Tài liệu Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa và khảo sát khả năng ứng dụng trong y học (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THANH THẢO Công trình được hoàn thành tại: ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM, TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Cát Đông 2. GS.TS. Nguyễn Văn Thanh Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa và khảo sát khả năng ứng dụng trong y học Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Vinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số chuyên ngành: 62424001 Phản biện 3: TS. Đái Thị Xuân Trang Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương Phản biện độc lập 2: TS. Đái Thị Xuân Trang TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại ……………………………………………………………….. ……………………………………………………………….. vào lúc giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh năm 2016 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất chống oxi hóa ở khu vực phía Nam 1. Mở đầu Chất chống oxi hóa (COXH) có vai trò quan trọng trong việc làm giảm 2. Khảo sát đặc điểm sinh chất chống oxi hóa của các chủng vi khuẩn nguy cơ mắc ung thư và bệnh tim mạch. Các chất này tác động thông qua 3. Đánh giá đặc điểm để ứng dụng làm probiotic và độc tính của các việc trung hòa hay dập tắt sự tấn công của các tác nhân oxi hóa lên các đại chủng phân tử quan trọng như ADN, protein, màng lipid. Hàng năm có rất nhiều 4. Đánh giá khả năng ứng dụng probiotic như nguồn cung cấp chất công trình nghiên cứu trên đối tượng là chất COXH để hiểu rõ hơn về cơ chống oxi hóa. chế hoạt động, tạo ra sản phẩm mới cũng như tìm kiếm các nguồn cung cấp 5. Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối làm nguyên liệu mới. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu được tiến hành với nguồn cung cấp probiotic cung cấp chất COXH. chất COXH từ thực vật. Các nguồn này hiển nhiên rất phong phú về khả năng cung cấp các chất COXH, nhưng chúng cũng là một dạng sản phẩm nông nghiệp, do đó sẽ ảnh hưởng đến quỹ đất cũng như chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu tố thời tiết, khí hậu. Việc sử dụng nguồn cung cấp chất COXH là vi khuẩn có một số ưu thế so với từ thực vật. Vi khuẩn có thể được lên men ở qui mô lớn với các cơ 2. Tính cấp thiết của đề tài Chất COXH được cung cấp từ thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc tổng hợp. Trong đó, vi sinh vật là nguồn cung cấp chất COXH tiềm năng vì có thể thu lượng sinh khối lớn trong thời gian ngắn, không cần nhiều quỹ đất, không chịu ảnh hưởng của điều kiện thời tiết…. Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn dưới dạng probiotic nhằm cung cấp chất rẻ tiền mà không sử dụng nhiều quỹ đất, cũng như không phụ thuộc một hiệu ứng có lợi cho sức khỏe đã có từ rất lâu, gần đây cùng với sự phát thời tiết, khí hậu. Vi khuẩn sản xuất chất COXH có thể được sử dụng qua triển của công nghệ sinh học, rất nhiều nghiên cứu cũng như sản phẩm đường tiêu hóa dưới dạng sinh khối sống, không qua chiết xuất, khi vào cơ probiotic đã ra đời, mang lại nhiều lợi ích về kinh tế và xã hội. Nhưng đến thể sẽ sản xuất hoạt chất tại chỗ do đó qui trình sản xuất chế phẩm sẽ đơn nay trong nước chưa có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn sinh chất giản hơn, thân thiện với môi trường và tránh được các vấn đề liên quan đến COXH cũng như việc sử dụng chúng như nguồn cung cấp chất COXH. Vì bảo quản, hấp thu trên đường tiêu hóa. Nhưng đến nay chưa có nhiều công vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn sinh chất COXH và khả năng ứng dụng là trình nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn làm nguồn cung cấp chất hướng tiếp cận mới về nguồn và phương phức cung cấp chất COXH so với COXH. cách thức truyền thống là chiết xuất từ thực vật hay tổng hợp. Do đó mục tiêu của luận án là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh chất COXH và khảo sát tiềm năng ứng dụng như probiotic cung cấp chất COXH. Các nội dung thực hiện cụ thể như sau: 1 3. Những đóng góp mới của luận án Đây là nghiên cứu đầu tiên về việc phân lập vi khuẩn sinh chất COXH cũng như sử dụng bào tử vi khuẩn làm nguồn cung cấp chất COXH tại Việt 2 Nam. Nghiên cứu này mở ra một hướng tiếp cận mới về nguồn và phương thức cung cấp chất COXH với những đóng góp mới cụ thể như sau - CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn sinh chất COXH giúp 2.1. Đối tượng cung cấp vật liệu sinh học cho hiện tại và tương lai. Vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất, cát và nước ở 13 tỉnh Trung và Nam Chứng minh khả năng sinh chất COXH và triển vọng ứng dụng trong bộ như Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Gia Lai, Khánh Hoà, Ninh y học của sáu chủng Bacillus. Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Tp. Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Tiền Giang, Khảo sát được quy trình lên men thu sinh khối bào tử ổn định với các Đồng Tháp, An Giang. thông số lên men phù hợp, sử dụng nguyên liệu có giá thành thấp, sẵn 2.2. Vật liệu có tại Việt Nam. Vi sinh vật và động vật thử nghiệm: chủng chuẩn ATCC do PTN Vi sinh Công nghệ Dược cung cấp, B. indicus HU36 sinh carotenoid do dự án 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 149 trang, mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 28 trang, vật Colorspore cung cấp, chuột nhắt trắng Swiss albino do viện Pasteur Nha liệt và phương pháp 28 trang, kết quả và bàn luận 76 trang, kết luận và kiến Trang cung cấp. nghị 2 trang. Luận án có 54 bảng, 14 hình, 2 sơ đồ, 5 đồ thị, 156 tài liệu Hóa chất: do Sigma, Merck cung cấp. tham khảo, gồm 10 tài liệu tiếng Việt, 146 tài liệu tiếng Anh, 20 phụ lục thể Môi trường: TSA, TSB do Himedia cung cấp, MHA do Merck cung cấp. hiện các kết quả thực nghiệm. Thiết bị: kính hiển vi BX41 (Olympus), máy luân nhiệt TCX3000 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các dạng oxi hoạt động: sự tạo thành các dạng oxi hoạt động, tác động của các dạng oxi hoạt động và các bệnh liên quan 1.2. Chất COXH: khái niệm, phân loại, vai trò của chất chống oxi hoá đối với sức khoẻ, nguồn thu nhận chất COXH, thực phẩm chức năng chứa chất COXH tại Việt Nam (Techne), máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300 (GE HealthCare), bể tán siêu âm Vibra cell (Sonic), nồi lên men 10 L Biostat B Plus (Sartorius). 2.3. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH 2.3.1. Phân lập chủng vi khuẩn Thu thập mẫu đất, cát và nước: 13 tỉnh từ Đà Nẵng đến Đồng Tháp. Phân lập: phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường TSA, lưu lại các 1.3. Vi khuẩn sinh chất COXH: nghiên cứu trong nước và trên thế giới, chủng có hình thái khuẩn lạc và màu sắc khác nhau. một số chất chống oxi hoá từ vi khuẩn. 2.3.2. Sàng lọc vi khuẩn sinh chất chống oxi hoá 1.4. Lên men sản xuất sinh khối: các yếu tố liên quan đến việc chọn cơ Chủng sinh chất COXH ngoại bào và nội bào được sàng lọc bằng phương chất môi trường lên men, các yếu tố ảnh hưởng tạo sinh khối ở vi sinh vật. pháp bản mỏng DPPH (Huang, 2006). 1.5. Probiotic và ứng dụng trong y học: khái niệm, tiêu chí về probiotic, 2.4. Khảo sát khả năng sinh chất chống oxi hóa của các chủng vi khuẩn ứng dụng Xác định hoạt tính COXH: xác định bằng phương pháp đánh bắt gốc tự 1.6. Các vấn đề cần nghiên cứu do DPPH, chọn các chủng có hoạt tính đánh bắt DPPH >50%. 3 4 bắt DPPH, tạo phức với ion sắt II, bảo vệ carotenoid trong hệ nhũ tương - với acid linoleic (Brand-Williams, 1995; Antolovich, 2002). 2.7. Đánh giá khả năng ứng dụng cung cấp chất COXH Xác định khả năng sinh chất COXH: xác định IC50 của chất COXH ngoại bào và các phân đoạn chất COXH nội bào bằng phương pháp đánh - Định danh: Dựa trên giải trình tự 16S rADN (Frank, 2008). 2.5. Khảo sát đặc điểm probiotic của các chủng Bacillus Khả năng sinh enzym ngoại bào của VK: khả năng sinh enzym caseinase, - Theo dõi: biểu hiện bất thường. Xét nghiệm: bất thường thông số sinh hóa/ công thức máu. Vi phẫu: bất thường mô học nội tạng. Thời gian: 30 ngày. Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04 và KP3. Đối chứng: PBS, vitamin E. Liều: 106 bào tử/g thể trọng. Sau 30 ngày: nhóm sinh lý: chuột ở các lô được tiêm phúc mô dầu; gelatinase, amylase, lipase (Kumar, 2012). nhóm gây hoại tử gan với CCl4: chuột được tiêm phúc mô CCl4/dầu Khả năng đối kháng với VK gây bệnh (chủng ATCC): E. coli, P. liều 1ml/kg thể trọng. 24 giờ sau tiêm, chuột được giải phẫu. aeruginosa, P. vulgaris, S. aureus, S. feacalis, S. marcescens, S. dysenteria, - Quan sát đại thể nội tạng chuột: biểu hiện bất thường  S. paratyphi A (CLSI, 2012). Chỉ số COXH: thay đổi, bất thường về chỉ số COXH tổng (FRAP), Khả năng chịu acid dịch vị và muối mật: Khả năng sống sót của VK sau SOD, catalase, GSH-Px, MDA (Ohkawa, 1979; Flohe, 1984; 30 phút, 90 phút ở pH 2 và pH 3; sau 1 giờ, 3 giờ ở muối mật 0,3% và 0,5% Marklund, 1974; Goth, 1991; Benzie, 1999). (Barbosa, 2005).  Xét nghiệm: thay đổi, bất thường enzym gan AST và ALT Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh: phương pháp pha loãng kháng  Vi phẫu: bất thường mô gan. sinh trong thạch theo M7-A9 và M45-A (CLSI). Sử dụng 14 kháng sinh đại 2.8. Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối diện cho các nhóm penicilin, cephem, glycopeptid, aminoglycosid, 2.8.1. Khảo sát điều kiện nhiệt độ và pH: nhiệt độ: 30C, 37C, 42C, macrolid, tetracyclin, quinolon, phenicol, ansamycin. pH: 5, 6, 7, 8, 9. Khảo sát sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố: Hbl (A, B, C, D) gây 2.8.2. Tối ưu môi trường tạo sinh khối sinh chất COXH tiêu huyết; Nhe (A, B, C) gây tiêu chảy, Ces mã hóa cereulid synthetase, Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng: ảnh hưởng của 11 yếu tố gồm nguồn bceT thuộc nhóm enterotoxin T, cytK, độc tố tương tự β-toxin của C. carbon, nitơ và khoáng chất theo ma trận Plackett-Burman. perfringens (Phelps, 2002; Lindback, 2004; Stenfors, 2010). Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men: 3 yếu tố ảnh hưởng chính 2.6. Thử nghiệm tính an toàn của chủng đến sinh khối và lượng chất COXH được tối ưu theo RSM. Độc tính cấp: theo dõi trong 72 giờ đầu và đến 14 ngày. Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3. Đối chứng: PBS. Liều: 5.10 8 và 5.109 bào tử/g thể trọng (Dược Điển Việt Nam IV, 2009). Xác định liều LD50. Giải phẫu đại thể: tìm bất thường trong nội tạng Độc tính bán cấp: 60 ngày. Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3. Đối chứng: PBS. Liều: 106 và 107 bào tử/g thể trọng. 5 Kích thích tạo bào tử Thành phần khoáng bổ sung kích thích tạo bào tử: khoáng ảnh hưởng đến việc tạo bào tử được xác định dựa vào ma trận Plackett-Burman. Thời điểm bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử: đầu pha lũy thừa, giữa pha lũy thừa, đầu pha ổn định, giữa pha ổn định. 2.8.3. Khảo sát điều kiện thu nhận bào tử trên nồi lên men 10 lít 6 Khảo sát các thông số lên men: tỷ lệ cấy truyền: 1, 5, 10% thể tích môi Chất COXH nội bào: Phân đoạn ethylacetat: hoạt tính COXH thấp. Phân trường lên men; tốc độ khuấy: 250, 400, 600 vòng/phút; lượng oxi cung đoạn chloroform: BD5.1, BD6.8, BD8.2, BT2.4, CR3, DN1.1, DN4.1, cấp: 50, 75, 100%. DQ11, DQ15.2, DQ32, DQ35.1, DQ35.3, DQ8.2, DT11.3, DT15.1, DT5.1, Khảo sát quá trình lên men mẻ - bổ sung cơ chất: các thông số lên men DT6.1, GL7, GL2.1, GL4.5, HR04, KP3, NT3.2, NT7.1, PT3.7, QN7.2, mẻ bổ sung cơ chất được tính toán từ thí nghiệm lên men mẻ. TG3.1, TG4.1, TN1.1, TN1.3, TN12.3, TN2.4 có hoạt tính cao với IC50 khoảng 0,43-0,82 mg/ml. Phân đoạn ethanol: BD1.1, DN5.2, DQ11, DQ40, CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH 3.1.1. Thu thập và phân lập vi khuẩn sinh chất COXH Số mẫu thu thập được là 204 mẫu. Các mẫu được phân lập trên môi trường TSA và thu được 367 chủng vi khuẩn. DQ8.2, DT11.3, DT14.1, DT5.1, GL6, GL2.3, KP3, PT6.1, QN1.1, QN2.2, TG6.1, TN1.1, TN13.1, TN2.4 có hoạt tính cao với IC50 khoảng 0,21-0,99 mg/ml. Các phân đoạn chất COXH nội bào và chất COXH ngoại bào có khả năng COXH theo các cơ chế khác nhau. 3.2.2. Định danh vi khuẩn sinh chất COXH tốt 47 chủng: 10 chủng là VK Gram âm, 4 chủng Staphylococcus, 2 chủng Các chủng vi khuẩn phân lập được có nhiều màu sắc khác nhau, trong Micrococcus luteus, 1 chủng Lysinibacillus macroides, 30 chủng Bacillus. đó màu trắng là chủ yếu. Trong số chủng vi khuẩn phân lập được có 30 cầu Trong 30 chủng Bacillus có 9 chủng là Bacillus cereus bị loại bỏ trong các khuẩn, 252 trực khuẩn Gram dương và 85 trực khuẩn Gram âm. nghiên cứu tiếp theo, 21 chủng Bacillus còn lại gồm B. subtilis, B. 3.1.2. Sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH marisflavi, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. Trong số 367 chủng phân lập, 139 chủng có khả năng sinh chất COXH, fusiformis, B. pumilus là các loài Bacillus an toàn được chọn cho các trong đó 15 chủng có khả năng sinh chất COXH cả ngoại bào và nội bào: nghiên cứu tiếp theo về đặc tính probiotic của chủng. BT2.4, BD1.1, DT5.3, DT6.1, QN1.1, QN1.2, DQ11, HR04, PT6.1, 3.3. Khảo sát đặc điểm probiotic của các chủng Bacillus TN12.2, TN13.1, HM2.7, GL7, CR5.2, KP3. Khả năng sinh enzym ngoại bào: 16/21 chủng có khả năng sinh enzym 3.2 .Khảo sát khả năng sinh chất COXH của các chủng amylase và protease, không có chủng nào sinh enzym lipase. Khả năng đối kháng với VK gây bệnh: BT2.4 và HR04 có khả năng đối 3.2.1. Định lượng hoạt tính COXH Xác định hoạt tính COXH của các chủng: 47/139 chủng có khả năng đánh bắt DPPH  50%. Khả năng COXH của các phân đoạn: Chất COXH ngoại bào: BD1.1, BT2.4, DN5.2, DQ11, DQ40, DT6.1, GL7, HR04, KP3, PT6.1, QN1.1, QN1.2, TN13.1 có hoạt tính cao với IC50 kháng với E. coli, Salmonella và Shigella. Hầu hết các chủng có khả năng đối kháng với S. marcescens, S. aureus . Khả năng chịu acid dịch vị và muối mật: BD6.8, BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3 có khả năng sống sót lớn hơn 50% ở pH 2 trong 90 phút và muối mật 0,5% trong 3 giờ. trong khoảng 0,17-0,78 mg/ml. 7 8 Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh: 18 chủng nhạy cảm và nhạy cảm trung gian với 14 kháng sinh thử nghiệm trong đó có 7 chủng tiềm năng được chọn trong thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị và muối mật. Ở điểu kiện bình thường: Lô uống bào tử và lô VitE: vi phẫu mô gan không khác biệt so với lô PBS. Khi bị stress do CCl4: Lô PBS/CCl4: phần lớn các tế bào gan to bất Xác định sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố: 21 chủng vi khuẩn thử thường có nhân không điển hình và bị hoại tử, bị viêm nặng ở khoang cửa nghiệm âm tính với các gen mã hóa độc tố. và tiểu thùy gan. Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4 và DQ40/CCl4: tế bào gan có Tổng hợp các đặc tính probiotic, 7/21 chủng có các đặc tính tốt được nhân không điển hình và các tế bào bị hoại tử cũng xuất hiện, tuy nhiên chọn để tiếp tục nghiên cứu gồm BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, mức độ tổn thương gan thấp hơn nhiều so với lô PBS. Lô GL4.5/CCl4, HR04 và KP3. HR04/CCl4, KP3/CCl4 và VitE/CCl4 chỉ xuất hiện một số tế bào gan bị tổn 3.4. Thử nghiệm tính an toàn thương, hầu hết các tế gan bình thường, chứng tỏ việc sử dụng bào tử VK Độc tính cấp: liều LD50 qua đường uống của bảy chủng BT2.4, DQ11, 12 DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3 cao hơn 5.10 bào tử/kg thể trọng. Độc tính bán cấp: lô uống bào tử BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04, 7 KP3: liều 10 bào tử/g thể trọng tương đương 5.10 11 CFU/người 50 kg không thể hiện bất kỳ biểu hiện độc tính nào trên chuột thử nghiệm. Lô GL2.1: liều 107 bào tử/g thể trọng có hiện tượng lách to, tăng hoạt động tạo huyết ở lách, chủng này bị loại trong các thử nghiệm tiếp theo. 3.5. Đánh giá khả năng cung cấp chất COXH Khả năng cung cấp chất COXH được xác định thông qua khả năng hạn chế stress OXH khi gây độc gan bằng CCl4 của sáu chủng Bacillus: BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04. hoặc vitamin E có tác dụng hạn chế tổn thương gan do CCl4. Enzym gan Ở điều kiện bình thường: hoạt tính enzym AST và ALT không có sự khác biệt giữa sử dụng bào tử VK và vitamin E so với lô PBS. Khi bị stress do CCl4: Lô PBS/CCl4: hoạt tính AST và ALT ở lô tăng lên lần lượt là 3,4 lần và 5,0 lần so với lô PBS. Điều này chứng tỏ khi tiêm CCl4 gan bị tổn thương. Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4, DQ40/CCl4 và GL4.5/CCl4, VitE/CCl4: hoạt tính AST và ALT giảm có ý nghĩa thống kê so với lô PBS/CCl4. Lô HR04/CCl4 và KP3/CCl4: hoạt tính AST được giữ ổn định so với lô sinh lý PBS, hoạt tính enzym ALT giảm có ý nghĩa thống kê so với lô PBS/CCl4, kết hợp với kết quả vi phẫu mô gan cho thấy đây là Quan sát đại thể: các lô tế bào gan ít bị hoại tử và tổn thương do đó hạn chế tốt sự gia tăng Lô PBS: gan chuột có màu đỏ hồng tự nhiên, không có điểm xuất huyết, gan không xơ cứng. Lô PBS/CCl4: gan có màu thâm đen, gan bị xơ cứng. Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4, DQ40/CCl4: mức độ xơ cứng của gan giảm so với lô PBS. Lô GL4.5/CCl4, HR04/CCl4, KP3/CCl4 và VitE/CCl4: gan chuột có sự thay đổi về màu sắc, tuy nhiên vẫn có màu hồng, các điểm màu trắng giảm, gan không bị xơ cứng. enzym gan. Các chỉ dấu COXH Chỉ số COXH tổng: giúp xác định khả năng COXH của hệ thống được thể hiện thông qua giá trị FRAP. Ở điều kiện bình thường: bào tử vi khuẩn và vitE có tác dụng làm tăng mức COXH tổng có ý nghĩa khi so sánh với lô PBS. Quan sát vi thể 9 10 Khi bị stress do CCl4 gây ra: chỉ số COXH tổng ở lô PBS/CCl4 giảm có ý nghĩa thống kê so với lô PBS; ở lô sử dụng bào tử, mức COXH tổng ở các lô thử nghiệm đều cao hơn có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4, và khi so sánh các lô thử nghiệm với nhau, lô uống bào tử Bacillus có tác dụng bảo vệ tương tự vitamin E ở cả gan và huyết thanh. Enzym COXH nội sinh: Điều kiện bình thường: bào tử và vitamin E làm tăng mức dự trữ enzym so với lô PBS. được chọn để nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy nhằm thu được lượng sinh khối lớn để ứng dụng làm probiotic cung cấp chất COXH. Bảng 1. So sánh các đặc điểm về COXH, enzym gan của sáu vi khuẩn Chủng BT2.4 Khi bị stress OXH do CCl4: hoạt tính SOD, CAT, GSH-Px giảm có ý Khả năng cung cấp chất COXH enzym gan chất COXH Hoạt tính phân đoạn Cải thiện AST,ALT Cải thiện các chỉ số Hoạt tính tốt ở các COXH Cải thiện AST, ALT Cải thiện các chỉ số phân đoạn DQ40 tính của enzym cao hơn hoặc bằng lô sinh lý PBS và khác biệt có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4 ở cả gan và huyết thanh. Hoạt tính ethanol thấp DQ11 nghĩa ở lô PBS/CCl4 so với PBS. Ở lô sử dụng bào tử và vitamin E: hoạt Khả năng sinh COXH Hoạt tính phân đoạn Cải thiện AST, ALT Cải thiện các chỉ số chloroform thấp GL4.5 Lượng MDA: Hoạt tính COXH COXH Cải thiện AST, ALT Hầu như không khác ngoại bào thấp Điều kiện bình thường: bào tử và vitamin E làm giảm lượng MDA so HR04 với lô PBS. Khi bị stress OXH do CCl4: lượng MDA ở lô PBS/CCl4 tăng có ý nghĩa so với lô PBS. Ở lô sử dụng bào tử và vitamin E: lượng MDA thấp hơn hoặc bằng lô PBS và khác biệt có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4. Như vậy việc sử dụng bào tử của các chủng vi khuẩn có tác dụng hạn chế stress OXH do tăng chỉ số COXH tổng FRAP, tăng hoạt tính của KP3 biệt so với lô VitE Hoạt tính tốt ở các Giữ AST ở mức sinh Cải thiện các chỉ số phân đoạn lý, cải thiện ALT COXH Hoạt tính tốt ở các Giữ AST ở mức sinh Hầu như không khác phân đoạn lý, cải thiện ALT biệt so với lô VitE 3.6. Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối 3.6.1. Khảo sát điều kiện nhiệt độ và pH KP3 phát triển tốt nhất ở pH 8 và nhiệt độ 37 oC với mật độ enzym COXH nội sinh của động vật thử nghiệm và ức chế quá trình 4,35±0,10.108 CFU/ml. peroxid hóa lipid tạo ra MDA so với lô chứng PBS tiêm CCl4, điều này 3.6.2. Tối ưu hóa môi trường thu nhận sinh khối và chất COXH chứng tỏ khả năng cung cấp chất COXH cho vật chủ khi sử dụng bào tử vi Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính đến sinh khối và chất COXH: khuẩn. Dựa vào khả năng sinh chất COXH ngoại bào, nội bào, khả năng cung cấp chất COXH thông qua việc hạn chế stress OXH và bảo vệ gan khi gây độc gan với CCl4 của sáu chủng vi khuẩn như trong Bảng 1, chủng KP3 11 Mật rỉ, amoni citrat, MnCl2: ảnh hưởng dương và phần trăm đóng góp cao và ảnh hưởng có ý nghĩa giá trị thống kê đến việc tạo sinh khối và hàm lượng chất COXH. 12 Tối ưu hóa công thức môi trường theo RSM:  Khảo sát thời điểm bổ sung khoáng Bảng 2. Nồng độ 3 yếu tố khảo sát trong mô hình RSM - CCD Yếu tố Phạm vi A Mật rỉ (g/l) 5 – 15 B Amoni citrat (g/l) 0,5 – 2 C MnCl2 (mM) 5– 20 lần đạt 2,22.109 bào tử/ml và tỉ lệ bào tử tăng lên 99%. Mức -1 0 +1 5 10 15 0,5 1,25 5 12,5 So sánh việc tối ưu hóa môi trường Bảng 3. Kết quả so sánh các thí nghiệm trước và sau khi tối ưu 2 Môi trường TSB Plackett-Burman RSM-CCD Bổ sung khoáng 20 Sinh dưỡng * 0,45 1,65 2,21 2,17 Bào tử * 0,05 0,57 0,74 2,12 Chất COXH ** 16,81 67,72 79,53 71,8 Dữ liệu phân tích thống kê tính toán được giá trị p của mô hình sinh khối là 0,0114, mô hình chất COXH là 0,0247 <0,05, chứng tỏ mô hình có ý nghĩa thống kê. 2 Thời điểm bổ sung khoáng lúc 8 giờ là tốt nhất giúp mật độ bào tử tăng 3 9 *x10 CFU/ml, **: mg/l 2 Các yếu tố B -amoni citrat, C -MnCl2 và sự phối hợp giữa mật rỉ và Công thức môi trường tối ưu của KP3: glucose 10 g/l, đậu không dầu amoni citrat ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê với giá trị p<0,05, có ý nghĩa 19,75 g/l, amoni citrat 1,7g/l, mật rỉ 7,2 g/l, pepton từ thịt 11,13 g/l, MnCl2 thống kê, các yếu tố còn lại ảnh hưởng không có ý nghĩa thống kê. 16,58 mM (1 ml/l), K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, Phương trình hồi quy về lượng sinh khối và chất COXH của KP3: 8 2 2 Sinh khối (x10 CFU/ml) = -5,64 + 0,49*A*B - 5,49*B - 0,023*C 2 FeSO4.7H2O 1 μM (1ml/l) , MgSO4.7H2O 0,38 g/l sau 8 giờ nuôi cấy bổ sung CaCl2 0,5 g/l và FeSO4.7H2O 35 μM (1 ml/l). 2 Chất COXH (mg/l)= -25,73 + 1,72*A*B - 20,89 B - 0,085 C Với hàm mục tiêu là sinh khối cực đại, phần mềm Design Expert 7.0.0 dự đoán các thông số tối ưu của môi trường là: mật rỉ 7,2 g/l,; amoni citrat 1,7 g/l và MnCl2 là 16,58 mM (bổ sung 1ml/l) với mật độ tế bào khoảng 1,96.109 CFU/ml. 3.6.3. Khảo sát qui trình thu nhận bào tử KP3 trên nồi lên men Thông số lên men thu bào tử KP3: tỷ lệ cấy truyền 5%, tốc độ khuấy 400 vòng/phút và pO2 50%, thời điểm thu nhận bào tử là 32-34 giờ. Đánh giá việc nuôi cấy trên nồi lên men Quá trình nuôi cấy trên nồi lên men gặp một số vấn đề như sau: mật độ Khảo sát đường cong tăng trưởng trên môi trường tối ưu: tế bào giảm nhanh sau 12 giờ nuôi cấy, lượng bào tử thu được thấp 1,41.109 Sinh khối: pha lũy thừa: 0-8 giờ, pha ổn định 8-26 giờ, pha suy vong sau bào tử/ml, tỉ lệ bào tử thấp khoảng 40%; pH giảm từ giờ thứ 1 đến giờ thứ 5 26 giờ. Chất COXH: ổn định từ 17-26 giờ, giảm sau 26 giờ. Chất COXH có từ pH 8 về pH 5,6, sau đó pH tăng lên 9 vào giờ thứ 22, do hàm lượng thể thu nhận cùng thời điểm với sinh khối đạt cực đại. glucose giảm và có sự chuyển đổi sang sử dụng cơ chất là pepton và đậu Kích thích tạo bào tử không dầu. Do đó, chiến lược lên men bổ sung cơ chất mật rỉ được thử Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử: CaCl2 0,5 g/l và nghiệm nhằm cân bằng pH, duy trì tăng trưởng của vi khuẩn. FeSO4.7H2O 35 μM (bổ sung 1 ml/l) ảnh hưởng tích cực đến sự hình bào của KP3 13 14 Khảo sát quá trình lên men mẻ - bổ sung cơ chất: Thí nghiệm lên men mẻ Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử của KP3 - bổ sung cơ chất nhằm mục tiêu tăng mật độ bào tử bằng việc bổ sung cơ Quy trình lên men đề xuất chất mật rỉ với tốc độ bổ sung cơ chất không đổi. Thông số lên men được Tiệt trùng 121oC 45 phút Bảng 4. Thông số lên men mẻ - bổ sung cơ chất STT 1 Thông số Giá trị Tốc độ tăng trưởng cực đại (1/giờ) 0,97a Hiệu suất sử dụng cơ chất (g/g) 0,60 3 Nồng độ mật rỉ trong dung dịch bổ sung (g/l) 500b 4 Thể tích lên men khởi đầu (L) 3 5 Sinh khối trước giai đoạn bổ sung cơ chất (g/l) 2,1c 6 Tốc độ bổ sung cơ chất F(t) (ml/giờ) 58 7 Thời điểm bổ sung cơ chất Giờ thứ 3-4 Chuẩn bị MT Cấy ria TSA, 37oC, 24 giờ Bổ sung mật rỉ trong 8 giờ từ khi pH tăng Tăng sinh/ 350ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 9 giờ Lên men Bổ sung khoáng tạo bào tử ở giờ thứ 10 Sinh khối ướt giàu bào tử Thu bào tử sau 34 giờ nuôi cấy Trong quá trình bổ sung mật rỉ, pH ổn định quanh giá trị pH 7, duy trì Nhân giống Tăng sinh/ 20ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 9 giờ Lên men ở 37oC, DO 50%, pH 8, 400 vòng/phút a 2 Chủng B. subtilis KP3 6,65 L MT tối ưu tính toán dựa vào thí nghiệm lên men theo mẻ. Làm sạch bào tử bằng phương pháp Nicholson Xử lý sau lên men Sơ đồ 1. Quy trình lên men thu nhận bào tử Bacillus subtilis KP3 pha lũy thừa từ giờ thứ 1-9, đạt mật độ VK cực