Tài liệu Nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein từ phế liệu tôm

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ THANH NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƢƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm HUẾ - 2018 ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ THANH NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƢƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. ĐỖ THỊ BÍCH THỦY HUẾ - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Lê Thị Thanh ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn ngoài sự nỗ lực và đam mê của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ, động viên của quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy đã định hƣớng nghiên cứu và tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Huế đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô giáo trong khoa Cơ khí - Công nghệ, trƣờng Đại học Nông Lâm Huế đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi học ở trƣờng và thực hiện đề tài luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã luôn ở bên để động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Lê Thị Thanh iii TÓM TẮT Nghiên cứu một số thông số công nghệ thích hợp để thủy phân và lên men phế liệu tôm bởi chủng B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 và đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenprotein từ PLT. Kết quả của đề tài làm tiền đề cho nghiên cứu xử lý PLT kết hợp hai chế phẩm vi sinh nhằm tạo ra chế phẩm probitic giàu carotenoprotein có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi. Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân tích các chỉ tiêu trong quá trình nghiên cứu và thực hiện nội dung đề tài: phƣơng pháp tăng sinh và nuôi cấy để thu nhận sinh khối tế bào, xác định số tế bào sống bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, xác định hoạt độ protease bằng phƣơng pháp Ason cải tiến, xác định hàm lƣợng protein tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl, xác định hàm lƣợng nitơ formol bằng phƣơng pháp sorensen, xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phƣơng pháp DPPH, xác định hàm lƣợng astaxanthin trong phế liệu tôm và xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi. Các thông số công nghệ thích hợp để xử lý PLT trong quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenprotein: tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT là 1:2. Nhiệt độ lên men 35oC và thời gian lên men 24 giờ. Sau khi xác định đƣợc các thông số để xử lý PLT, chúng tôi tiếp tục khảo sát tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein thu đƣợc từ quá trình lên men vào chất mang bã sắn khô, thực hiện sấy chế phẩm ở nhiệt độ 35oC trong 5 giờ và đã xác định đƣợc tỷ lệ phối trộn thích hợp là 1:4 thông qua các chỉ tiêu mật độ tế bào sống (9,45 lg CFU/g), hoạt độ protease (28,74 UI/ml), hàm lƣợng astaxanthin (4,2 µg/g) và độ ẩm (6,9%) đạt yêu cầu của chế phẩm. Xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein từ phế liệu tôm. iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vii DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ..............................................................................................ix MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .....................................................................................2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC ..............................................................................3 1.1.1. Khái niệm probiotic ............................................................................................... 3 1.1.2. Tác dụng của probiotic .......................................................................................... 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ................................................................ 5 1.2.1. Khái niệm vi khuẩn lactic ......................................................................................5 1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................6 1.2.3. Lactobacillus fermentum .......................................................................................8 1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS ............................................................ 9 1.3.1. Giới thiệu về Bacillus ............................................................................................ 9 1.3.2. Đặc điểm chung ...................................................................................................10 1.3.3. Bacillus subtilis ...................................................................................................10 1.4. PHẾ LIỆU TÔM .....................................................................................................13 1.5. PHỨC HỢP CAROTENOPROTEIN VÀ ASTAXANTHIN ................................ 