Tài liệu Phân lập và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ P10 của virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------- PHẠM THỊ VÂN PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------- PHẠM THỊ VÂN PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM XUÂN HỘI GS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA Hà Nội - 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN ......................................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚA ............................................ 3 1.2. BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDV .................................. 5 1.2.1. Bệnh lúa lùn sọc đen ......................................................................5 1.2.2. Virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam .............................................11 1.3. ĐẶC ĐIỂM ĐOẠN GEN P10 VÀ PROTEIN VỎ NGOÀI SRBSDV.. 15 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÁT HIỆN SRBSDV ...... 17 1.5. KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG THỰC TIỄN..................... 18 1.5.1. Giới thiệu chung về kháng thể đa dòng .......................................18 1.5.2. Một số ứng dụng của kháng thể đa dòng .....................................21 CHƢƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................24 2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................................ 24 2.1.1. Vật liệu thí nghiệm.......................................................................24 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................24 2.1.3. Thiết bị .........................................................................................25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 25 2.2.1. Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR ......................25 2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose ......................................................26 2.2.3. Ghép nối DNA bằng enzyme DNA ligase ...................................26 2.2.4. Biến nạp vi khuẩn E. coli .............................................................27 2.2.5. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn................................27 2.2.6. Tinh sạch DNA từ gel agarose .....................................................28 2.2.7. Nhân dòng sản phẩm PCR ...........................................................29 2.2.8. Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn .............................29 2.2.9. Giải trình tự nucleotide các đoạn DNA .......................................30 2.2.10. Điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa SDS ..............31 2.2.11. Nuôi cấy E. coli và chuẩn bị dịch chiết tế bào ...........................32 2.2.12. Tinh sạch protein tái tổ hợp qua cột Ni2+ agarose .......................32 2.2.13. Định lƣợng protein bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại (A280) ........................................................................................................33 2.2.14. Gây kháng thể đa dòng trên chuột bạch .....................................33 2.2.15. Phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) ..............33 2.2.16. Tinh sạch kháng thể IgG bằng cột sắc kí protein A-sepharose ..34 2.2.17. Phƣơng pháp Dot Blot ...............................................................35 2.2.18. Phƣơng pháp ELISA ..................................................................36 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN P10 TỪ cDNA CỦA PHÂN ĐOẠN S10 . 37 3.1.1. Nhân bản đoạn gen P10 bằng phản ứng PCR ..............................37 3.1.2. Ghép nối đoạn gen P10 vào vector pGEMT ................................39 3.1.3. PCR kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp ...........................40 3.1.4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pGEMT mang đoạn gen P10 ..........41 3.1.5. Giải trình tự đoạn gen P10 của chủng SRBSDV .........................44 3.2. BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP P10 ................. 45 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện pET28a mang đoạn gen P10 ...............45 3.2.2. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp P10 ..............................52 3.3. GẤY KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG PROTEIN P10 ..................... 58 3.3.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch ......................................58 3.4. PHÁT HIỆN VIRUS SRBSDV BẰNG KHÁNG THỂ TINH SẠCH .... 63 3.4.1. Đánh giá độ nhạy của kháng thể ..................................................63 3.4.2. Phát hiện SRBSDV bằng kĩ thuật ELISA ....................................64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................66 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................67 PHỤ LỤC .................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội và GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa là những ngƣời thầy đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian hoàn thành luận văn tại Bộ môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 03 tháng 11 năm 2014 Học viên Phạm Thị Vân DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Các cặp oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2: Thành phần phản ứng ghép nố i Bảng 3: Thành phần phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT Bảng 4: Enzyme cắ t giới ha ̣n và trình tự nhận biết đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong đề tài Bảng 5: Thành phần gel SDS-PAGE 12 % Bảng 6: Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 và pET28a Bảng 9: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pET28a/P10 Bảng 10: Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp Bảng 11: Kết quả đo OD492 thử độ đặc hiệu của kháng thể bằng phản ứng ELISA Bảng 12: Kết quả đo OD492 của phản ứng ELISA xét nghiệm SRBSDV trên mẫu rầy. DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1: Triệu chứng cây lúa bị nhiễm bệnh LSĐ Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền SRBSDV Hình 3: Cấ u trúc vỏ hình đa diện icosahedral kiể u T=13 của chi Fijivirus Hình 4: Tinh thể virus và phân tử virus SRBSDV phát hiện bằng kính hiển vi điện tử trên tế bào cây lúa bị bệnh LSĐ tại Việt Nam năm 2009 Hình 5: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 trên gel agarose 1% Hình 6: Sơ đồ vector pGEMT và các vị trí enzyme giới hạn Hình 7: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào tế bào E. coli Hình 8: PCR kiể m tra mô ̣t số khuẩ n la ̣c trắ ng Hình 9: PCR kiểm tra khuẩn lạc với thí nghiệm nhân đoa ̣n gen P10 Hình 10: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEMT/P10 Hình 11: Điê ̣n di sản phẩ m cắ t giới ha ̣n bằ ng BamHI/XhoI Hình 12: Sơ đồ vector pET28a và vi ̣trí ghép nố i đoa ̣n gen P10 Hình 13: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào E. coli DH5α Hình 14: Điện di sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv Hình 15: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid pET28a/P10 Hình 16: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pET28a/P10 Hình 17: Biến nạp vector pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli Rossetta Hình 18: Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn Hình 19: Kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện khác nhau về nhiệt độ và thời gian Hình 20: Điện di sản phẩm sau tinh sạch dịch chiết tế bào Hình 21: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của kháng huyết thanh bằng thẩm tách miễn dịch Hình 22: Sắc ký huyết thanh chuột sau khi gây miễn dịch qua cột protein Asepharose Hình 23: Điện di SDS- PAGE kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể Hình 24: Phân tích Western blotting sử dụng kháng thể tinh sạch (1:2000) Hình 25: Thử độ nhạy của kháng thể tinh sạch Hình 26: Thử độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch (1:5000) BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate bp Cặp bazơ CBB Coomassie Brillant Blue cDNA DNA bổ sung dNTPs Deoxy triphosphates nucleotides dsRNA Axit ribonucleotide sơ ̣i đôi E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA Kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme- linked immunosorbent assay) EtBr Ethidium Bromide IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton LB Môi trƣờng Luria Bertani LSĐ Lùn sọc đen ORF Khung đọc mở (open reading frame) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide SRBSDV Virus lúa lùn so ̣c đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus) TAE Tris base – Acetic - EDTA TBE Tris base – Axit Boric – EDTA TEMED N,N,N'N'-Tetramethyl-Ethylenediamine MỞ ĐẦU Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực lâu đời nhất và cũng là cây ngũ cốc quan trọng cung cấp nguồn lƣơng thực cho khoảng 2/3 dân số thế giới. Ở nƣớc ta, cây lúa đã trở thành cây lƣơng thực chủ lực liên quan đến việc làm và thu nhập của khoảng 80% số hộ nông dân. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, ngành trồng lúa đang phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, nhất là thiên tai, biến đổi khí hậu, đặc biệt là dịch bệnh xảy ra thƣờng xuyên đã ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo. Do các đặc điểm về địa lý và khí hậu, Việt Nam là giao lộ các luồng di chuyển của nhiều loại côn trùng, trung gian truyền dịch; do đó các bệnh virus có diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn. Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, bệnh lúa lùn sọc đen (LSĐ) đã bùng phát với diện tích nhiễm bệnh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng. Đến tháng 10/2010 bệnh đã phát triển và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới 24.000 ha. Bằng phƣơng pháp sinh học phân tử, bƣớc đầu nguyên nhân gây bệnh lạ nêu trên đã đƣợc xác định là do virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus - SRBSDV). Đây là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus – 2, thuộc họ Reoviridae. Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự tƣ̀ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi. Phân đoạn S10 có kích thƣớc nhỏ nhất, mã hóa một protein vỏ ngoài virus và có độ bảo thủ cao nên thƣờng đƣợc chọn trong các nghiên cứu nhằm phát hiện các virus trong chi Fijivirus. Việc chẩn đoán cây bị nhiễm SRBSDV hiện nay đều đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp RT-PCR nhằm phát hiện phân đoạn RNA sợi đôi của virus có trong mẫu bệnh cây. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí tốn kém đồng thời không thuận tiện cho việc tiến hành với điều kiện ngoài đồng ruộng. Việc xác định tác nhân gây bệnh mất nhiều thời gian, chi phí cao đã dẫn tới khó khăn 1 trong việc ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh làm thiệt hại nhiều hecta sản lƣợng lƣơng thực. Vì vậy, việc sớm tìm ra phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh là việc làm vô cùng quan trọng và cấp bách hiện nay. Với mục đích biể u hiê ̣n đoa ̣n gen P10 mã hoá protein vỏ virus làm tiề n đề cho viê ̣c phát triể n kit chẩ n đoán nhanh , chính xác bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng Nam dƣ̣a trên phƣơng pháp ELISA , chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lâ ̣p và biể u hiêṇ gen mã hoá protein vỏ P10 của virus gây bệnh lúa lùn so ̣c đen ở Việt Nam” nhằm phục vụ công tác chẩn đoán sớm bê ̣nh ha ̣i trên đồ ng ruô ̣ng. 2 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚA Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng nông nghiệp, dẫn đến sản lƣợng nông nghiệp không ổn định và gây ra tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào hết. Trong sản xuất nông nghiệp có khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ cây ngô, đậu tƣơng… và khoảng 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1). Trong số các virus hại lúa, ngoài Rice hoja blanca virus (một ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một luteovirus, phân bố tại châu Âu) và Rice stripe necrosis virus (một furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á. Tuy nhiên, chỉ có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến trên lúa là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời [7, 11-13, 16]. Nghề trồng lúa ở Việt Nam đã và đang phải đối mặt với các đợt dịch bệnh virus diễn ra liên tiếp và đang diễn biến rất phức tạp. Trong khi dịch virus vàng lùn và lùn xoắn lá ở miền Nam chƣa kết thúc thì các tỉnh miền Bắc và miền Trung đang phải đối mặt với dịch SRBSDV. Vì vậy, định hƣớng nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hơi. Nghiên cứu đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản xuất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả. Trong khi đó , nghiên cứu dài hơi tập trung vào khâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác, nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây bệnh dựa trên công 3 nghệ gen. Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng giống kháng rầy, luân canh… Gần đây, trƣớc tình hình gây h ại và diễn biến phát dịch bệnh virus rất phức tạp, Nhà nƣớc đã quan tâm nhiều đến việc đầu tƣ nghiên cứu và áp dụng các thành tựu khoa học và công nghệ trên thế giới trong việc phát hiện và phòng chống bệnh virus lúa, vì vậy đã nâng cấp một bƣớc đáng kể năng lực trong nghiên cứu và phòng chống virus hại lúa ở Việt Nam. Một số cơ quan nghiên cứu nhƣ Viện Bảo vệ thực vật và Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn xoắn lá; đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho virus lúa cỏ (Rice grassy stunt virus-RGSV), lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus-RRSV), lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus-RBSDV), lúa sọc (Rice stripe virus-RSV), tungro (Rice tungro spherical virus-RTSV) và lùn sọc đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus-SRBSDV). Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoắn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật. Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng công nghệ gen nhƣ công nghệ RNAi. Hiện Viện Di truyền đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn và lùn xoắn lá lúa trên Ngân hàng gen; đã xác định các gen quan trọng và các đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ); đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợc một số cây chuyển gen. Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền đã sản xuất đƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 loại virus gây bệnh trên lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: virus lúa cỏ (RGSV), lùn xoắn lá (RRSV), lùn sọc đen (RBSDV), lúa sọc (RSV), tungro (Rice tungro spherical virus-RTSV), tungro (Rice tungro bacilliform virus RTBV), bệnh lúa lùn 4 (Rice dwarf virus-RDV) và vết u lùn lúa (Rice gall dwarf virus-RGDV) với số lƣợng đủ cho hợp tác nghiên cứu và chẩn đoán. Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là đáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virus hiện nay, đặc biệt là SRBSDV. Vì vậy các nghiên cứu về virus hại lúa cần phải nâng lên một bƣớc, tập trung vào các nghiên cứu chuyên sâu mang tính chất dài hơi để giải quyết tận gốc căn nguyên nhƣ các nghiên cứu về bản chất phân tử, diễn biến phát dịch và các biện pháp kiểm soát dựa trên kỹ thuật phân tử nhƣ siêu biểu hiện gen, bất hoạt gen và đột biến. 1.2. BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDV 1.2.1. Bệnh lúa lùn sọc đen 1.2.1.1. Tình hình bệnh trên thế giới Bệnh lúa LSĐ là bệnh do virus lúa lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus-RBSDV) gây ra và đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1952 [27]. RBSDV đƣợc ghi nhận gây hại và gây thành dịch ở các nƣớc Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc. Đợt dịch bệnh đầu tiên ở Nhật bản đƣợc ghi nhận trên ngô vào những năm 1957 – 1961, rồi trên lúa và ngô những năm 1965 – 1967. Ở Trung Quốc dịch bệnh đã xảy ra vào năm 1963 và sau đó 1965 – 1967 trên lúa, ngô, lúa mì và đại mạch. Tỷ lệ bệnh RBSDV đạt cao điểm vào các năm 1975 và 1976 [22]. Ngoài những đợt cao điểm phát triển của bệnh kể trên thì bệnh lúa LSĐ thƣờng chỉ xuất hiện cục bộ và rải rác với tỷ lệ nhiễm thấp ở cả 3 nƣớc. Tại cùng một khu vực bị bệnh thì RBSDV thƣờng gây hại nghiêm trọng trên ngô và ít nghiêm trọng hơn trên lúa cũng nhƣ các cây trồng khác. Một số nơi nhƣ Tohuku, phía bắc Nhật Bản, virus này chỉ gây hại trên ngô mà không gây hại trên lúa. Chỉ có một vùng nhỏ ở Hokkaido, phía Bắc của Tohoku, RBSDV gây hại cả trên ngô và trên lúa nhƣng với tỷ lệ nhiễm thấp [18]. Tại Nhật Bản, các nhà nghiên cứu đã phát hiện có mối quan hệ chặt chẽ giữa sự tăng cao tỷ lệ nhiễm bệnh LSĐ với sự tăng mạnh của các diện tích gieo cấy lúa sớm. Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm bệnh giảm mạnh sau năm 1968 và nguyên nhân chính 5 là do sự sụt giảm đáng kể các diện tích gieo cấy lúa mì và đại mạch. Ở Trung Quốc, sự bùng phát dịch những năm 1963 – 1967 đƣợc cho là do sự gia tăng đột biến các diện tích trồng lúa mì [33]. Sau năm 1970, sự sụt giảm đáng kể tỷ lệ bệnh LSĐ lại đƣợc cho là do sự gia tăng các diện tích gieo cấy lúa 2 và 3 vụ, là nguyên nhân làm giảm đáng kể diện tích trồng lúa mì. Sự bùng phát các đợt dịch chính tại Nhật bản và Trung Quốc đã xảy ra cùng thời điểm và đƣợc cho là có liên quan đến nhau. Tuy hàng năm là hy hữu, song đã có những ghi nhận về sự dịch chuyển qua lại của rầy môi giới L. striatellus, giữa Nam Trung Quốc và Nhật Bản [19]. 1.2.1.2. Tình hình bệnh ở Việt Nam Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, mô ̣t bê ̣nh la ̣ (bê ̣nh lùn lu ̣i) đã xuấ t hiê ̣n trên diê ̣n rô ̣ng trên lúa mùa với tổ ng diê ̣n tić h nhiễm bê ̣nh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng. Cây bê ̣nh bi ̣lùn ma ̣nh , lá xanh đâ ̣m , nhiề u lá bi ̣xoắ n vă ̣n, sau biế n vàng , trỗ không thoát . Triê ̣u chƣ́ng cây bê ̣nh khá giố ng với bê ̣nh lùn xoắ n lá ta ̣i miề n Nam. Tấ t cả các giố ng gieo trồ ng ta ̣i Nghê ̣ An (TH3-3, Nhị ƣu 838, Bio 404, Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hƣơng thơm ) đều bị nhiễm bệnh (Báo Nông nghiệp Việt Nam (NNVN), ngày 7/9/2009). Cho tới giƣ̃a tháng 9, mô ̣t số điạ phƣơng ta ̣i miề n Bắ c nhƣ Nam Đinh ̣ , Thái Bình cũng thông báo dịch bệnh tƣơng tự (Báo NNVN, ngày 14/9/2009). Báo cáo tại cuộc họp do bô ̣ Nông nghiê ̣p và Phát triể n nông thôn (NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9/2009 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo vệ thực vật đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc. Cục đã phát hi ện 5 tỉnh có diện tích lúa nhiễm bệnh gồ m Nghệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh Bình với trên 13.000 ha lúa nhiễm bệnh, trong đó hơn 8.000 ha bị bệnh rất nặng và có khả năng mất trắng (Báo NNVN, ngày 24/9/2009). Để làm rõ nguyên nhân gây bê ̣nh t ại Nghệ An, đă ̣c biê ̣t khi bê ̣nh đang đƣơ ̣c liên tu ̣c báo cáo xuấ t hiê ̣ n ta ̣i nhiề u tin ̉ h miề n Bắ c , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đã tổ chƣ́c hô ̣i thảo khẩ n cấ p về nguyên nhân gây bê ̣ nh ta ̣i Nghê ̣ An do đích thân Bộ trƣởng Cao Đƣ́c Phát chủ trì với sƣ̣ tham gia của T.S. Rogelio- chuyên gia về bê ̣nh 6 virus lúa của Viê ̣n N ghiên cứu lúa quố c tế (IRRI) và các chuyên gia đầ u ngành trong nƣớc . Dƣ̣a chủ yế u vào triê ̣u chƣ́ng quan sát bê ̣nh trên thƣ̣c điạ và ý kiế n chuyên gia , hô ̣i nghi ̣kế t luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i ta ̣i Ng hê ̣ An là do 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn/ lùn xoắn lá giố ng nhƣ ở miề n Nam với vector truyề n bê ̣nh là rầ y nâu . Ngày 8/9/2009 Bộ NN&PTNT đã có công điê ̣n số 31 (Số : 31/CĐ-BNN- BVTV) để cảnh giác các địa phƣơng miền Bắ c về dich ̣ bê ̣nh vàng lùn, lùn xoắn lá và biện pháp phòng trừ. Tiế p theo, ngày 23/9/2009, Bô ̣ NN & PTNT la ̣i tiế p tu ̣c ho ̣p khẩ n về nguyên nhân gây bê ̣nh . Dƣ̣a trên kế t quả ELISA trên các mẫu rầ y nâu thu thâ ̣p đƣơ ̣c thƣ̉ nghiê ̣m ta ̣i IRRI và Trung tâm Bảo vê ̣ thƣ̣c vâ ̣t phía Nam , Bô ̣ Nông nghi ệp và Cục Bảo vệ thực vật kết luận nguyên nhân gây bệnh lúa lùn lụi ở miền Bắc là do 2 virus vàng lùn và lùn xoắn lá và do rầ y nâu lan truyề n (Báo NNVN ngày 24/9/09). Trong tháng 9 và 10 năm 2009, các hoa ̣t đô ̣ng nghiên cƣ́u nhằ m xác đ ịnh tác nhân gây bê ̣nh đã đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n tích cƣ̣c ta ̣i các cơ quan nhƣ Viê ̣n B ảo vệ thực vật, Cục Bảo vệ thực vật, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội và IRRI. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc tác nhân g ây bê ̣nh lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía Bắc trong vụ mùa 2009 là do SRBSDV. Ngay sau khi tác nhân gây bệnh đƣợc xác định, Bộ NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch LSĐ do thứ trƣởng Bùi Bá Bổng làm trƣởng ban chỉ đạo. Trong vụ xuân năm 2010, theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, tính tới tháng 6, bệnh LSĐ đã phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành với tổng diện tích bị nhiễm tới 29.000 ha. Các tỉnh bị nhiễm bệnh bao gồm: + Bắc Bộ: 20 tỉnh (Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Kạn, Bắc Ninh, Hà Nam, Hải Dƣơng, Hải Phòng, Hòa Bình, Hƣng Yên, Lai Châu, Lào Cai, Nam Định, Ninh Bình, Phú Thọ, Quảng Ninh, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Điện Biên, Thái Nguyên). + Bắc Trung Bộ: 5 tỉnh (Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế). 