đại 1,12.1010; mật độ bào tử Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử KP3: môi trường tối ưu bổ sung cơ sau 34 giờ nuôi cấy là 4,46.109 BT/ml tăng lên 3,1 lần so với lên men theo chất, tiến hành lên men 3 mẻ, mỗi mẻ 7 L. Bảng 5. Kết quả ứng dụng quy trình lên men thu bào tử KP3 mẻ là 1,44.109 BT/ml, và tăng lên gấp 2,1 lần so với lên men trên erlen. Brix 6 Mẻ lên Bào tử sau lên men Bào tử sau làm sạch x10 CFU x10 CFU (%) (mg/1012 bào tử) 1 37,29 34,87 (93,52) 73,12 2 35,73 32,95 (92,24) 71,38 3 35,36 31,67(89,58) 70,98 3 TB 36,12 33,16 (91,81) 71,82 2 Sau khi lên men theo mẻ trên quy mô 7 L, số lượng bào tử thu được sau 4 12 Chất COXH men 5 12 khi lên men là 36,12.1012 bào tử, số lượng bào tử thu nhận sau khi làm sạch Đồ thị 1. Kết quả diễn biến các thông số KP3 trong lên men fed-batch 15 16 là 33,16.1012 bào tử với hiệu suất làm sạch là 91,81%. Lượng chất COXH 12 tổng có trong sinh khối tế bào khoảng 71,82 mg/10 bào tử. khuẩn vì các nghiên cứu trước đây các nghiên cứu chủ yếu chỉ tập trung vào chất COXH ngoại bào hoặc chất COXH nội bào của vi khuẩn. Các chất COXH trong cơ thể gồm các chất tan trong nước và tan trong 3.6. Bàn luận dầu. Trong đó, chúng có chức năng tại các vị trí tương ứng, giúp cơ thể có Vi khuẩn sinh chất COXH - Phân lập và sàng lọc đối tượng nghiên cứu thể chống lại các cơ chế OXH khác nhau. Chất COXH thân dầu ngoài việc Nghiên cứu đã tiến hành thu thập 204 mẫu đất, cát và nước biển ở 13 tham gia vào hoạt động COXH, chúng còn tích lũy bên trong màng tế bào tỉnh từ Đà Nẵng đến Đồng Tháp, đã phân lập được 367 chủng VK. Các và lipoprotein, một số ở bề mặt hoặc sâu trong cấu trúc của lipid như chủng phân lập gồm trực khuẩn Gram dương, Gram âm và cầu khuẩn, vitamin E và carotenoid. Các chất COXH thân nước như acid ascorbic và trong đó trực khuẩn Gram dương chiếm 68,7%. Đây là các chủng vi khuẩn acid uric đánh bắt các gốc tự do trong pha lỏng, chủ yếu hoạt động trong được phân lập từ các nơi có điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, hạn các dịch sinh học [97, 98]. Các nghiên cứu về chất COXH từ vi khuẩn theo hán, các vùng nước mặn và là các chủng có tiềm năng sinh chất COXH. hai hướng: 1. chiết chất COXH từ dịch nuôi cấy vi khuẩn như Các chủng phân lập từ các nơi này có khả năng sinh chất COXH phù hợp exopolysaccharid, S7-02…, đây là các chất COXH thân nước; 2. ly giải tế với các nghiên cứu trước. Nghiên cứu của Bùi Minh Giao Long (2010) và bào và sử dụng dịch ly giải để xác định hoạt tính COXH, với cách này có Trần Hữu Tâm (2014) đã phân lập được các chủng vi khuẩn sinh carotenoid thể thu được các chất COXH thân nước cũng như thân dầu trong tế bào và từ các vùng biển ở Việt Nam, hay nghiên cứu của Wang (2011) đã phân lập thường có hiệu quả cao hơn so với việc chiết tách. Do đó, việc khảo sát chủng B. simplex XJ25 ở sa mạc Gurban, Trung Quốc. chất COXH ngoại bào và các phân đoạn chất COXH nội bào khác nhau 367 chủng phân lập đã được sàng lọc hoạt tính COXH bằng phương pháp bản mỏng DPPH. Đây là một phương pháp sàng lọc nhanh, giúp xác định các chủng có khả năng sinh chất COXH trong thời gian ngắn và cho kết quả tương đối chính xác, vì vậy phương pháp này có thể áp dụng với một lượng lớn chủng vi khuẩn. - Khả năng sinh chất chống oxi hóa 139 chủng vi khuẩn có tiềm năng sinh chất COXH đã được sàng lọc bằng phương pháp bản mỏng DPPH. Trong đó, 47 chủng sinh chất COXH nội bào hoặc ngoại bào lớn hơn 50%. Hầu hết các chủng vi khuẩn có chất COXH ngoại bào có hoạt tính cao hơn 50% đều sinh chất COXH nội bào tan trong nước hoặc chloroform như chủng BT2.4, DN1.1, DQ11, GL12.5, giúp cung cấp dữ liệu cho việc ứng dụng chất COXH từ vi khuẩn. Các vi khuẩn có khả năng cung cấp các chất chống OXH cả ở dạng thân nước và thân dầu sẽ có ưu thế hơn trong việc lựa chọn để sử dụng. Đây cũng là một điểm mới trong nghiên cứu này khi đã sàng lọc được các chủng sinh chất COXH thân nước và thân dầu như KP3, HR04, DQ11. - Định danh Định danh bằng giải trình tự 16S rADN, so sánh với ngân hàng gen của NCBI BLAST, kết quả cho thấy trong số 47 chủng vi khuẩn có hoạt tính cao: 10 chủng là vi khuẩn Gram âm, 4 chủng Staphylococcus, 2 chủng Micrococcus luteus, 30 chủng Bacillus (trong đó có 9 chủng Bacillus cereus) và 1 chủng Lysinibacillus macroides. HR04, KP3, BD1.1, PT6.1, QN1.1, QN1.2, DQ40, DT14.1, DT6.1, Các chủng Gram âm có hoạt tính COXH cao như Chryseobacterium TN12.2, TN13.1. Kết quả này cho thấy tiềm năng sinh chất COXH của vi vietnamense GL6, Acinetobacter bereziniae TG6.1, Citrobacter youngae 17 18 QN1.1, Chromobacterium violaceum TN13.1 là các chủng gây bệnh, do đó Khả năng ứng dụng probiotic như là nguồn cung cấp chất COXH việc có hoạt tính COXH giúp tăng khả năng chống chịu của chủng trong Các nghiên cứu hiện nay chưa đề cập đến việc sử dụng Bacillus như điều kiện có các tác nhân OXH. Đối với 4 chủng là Staphylococcus, các nguồn cung cấp chất COXH trực tiếp, mà chứng minh các chất chiết từ nghiên cứu cho thấy