13 1.5.1. Nguồn gốc và bản chất của chế phẩm caroten-protein ........................................13 1.5.2. Astaxanthin và các ứng dụng ..............................................................................14 v 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI....................................16 1.6.1. Trên thế giới ........................................................................................................16 1.6.2. Ở Việt Nam..........................................................................................................20 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 24 2.1. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................24 2.1.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 24 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................... 24 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................24 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................25 2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh ............................................................................................ 25 2.3.2. Phƣơng pháp hóa sinh ......................................................................................... 26 2.3.3. Phƣơng pháp vật lý .............................................................................................. 28 2.3.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm để thực hiện nội dung nghiên cứu .....................29 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...................................................................................34 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................36 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU TÔM .............................................36 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ GIỮA B. subtilis C10 VÀ L. fermentum TC10 GIEO CẤY BAN ĐẦU VÀO PHẾ LIỆU TÔM ĐẾN CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN ...................37 3.2.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt độ enzyme protease ..........................................................................37 3.2.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến mật độ tế bào sống ...................................................................................39 3.2.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa ...........................................................................40 3.2.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu...........................................41 3.2.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lƣợng nitơ formol .............................................................................42 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ LÊN MEN ĐẾN CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN .......43 vi 3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ protease ......................................43 3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến mật độ tế bào sống ..................................44 3.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa .......................... 45 3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu ............................................................................................................. 46 3.3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng nitơ formol ............................ 47 3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN .....48 3.4.1. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt độ protease .....................................49 3.4.2. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến mật độ tế bào sống .................................50 3.4.3. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa ......................... 51 3.4.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu .................................................................................................................................52 3.4.5. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng nitơ formol ........................... 54 3.5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ PHỐI TRỘN DỊCH CAROTENOPROTEIN VÀO CHẤT MANG ĐẾN CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC ......................................................................................................55 3.5.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến mật độ tế bào sống ......................................................................................................................... 55 3.5.