC, tối đa là 40 – 45oC. Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nizin (Nguyễn Thị Diễm Hương và cs, 2012) [7]. Lactobacillus plantarum: Là những trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 30oC, tích tụ 1,3% axit. Giống này chủ yếu trong muối chua rau dưa và ủ chua thức ăn dùng trong chăn nuôi (Nguyễn Đức Lượng, 2002) [12].