các chủng này có 17 loại triterpenoid carotenoid có Bacillus có hoạt tính trên in vivo. Vì vậy, đây là nghiên cứu đầu tiên báo cấu trúc C30, thay vì cấu trúc C40 như ở thực vật và các vi sinh vật khác; cáo khả năng sử dụng bào tử Bacillus như là nguồn cung cấp chất COXH. vì có chứa carotenoid nên các chủng Staphyloccocus thường chịu được điều kiện sống có COXH cao, đây chính là một trong những đặc tính giúp hỗ trợ trong việc gây bệnh của cầu khuẩn. Hai chủng M. luteus DQ24.1 và M. luteus DT11.3 có khả năng tạo exopolysaccharid với lượng lớn và có hoạt tính COXH cao. Tuy nhiên, đây là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, tìm thấy ở trong khoang miệng, niêm mạc, hầu họng, đường hô hấp trên. Do đó, các chủng này không thể sử dụng làm probiotic mà cần tách chiết các chất COXH khi sử dụng. Trong số 47 chủng có 9 chủng là Bacillus cereus, chúng tôi loại các chủng này vì đây là các chủng có thể tạo ra các độc tố như tiêu chảy, nôn ói. 21 chủng Bacillus còn lại thuộc các loài như B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. marisflavi, B. licheniformis, B. megaterium, B. fusiformis. Đối với các loài Bacillus này, các nghiên cứu đã chứng minh B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. marisflavi, B. pumilis có khả năng sinh chất COXH. Bên cạnh đó, nghiên cứu này đã phát hiện một số chủng vi khuẩn thuộc các loài sau: B. megaterium, B. fusiformis chưa thấy có công bố về khả năng sinh chất COXH. Ở điều kiện bình thường, bào tử Bacillus là nguồn cung cấp chất COXH giúp tăng mức dự trữ trong cơ thể. Điều này thể hiện thông qua chỉ số COXH tổng FRAP tăng (khoảng 2,5 ở gan và 15 U/mg protein ở huyết thanh) so với lô PBS (1,54 ở gan và 12,61 U/mg protein ở huyết thanh); các enzym COXH trong cả gan và huyết thanh cũng tăng so với lô PBS. Như vậy, các chủng Bacillus góp phần tăng mức nền COXH của động vật thử nghiệm. Khi gây độc gan với CCl4, các tế bào gan bị hoại tử, làm tăng các enzym gan, tăng quá trình peroxid hóa, giảm khả năng COXH tổng và dẫn đến stress OXH. Các enzym COXH chính như SOD, GSH-Px và CAT, được xem như hàng rào chống lại sự hình thành các gốc tự do ở in vivo, chúng sẽ hoạt động phối hợp với nhau trong quá trình stress để ngăn cản sự hình thành các gốc tự do. Ở lô PBS/CCl4 không được bảo vệ bởi chất COXH, hàm lượng MDA tăng, chỉ số FRAP và hoạt tính của các enzym CAT, SOD và GPx giảm đáng kể so với lô PBS, dẫn đến phá hủy các tế bào gan làm gia tăng men gan. Trong khi đó, ở các lô sử dụng bào tử VK, CCl4 cũng tác động đến khả năng COXH tổng, giảm hoạt tính của enzym, nhưng với sự dự trữ các chất COXH từ từ khi sử dụng bào tử, nên các chỉ số trên khi thay Như vậy, trong các nghiên cứu về VK sinh chất COXH ở Việt Nam, đây đổi vẫn cao hơn hoặc trở về mức sinh lý bình thường của động vật thử là báo cáo đầu tiên sàng lọc và khảo sát đặc điểm của VK sinh chất COXH nghiệm ở lô PBS. Vì thế, khi quá trình OXH xảy ra, MDA gia tăng nhưng có hệ thống trên tất cả các chủng VK phân lập thuộc các loài khác nhau. vẫn thấp hơn mức MDA nền, nên làm giảm sự hoại tử của các tế bào gan Điều này giúp cung cấp một cách nhìn tổng quát hơn về VK sinh chất thể hiện qua kết quả vi phẫu mô gan, đồng thời giúp giảm các chỉ số về COXH. men gan so với lô PBS. Điều này chứng minh rằng các chủng Bacillus thử nghiệm có tác dụng hạn chế hậu quả gây độc gan và stress OXH do CCl4. 19 20 Trong một nghiên cứu khác về khả năng hạn chế stress OXH do sốc nhiệt tạo ra điều kiện stress để giúp vi khuẩn sinh chất COXH. Tuy nhiên, trên của Tran Duong Thao và cs (2015) cho thấy sau khi sử dụng bào tử của môi trường tối ưu, tỉ lệ bào tử thu nhận còn khá thấp khoảng 35%. Tỉ lệ tạo Bacillus subtilis KP3 trong 7 ngày có khả năng hạn chế sự gia tăng MDA bào tử có thể được cải thiện nhờ việc bổ sung thêm các khoáng kích thích o cũng như sự giảm enzym COXH ở chuột nhắt trắng bị sốc nhiệt ở 42 C tạo bào tử như FeSO4, CaCl2, hay MnCl2 như trong các môi trường có tỉ lệ trong 15 phút. Một nghiên cứu tiếp theo hướng nghiên cứu của đề tài về tạo bào tử cao như DSM hay 2SG (2xSchaeffer's sporulation agar). Một khả năng hạn chế tiểu đường của KP3 cho thấy, khi sử dụng bào tử của vi điểm mới trong nghiên cứu này là tiến hành bổ sung thêm các khoáng có 6 khuẩn với liều 10 bào tử/ g thể trọng chuột, trong 6 tuần, có tác dụng làm ảnh hưởng tích cực đến việc tạo bào tử vào thời điểm sau khi tế bào đạt pha giảm đường huyết của chuột bị tiểu đường typ 2 từ 181 mg/dl về mức bình ổn định (giờ thứ 8), giúp tăng tỉ lệ tạo bào tử của KP3 từ 35% lên 99% thường 118 mg/dl và giúp hạn chế stress OXH do tiểu đường (kết quả chưa (lượng bào tử tăng từ 0,74.109 bào tử/ml lên 2,22.109 bào tử/ml) mà không công bố). Như vậy, các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có thể sử dụng làm làm ảnh hưởng làm giảm mật độ tế bào do việc bổ sung khoáng. probiotic cung cấp chất COXH, giúp hạn chế stress OXH theo nhiều cơ chế Trên nồi lên men, B. subtilis KP3 có pha ổn định