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến hoạt độ protease, hàm lƣợng astaxanthin và độ ẩm chế phẩm ...................................................56 3.6. THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM ............................................................. 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................60 KẾT LUẬN ...................................................................................................................60 ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 61 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Analysis of Variance AA Activity of Amylase BOD Biochemical Oxygen Demand CFU Colony-forming Unit COD Chemical Oxygen Demand ĐC Đối chứng DDA Deacety hóa DH Degree of Hydrolysis DO Dissolved Oxygen DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl FBC Fat Binding Capacity LAB Lactic acid bacteria OD Optical Density PA Protease Activity PFCP Peptide from Carotenoprotein PLT Phế liệu tôm SF Submerged Fermentation SSF Solid - State Fermentation UI International Unit VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật WBC Water Binding Capacity viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu tôm ...............................................36 Bảng 3.2. Thông số thích hợp cho quá trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein từ PLT bởi B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 ............................. 54 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến hoạt độ protease, hàm lƣợng astaxanthin và độ ẩm chế phẩm ..............................................56 ix DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Vi khuẩn Lactobacillus fermentum .................................................................8 Hình 1.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng thạch ........................................11 Hình 1.2. Tế bào Bacillus subtilis sau khi nhuộm gram................................................11 Hình 1.4. Công thức cấu tạo astaxanthin .......................................................................14 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein......................................................................................... 29 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein .....................................................31 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein ...............................................33 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenprotein với chất mang đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein ...............................................................................................................35 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt độ protease ................................................................................38 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến mật độ tế bào sống ............................................................................39 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa ....................................................................40 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu ....................................41 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lƣợng nitơ formol ......................................................................42 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ protease .................................44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến mật độ tế bào sống ............................. 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa .....................46 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu .................................................................................................................................47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng nitơ formol .....................48 x Hình 3.11. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt độ protease .............................. 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của thời gian đến mật độ tế bào sống ........................................51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa ..................52 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu ........................................................................................................................... 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng nitơ formol .....................54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến mật độ tế bào sống ................................................................................................................55 Hình 3.18. Bột sắn khô ..................................................................................................57 Hình 3.17. Dịch carotenoprotein ...................................................................................57 Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau khi sấy....................................................................57 Hình 3.20. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein .....................58 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp có ngành chăn nuôi phát triển và có đóng góp to lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nƣớc. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất, chất lƣợng sản phẩm và cải thiện môi trƣờng chăn nuôi rất đƣợc quan tâm ở nƣớc ta hiện nay. Việc lạm dụng kháng sinh của ngƣời chăn nuôi đang trở thành vấn đề nan giải. Hệ quả là lƣợng tồn dƣ kháng sinh có trong thực phẩm không chỉ ảnh hƣởng đến vật nuôi mà còn nguy hại đến sức khỏe con ngƣời khi tiêu thụ thực phẩm. Để hạn chế và tiến tới loại bỏ kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, sử dụng probiotic là một trong những giải pháp thay thế kháng sinh quan trọng. Probiotic là những vi khuẩn có ích hoặc nấm men khi đƣa vào cơ thể một liều lƣợng vừa đủ sẽ sản sinh ra các enzyme tiêu hóa, các vitamin và các chất có hoạt tính kháng khuẩn, tạo ra những tác động tích cực đối với quá trình tiêu hóa, giúp hấp thu dƣỡng chất tốt hơn (FAO/WHO, 2001) [66]. Các loài Bacillus và Lactobacillus đƣợc xem là những đối tƣợng giàu tiềm năng để sản xuất probiotic. Do Bacillus không chỉ có khả năng sinh bào tử để chống chịu với điều kiện môi trƣờng bất lợi (Sanders và cs, 2003, Hong và cs, 2005) [73], [109], mà còn có thể sinh chất kháng sinh, chất kháng khuẩn kìm hãm VSV (vi sinh vật) gây bệnh (Sanders và cs, 2003) [109]. B. subtilis sinh ra rất nhiều loại enzyme, đặc biệt là  amylase và protease kiềm có giá trị cao. Ngoài ra, B. subtilis có khả năng sinh ra riboflavin (tiền vitamin B2) (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2001) [4]. Lactobacillus đƣợc biết đến là nhóm VK (vi khuẩn) có chức năng probiotic có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ động vật. Khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của VK lactic làm cho chúng ức chế các VK gây bệnh đƣờng ruột (Đỗ Thị Bích Thủy, 2014) [25]. L. fermentum là VK có khả năng chống chịu trong dịch dạ dày, dịch ruột non, kháng các VSV gây bệnh, tăng cƣờng hệ miễn dịch, tăng khả năng kháng oxy hóa (Gotteland và cs, 2006; Garcia và cs, 2009; Garcia và cs, 2012) [67],[68],[69]. Trong công nghệ chế biến thuỷ sản xuất khẩu của Việt Nam, công nghệ chế biến tôm tạo ra một lƣợng lớn PLT (phế liệu tôm) bao gồm đầu tôm và vỏ tôm. Lƣợng này thƣờng chiếm 50-70% nguyên liệu ban đầu. PLT là nguồn cung cấp protein, chitin và carotenoids (Holanda và Netto, 2006) [72]. Trong đó, carotenoid đƣợc biết là một chất màu tự nhiên an toàn cho các ngành công nghệ thực phẩm, dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Gần đây, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để tách chiết và thu nhận các chế phẩm đạm giàu carotenoid. Chúng có thành phần chính là protein và carotenoid ở dạng phức hợp caroten-protein và có nhiều trong phế liệu giáp xác (tôm hùm, tôm sú, tôm chì, tôm thẻ chân trắng) và một số phế liệu hải sản khác. Theo Lê Minh Hoàng và cs 2 (2015) thành phần của carotenoprotein tách chiết từ vỏ đầu tôm có màu đỏ gạch và mùi thơm gồm 7,1% hàm lƣợng chất khô, 68,5% hàm lƣợng protein, 7,3% hàm lƣợng lipid, 390 ppm hàm lƣợng astaxanthin, 22,7% hàm lƣợng khoáng [6]. Việc tách chiết chúng không chỉ thu nhận đƣợc các sản phẩm có giá trị gia tăng mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng (Chakrabarti, 2002; Phạm Thị Đan Phƣợng và Trần Thị Luyến, 2013) [16],[58]. Vì vậy, nghiên cứu thủy phân và lên men PLT bằng phƣơng pháp vi sinh vừa thu hồi đƣợc hàm lƣợng caroten-protein vừa tách đƣợc lƣợng chitin đáng kể (Phạm Thị Đan Phƣợng và cs, 2015) [19]. Với mong muốn tận dụng và nâng cao giá trị của PLT bằng tạo ra sản phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm thiểu vấn nạn sử dụng kháng sinh tràn lan, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein từ phế liệu tôm”. 2. Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein từ PLT có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi ở quy mô phòng thí nghiệm làm tiền đề cho các nghiên cứu ở quy mô tiền pilot và sản xuất. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1) Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những thông tin tài liệu liên quan đến sản xuất chế phẩm probiotic nói riêng và các lĩnh vực trong công nghệ thực phẩm nói chung. 2) Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu về chế phẩm probiotic sẽ tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất chế phẩm ở quy mô công nghiệp nhằm nâng cao giá trị sử dụng của phế liệu tôm và góp phần hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Khái niệm probiotic Từ “probiotic” đƣợc bắt nguồn từ Hy Lạp, theo tiếng Anh là “for life” nghĩa là “dành cho cuộc sống”, chỉ những vi sinh vật sống trong cơ thể động vật và mang lại những tác động có lợi cho cơ thể vật chủ. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic đã đƣợc đề nghị, Fuller (1989) (theo FAO/WHO, 2001), đã chỉ rõ bản chất VSV của probiotic qua định nghĩa: “một sự bổ sung vi sinh vật sống qua đƣờng tiêu hóa mà tạo ra những tác động có lợi lên vật chủ thông qua việc gia tăng sự cân bằng trong đƣờng tiêu hóa”. Năm 1998 Guarner và Schaafsma (theo FAO/WHO, 2001) định nghĩa probiotic “là những vi sinh vật sống, khi đƣợc đƣa vào một lƣợng thích hợp, mang lại những lợi ích sức khỏe cho vật chủ”. Định nghĩa của FAO/WHO (2001) đã khái quát đƣợc những đặc điểm chính của probiotic, theo đó probiotic là “VSV sống khi đƣợc đƣa vào với số lƣợng hợp lý đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ” [66]. Nhƣ vậy, những điểm chính về probiotic là: - Những sản phẩm gồm có các VSV sống khi có mặt trong cơ thể sẽ gây ra tác động có lợi cho vật chủ. - Cần đƣợc đƣa vào với một lƣợng phù hợp để mang lại tác động mong muốn. Các VSV có tính chất nhƣ một probiotic có mặt trong đời sống, trong thực phẩm hàng ngày, và có thể đƣợc đƣa bổ sung vào cơ thể thông qua đƣờng ăn uống các sản phẩm ăn sống có chứa chúng nhƣ sữa chua, nem, tôm chua, dƣa cải… 1.1.2. Tác dụng của probiotic Probiotic hiện nay không chỉ có lợi cho con ngƣời mà còn đƣợc ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, sử dụng trong chăn nuôi gia súc, trong việc xử lý môi trƣờng. 1.1.2.1. Giảm nguy cơ tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa Trên thế giới mỗi năm thƣờng có vài triệu ngƣời chết vì tiêu chảy, thƣờng tập trung chủ yếu ở trẻ em của những nƣớc đang phát triển. Có khoảng 30% dân số ở những nƣớc phát triển bị tiêu chảy do thực phẩm (FAO/WHO, 2001) [66]. Probiotic có thể làm giảm đƣợc nguy cơ tiêu chảy do có khả năng ức chế các VK gây bệnh đƣờng ruột, cạnh tranh chỗ trú đóng với VK gây bệnh bằng cách cản chúng bám dính vào thành ruột, tiết ra các enzyme hỗ trợ quá trình tiêu hóa nên có thể làm giảm nguy cơ các triệu chứng rối loạn về tiêu hóa, tiêu chảy (FAO/WHO, 2001; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [66],[81],[103]. 4 1.1.2.2. Giảm nguy cơ nhiểm Helicobacter pylori Helicobacter pylori là một loại VK gram âm gây viêm dạ dày, có thể dẫn đến loét và ung thƣ dạ dày. Các thí nghiệm in vitro và thử nghiệm trên động vật đã xác minh rằng VK lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và làm giảm hoạt tính của enzyme urease, một enzyme cần cho Helicobacter pylori để thích nghi với điều kiện axit của dạ dày (FAO/WHO, 2001) [66]. Kabir và cs (1997) đã chứng minh đƣợc L. salivarius có khả năng ức chế Helicobacter pylori [76]. Michetti và cs (1999) cũng phát hiện chủng L. johnsonii La1 cũng có khả năng ức chế Helicobacter pylori ở ngƣời [93]. 1.1.2.3. Ngăn ngừa ung thư Probiotic có thể làm giảm các nguy cơ về ung thƣ (FAO/WHO, 2001; Saikali và cs, 2004; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [66],[103],[81],[108]. Một số vi khuẩn đƣờng ruột có thể tạo ra các chất gây ung thƣ (carcinogen) nhƣ các nitrosamine, sự có mặt của probiotic sẽ gây ức chế sự tăng trƣởng của các VK này và do đó làm giảm đƣợc khả năng ung thƣ (FAO/WHO, 2001) [66]. Nhóm của Saikali và cs (2004) và nhóm của Mongkol và cs (2009) đã phát hiện sữa lên men sống có chứa probiotic có thể giảm nguy cơ ung thƣ ruột kết (colon cancer) [94],[108]. Theo nghiên cứu của Yu và Li (2016) một ứng dụng lâm sàng của chế phẩm sinh học đã cho thấy các chủng probiotic có thể làm giảm tỷ lệ viêm sau phẫu thuật ở bệnh nhân ung thƣ và nghiên cứu đã kết luận các sản phẩm probiotic đƣợc sử dụng an toàn và giúp cải thiện sức khỏe của vật chủ, một số chủng probiotic còn có thể đƣợc sử dụng để hỗ trợ ngăn ngừa và điều trị ung thƣ [124]. Các nghiên cứu trên dòng tế bào cũng nhƣ trên mô hình động vật và cơ thể ngƣời của Motevaseli và cs (2017) cho thấy probiotic có tác dụng làm giảm xâm lấn và di căn của tế bào ung thƣ [95]. 1.1.2.4. Ổn định hệ vi sinh vật trong đường niệu - sinh dục Chi Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong việc chống lại mất cân bằng và nhiễm trùng đƣờng sinh dục và niệu đạo. Do có khả năng sinh axit lactic làm giảm pH âm đạo và sinh một số chất kháng khuẩn khác nên chúng có thể ức chế một số VSV gây nhiễm trùng đƣờng âm đạo (FAO/WHO, 2001) [66]. 