7 + Nam Trung Bô :̣ 3 tỉnh (Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa). Trong vụ mùa năm 2010, cũng theo thông báo của Cục Bảo vệ thực vật, tính đến tháng 10, bệnh LSĐ vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễm tính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy là 1.700 ha. Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm: + Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Giang, Hải Dƣơng, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Hƣng Yên, Cao Bằng và Hà Nam. + Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị, Hà Tĩnh và Thanh Hóa. + Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng. Từ năm 2011 – 2013, bệnh dịch đã có dấu hiệu tạm lắng, chỉ còn xuất hiện cục bộ ở một số thửa ruộng đơn lẻ. Tuy nhiên, nguy cơ bùng phát dịch vẫn luôn tiềm ẩn và đe dọa sản lƣợng thu hoạch lúa gạo của bà con nông dân các các tỉnh miền Bắc và miền Trung. 1.2.1.3. Đặc điểm triệu chứng bệnh lúa lùn sọc đen Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm SRBSDV rất giống với biểu hiện của bệnh LSĐ do RBSDV gây ra. Triệu chứng của lúa nhiễm bệnh bao gồm: cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân. Các u sáp này đƣợc hình thành do sự phát triển vƣợt trội cả về số lƣợng và kích thƣớc của mô mạch dẫn nhựa. Khi cây còn non, gân chính trên bẹ lá cũng bị sƣng phồng. Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thƣờng nảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định. Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều u sáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân). Cây lúa bị bệnh nặng không trổ bông đƣợc hoặc trổ bông không thoát, hạt thƣờng bị đen. 8 (Lùn, xoắn chót lá, nhăn giữa lá, nhăn chót lá, xoắn lá, xoắn lá nõn) (Vàng lá xoắn, trắng mép lá, rách mép lá, đen hạt, gấp lá, nghẹn lá) (Rễ ngƣợc, nhánh phụ, sọc phiến, sọc bẹ, sọc than, phồng tràng hạt) Hình 1: Triệu chứng cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen 1.2.1.4. Vector truyền bệnh Vector chính truyền SRBSDV là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera). Cả rầy non và rầy trƣởng thành đều có khả năng truyền bệnh. Rầy lƣng trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnh đến khi chết. Một nghiên cứu về phƣơng thức lan truyền bệnh LSĐ đã đƣợc tiến hành nhằm đánh 9 giá khả năng lan truyền SRBSDV qua vector đã đƣ ợc thực hiện trên 3 loài rầy là rầy lƣng trắ ng (Sogatella furcifera), rầ y nâu (Nilaparavata lugens) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus). Kế t quả cho thấ y cả rầ y lƣng trắ ng và rầ y nâu nhỏ đề u có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang lúa với hiệu quả truyền rất cao (100 % cây nhiễm bê ̣nh với chỉ 3 - 4 rầ y/cây). Tuy nhiên, chỉ có rầy lƣng trắng mới có khả năng truyề n SRBSDV tƣ̀ lúa sang ngô . Nghiên cƣ́u này cũng cho thấ y rầ y nâu không thể truyề n đƣơ ̣c SRBSDV. Rầy cánh ngắn Rầy cánh dài Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lƣng trắng Sogatella furcifera đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định các giai đoạn phát triển của bệnh cũng nhƣ tìm phƣơng pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất. Bằng phƣơng pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định đƣợc sự có mặt của SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S. furcifera, bao gồm: giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn. S. furcifera khi đã nhiễm SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn lại. Tuy nhiên, SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng. Mỗi cá thể rầy S. furcifera mang SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là 87-90 cây lúa. Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lƣng trắng truyền virus cho cây lúa non tƣơng ứng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo từng giai đoạn phát triển của rầy. Kết quả nghiên cứu cũng chứng tỏ giai đoạn lúa non là giai đoạn dễ bị nhiễm SRBSDV từ rầy nâu lƣng trắng nhất. 10