1.1.2.5. Kích thích hệ miễn dịch tự nhiên Bên cạnh chức năng ức chế các VK gây bệnh đƣờng ruột và ổn định hệ VSV đƣờng ruột, VK probiotic còn có khả năng kích thích miễn dịch. Hệ thống miễn dịch tự nhiên của cơ thể có các tế bào đại thực bào (Macrophage), tế bào trung tính (neutrophil), tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK, gồm có tế bào T gamma và T delta). Chúng là hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể bằng cách tiêu diệt tế bào lạ xâm nhập và trình diện kháng nguyên. Sự xâm nhập của VK lactic không gây bệnh cho cơ thể nhƣng lại kích 5 thích hoạt động của các tế bào này, từ đó tăng cƣờng đƣợc hoạt động miễn dịch. Sự có mặt của VK lactic còn có thể kích thích sản xuất kháng thể IgA (FAO/WHO, 2001) [66]. 1.1.2.6. Chức năng dinh dưỡng và hỗ trợ tiêu hóa VK lactic trong đƣờng ruột tạo ra một số vitamin nhƣ thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, Vitamin B12, …; tạo ra enzyme có lợi nhƣ lactase; giải phóng các amino axit tự do, các axit béo mạch ngắn (Lee và Salminen, 2009) [81]. Ngoài ra, sự có mặt của VK lactic trong các sản phẩm lên men cũng làm tăng giá trị dinh dƣỡng của chúng. Các sản phẩm nhƣ sữa chua, thịt lên men chua (nem, xúc xích…) dễ tiêu hơn và kích thích đƣợc vị giác, tạo cảm giác ngon miệng. Đối với những ngƣời thƣờng bị chứng không dung nạp lactose (lactose intolerant) thì enzyme lactase của VK lactic sẽ giúp họ tiêu hóa đƣờng này dễ dàng hơn. 1.1.2.7. Giảm hấp thu cholesterol và lượng cholesterol huyết thanh Hàm lƣợng cholesterol trong huyết thanh ảnh hƣởng rất lớn đến các bệnh về tim mạch. Nếu hàm lƣợng này cao hơn so với mức bình thƣờng thì ngƣời bệnh có nhiều nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và béo phì. Việc sử dụng các sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu (Liong và Shah, 2005; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [81],[84],[103]. Liong và Shah (2005) trong thử nghiệm in vitro đã nhận thấy có sự liên kết giữa cholesterol và tế bào một số chủng Lactobacillus, do đó gây ra sự loại bỏ cholesterol [84]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.2.1. Khái niệm vi khuẩn lactic VK lactic là những VK tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic trong quá trình lên men carbonhydrate (Dũng Nguyễn Lân, 1983; Prescott và cs, 2002) [3],[104]. Là những VK gram dƣơng, bất động, không sinh bào tử, catalase và oxydase âm tính. Khả năng sinh tổng hợp những hợp chất cần cho sự sống là rất yếu, nên chúng là những VSV đa khuyết dƣỡng đối với nhiều amino acid, nhiều loại vitamin…, không có khả năng tổng hợp nhân hem của porphyrine, chúng không có cytochrome. Nhiều loài trong chúng là những VK kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí và có khả năng tồn tại cả hiếu khí cũng nhƣ kỵ khí. Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm VK lactic, gồm khoảng 80 loài với mức độ khác nhau rất nhiều về hình thái, đặc điểm sinh hóa và sinh lý. Sự không đồng nhất thể hiện ở khoảng tỉ lệ mol G+C rất rộng, từ 32-55% (Prescott và cs, 2002) [104]. Tuy nhiên, chúng vẫn đƣợc chấp nhận trong một chi thống nhất theo định nghĩa của chi, về cơ bản là những VK lactic hình que. 6 Theo Abbaszadeh và cs (2015), các VK lactic nhƣ L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei và Bifidobacterium bifidum có khả năng ức chế sự phát triển của một số loại nấm gây hại thông thƣờng nhƣ A. niger, A. flavus, A. parasiticus và P. chrysogenum [39]. Arasu và cs (2016) đã nghiên cứu tiềm năng probiotic của VK lactic và trong đó L. plantarum đã thu hút đƣợc nhiều nhà nghiên cứu vì ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế nhƣ khả năng chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ và chống béo phì [45]. Nghiên cứu của Veron và cs (2017) cho thấy 17 chủng VK lactic đƣợc phân lập từ các loại trái cây O. ficus-indica mọc ở các vùng khô cằn từ Argentina có tiềm năng probiotic. Các đặc tính probiotic đƣợc kiểm tra có khả năng chống chịu trong đƣờng tiêu hóa, tính chất bề mặt tế bào và hoạt tính kháng khuẩn [122]. Bên cạnh đó chúng cũng ảnh hƣởng đến tính chất của nƣớc ép lên men. Theo nghiên cứu của Sandes (2017), bê mới sinh ra dễ bị một số VSV gây bệnh niêm mạc. Vì thế sử dụng VK lactic có tính chất probiotic làm thực phẩm bổ sung trong chăn nuôi giúp cải thiện sức khỏe, tăng hiệu suất sinh sản vật nuôi và giảm nguy cơ nhiễm trùng niêm mạc [110]. Nghiên cứu của Abushelaibi và cs (2017) đã xác định tính chất probiotic và lên men của các chủng VK lactic phân lập từ sữa lạc đà. Công trình này đã nghiên cứu các tính chất của LAB về sinh lý, khả năng tự kết dính, đồng kết dính, tính kỵ nƣớc, chịu acid và muối mật, loại bỏ cholesterol, sinh tổng hợp exopolysaccharide và khả năng sinh kháng sinh. Sự biến đổi của các yếu tố trong quá trình lên men nhƣ sự phát triển tế bào, sự biến đổi pH, sự thủy phân protein cũng đƣợc nghiên cứu trong công trình này [40]. 1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic VK lactic có khả năng lên men đƣờng tạo axit lactic trong môi trƣờng kỵ khí làm cho pH giảm xuống dƣới 5, ức chế đƣợc các VSV khác. Vì vậy, chúng đƣợc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, trong chế biến thức ăn gia súc, chế biến sữa, các sản phẩm thực phẩm len men lactic và lên men thu nhận axit lactic ở quy mô công nghiệp. 1.2.2.1. Sản xuất axit lactic Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da. Nguyên liệu chính dùng để sản xuất axit lactic là rỉ mật, đƣờng, tinh bột đã đƣợc đƣờng hoá. Nồng độ đƣờng sử dụng cho quá trình lên men lactic từ 8% đến 20%. Ngoài ra còn sử dụng một số thức ăn bổ sung chứa đạm hữu cơ và các loại chất sinh trƣởng (nhƣ mầm đại mạch, cám, cao ngô…). Khả năng sinh axit lactic rất khác nhau tùy theo chủng. Trong sản xuất công nghiệp axit lactic thì chỉ có những loài lên men đồng hình là có giá trị. Hƣớng nghiên cứu hiện nay trong việc sản 7 xuất axit lactic thông qua lên men lactic là tuyển chọn dòng sinh axit lactic cao (Kaloyan và cs, 2008; Cock và Stouvenel, 2006) [63], [77] tối ƣu hóa khả năng lên men lactic, lên men lactic với nguồn nguyên liệu rẻ tiền (Ohkouchi và Inoue, 2006) [99] và gây biến đổi di truyền để thu đƣợc các chủng sản xuất cao. 1.2.2.2. Bảo quản và chế biến thực phẩm Nhờ khả năng sinh axit lactic làm hạ pH môi trƣờng và sinh một số chất kháng khuẩn khác nhƣ H2O2, bacteriocin nên VK lactic có thể ức chế các VK làm hỏng thực phẩm (Cho và Hyung Ki Do, 2006; Ljubisa, 2006) [60],[87]. Mặt khác quá trình lên men lactic làm tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm. Các loại thực phẩm lên men lactic thƣờng gặp nhƣ sữa chua, các loại thịt, hải sản lên men, rau quả và nƣớc ép quả muối chua. Thông thƣờng để ức chế sự phát triển của VK gây thối ngay từ đầu và tạo điều kiện cho VK lactic phát triển, ngƣời ta thƣờng bổ sung và nguyên liệu một lƣợng NaCl khoảng 3-5%. Ở Việt Nam có khá nhiều sản phẩm loại này nhƣ tôm chua, nem chua, rau quả muối chua … Đặc biệt, trong ngành công nghiệp sữa, VK lactic có vai trò rất quan trọng. Chúng là tác nhân chính trong quá trình sản xuất các sản phẩm sữa lên men có giá trị dinh dƣỡng cao, dễ bảo quản. Hai chủng S. thermophilus và L. delbrueckii subsp. bulgaricus đƣợc dùng để sản xuất sữa chua và một số loại phomat. Lactococcus lastic cũng đƣợc dùng trong sản xuất phomat. Một số chủng Leuconostoc có liên quan đến quá trình chín và quá trình lên men ban đầu của sữa chua và phomat (Prescott và cs, 2002; Axelsson, 2004) [49],[104]. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu tuyển chọn các chủng VK lactic mới để sản xuất sữa chua thông thƣờng và sữa chua từ đậu nành (Park và Oh, 2007) [102]. 1.2.2.3. Ủ chua thức ăn gia súc Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn nuôi. Thức ăn khi ủ không những giảm đƣợc sự tổn thất giá trị dinh dƣỡng mà còn bổ sung nhiều loại vitamin do VSV tổng hợp. Phƣơng pháp này dựa vào sự chuyển hóa đƣờng có sẵn trong nguyên liệu của VK lactic. Nguyên liệu đƣợc ủ thành đống, hoặc chất vào các hố sâu trong đất. Các VSV có sẵn trong nguyên liệu sẽ phát triển dần lên. Đầu tiên là nhóm VK hiếu khí phát triển mạnh sử dụng hết lƣợng oxy có trong đống nguyên liệu, làm tiêu thụ phần thức ăn dễ tiêu và phân giải protein của nguyên liệu. Kết quả là tạo điều kiện cho VK lactic phát triển, làm tích lũy dần axit lactic. Bên cạnh đó, VK lactic còn ứng dụng trong tách chiết carotenoids. Theo nghiên cứu của (Armenta & cộng sự, 2002) lên men lactic để chiết xuất carotenoids tự nhiên 8 từ các lớp vỏ cứng là một phƣơng pháp đơn giản và thân thiện với môi trƣờng để đạt đƣợc hiệu quả cao [47]. 1.2.3. Lactobacillus fermentum L. fermentum thuộc nhóm VK lactic, tế bào có dạng hình que, kỵ khí tùy ý, Gram dƣơng (Hình 1.1). Thƣờng đƣợc phân lập tự nội tại đƣờng ruột hoặc các sản phẩm lên men từ sữa, bột bánh mì, nguyên liệu thực vật lên men. VK phát triển tốt trong môi trƣờng acid pH 5,5-6,2, chúng tồn tại đƣợc ở cả pH dƣới 5 nên ức chế sự hoạt động của VK gây thối. Hình 1.1. Vi khuẩn Lactobacillus fermentum [130] Nhiệt độ phát triển tối ƣu từ 30 - 40oC, phù hợp với thân nhiệt cơ thể ngƣời. Lƣợng axit lactic sinh ra vừa có tác dụng hoàn thiện hƣơng vị đồng thời có tác dụng bảo quản cho sản phẩm. Bên cạnh đó, VK lactic có tiềm năng probiotic lớn, có chức năng probiotic có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ động vật. Hơn nữa, VK lactic trong đƣờng ruột tạo ra một số vitamin nhƣ thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, vitamin B12 … tạo ra enzyme có lợi nhƣ lactase, giải phóng các amino acid tự do, các axit béo mạch ngắn (Lee và Salminen, 2009; Parvez1 và cs, 2006) [81],[103]. Ngoài ra L. fermentum còn có khả năng chống chịu trong dịch dạ dày, dịch ruột non, kháng các VSV gây bệnh, tăng cƣờng hệ miễn dịch, tăng khả năng kháng oxy hóa (Gotteland và cs, 2006; Garcia và cs, 2009; Garcia và cs, 2012) [67],[68],[69].