ngắn, vi khuẩn gần khác nhau. như đi vào pha suy vong sau 8 giờ, do sự cạn kiệt cơ chất. Hiện tượng vi Quy trình lên men sản xuất sinh khối của KP3 khuẩn giảm mật độ ngay sau khi đạt pha ổn định trên nồi lên men là hiện - tượng thường gặp khi vi khuẩn chuyển đổi nguồn cơ chất. Do đó trong lên Hàm lượng chất COXH ứng với đường cong tăng trưởng Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo chất COXH ở KP3 có liên quan với pha tăng trưởng lũy thừa, và hàm lượng chất COXH tích lũy có liên quan với việc tích lũy những enzym tổng hợp các chất COXH. Trong trường hợp này, điều quan trọng là phải đạt được hàm lượng enzym cần thiết cho việc sinh tổng hợp. Vì vậy, sự tích lũy các chất COXH tăng chậm trong pha lũy thừa, tăng dần ở pha ổn định và đạt cực đại vào giữa pha ổn định. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và cs về các chủng vi khuẩn sinh carotenoid như AT22, CG17.0 và HC28 tích lũy theo hướng này. Do đó, chất COXH có thể được thu nhận vào giữa pha men fed-batch, lượng mật rỉ được bổ sung theo nhu cầu của chủng, do vậy giúp ổn định mật độ tế bào, đồng thời acid tạo ra từ quá trình oxi hóa đường (trong mật rỉ) giúp trung hòa amoniac từ sự phân giải bột đậu nành; kết quả là duy trì pH ổn định trong suốt thời gian bổ sung mật rỉ. Vi khuẩn tăng trưởng liên tục 8 giờ ở pha log, điều này giúp tăng mật độ vi khuẩn lên 1,12.1010 với mật độ bào tử là 4,46.109 bào tử/ml. Như vậy, việc sản xuất bào tử KP3 theo quy trình lên men đề xuất cho kết quả ổn định, nguyên liệu bào tử thu được có chi phí sản xuất thấp do mật tử bào tử cao và sử dụng môi trường nuôi cấy rẻ tiền. ổn định khi sinh khối tế bào đạt cực đại. - Tối ưu hóa quy trình lên men Nghiên cứu này đã khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy gồm mật rỉ, đậu nành không dầu là các nguồn carbon và nitơ rẻ tiền nên góp phần giảm giá thành của môi trường. Bên cạnh đó, các ion kim loại trong môi trường là thành phần cần thiết để cấu tạo nên tế bào vi khuẩn cũng như góp phần 21 22 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ nhất do có thể sinh chất COXH nội và ngoại bào, cải thiện tốt các chỉ số COXH khi bị stress OXH. 4.1. Kết luận Các kết quả nghiên cứu trong luận án đã đáp ứng các mục tiêu đặt ra, đề 5. Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối của Bacillus tài đưa ra một số kết luận về mặt khoa học và ứng dụng như sau: subtilis KP3 sinh chất chống oxi hóa 1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa Điều kiện tăng trưởng của B. subtilis KP3 là 37C, pH 8. Môi trường tối Đã phân lập được 367 chủng vi khuẩn từ 204 mẫu đất, cát và nước ở 13 ưu cho sự phát triển của KP3 đã được xây dựng theo mô hình Plackett- tỉnh Trung và Nam bộ, từ đó sàng lọc được 139 chủng sinh chất chống oxi Burman và RSM; đã xác định được việc bổ sung CaCl2 và FeSO4 vào thời hóa. 15 chủng trong số 139 chủng có khả năng sinh chất chống oxi hóa nội điểm 8 giờ giúp tăng tỉ lệ tạo bào tử của KP3. Hàm lượng chất COXH của bào và ngoại bào. KP3 tích lũy đạt cực đại vào giữa pha ổn định trên đường cong tăng trưởng. 2. Vi khuẩn có khả năng sinh chất chống oxi hóa Do đó, có thể thu nhận chất COXH cao nhất cùng với thời điểm sinh khối Đã xác định được 47 chủng (trong số 139 chủng sinh chất COXH) có tế bào đạt cực đại. Từ đó đã xây dựng được các quy trình nuôi cấy trên nồi khả năng sinh chất chống oxi hóa tốt và đã định danh 47 chủng này, trong lên men có bổ sung cơ chất để tăng mật độ bào tử KP3 thu nhận với lượng đó có 21 chủng thuộc chi Bacillus thuộc nhóm an toàn sinh học cấp 1. bào tử là 36,11.1012 trên mẻ lên men 7 L. 3. Tiềm năng ứng dụng làm probiotic của các chủng sinh chất chống 4.2. Kiến nghị oxi hóa Tiềm năng ứng dụng làm probiotic của 21 chủng Bacillus đã được khảo sát theo nhiều tiêu chí khác nhau theo định hướng ứng dụng làm probiotic cung cấp chất COXH, xác định được 7 chủng có tiềm năng là B. subtilis - Tiến hành xác định bản chất của chất COXH của B. subtilis KP3. Tiến hành thử nghiệm khả năng bám dính và nảy mầm trong đường ruột đối với các chủng này. Tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật lớn hơn về khả năng BT2.4, B. subtilis GL2.1, B. subtilis GL4.5, B. subtilis KP3, B. COXH tổng theo thời gian để đánh giá khả năng và tác động của chất licheniformis DQ11, B. pumilus DQ40, B. amyloliquefaciens HR04. COXH từ vi khuẩn. Ngoại trừ chủng GL2.1, bào tử của sáu chủng BT2.4, GL4.5, DQ11, DQ40, HR04 và KP3 không gây độc tính cấp và bán cấp khi sử dụng - Bào chế các chế phẩm sử dụng các chủng này để phục vụ việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. 12 đường uống với liều LD50 > 5.10 CFU/kg thể trọng. 4. Khả năng ứng dụng probiotic như là nguồn cung cấp chất chống oxi hóa Bào tử của sáu chủng BT2.4, GL4.5, DQ11, DQ40, HR04 và KP3 sử dụng đường uống giúp tăng chỉ số COXH tổng, các enzym COXH trong điều kiện bình thường; giúp bảo vệ gan và hạn chế stress OXH khi cảm ứng bởi CCl4. Trong sáu chủng, Bacillus subtilis KP3 là chủng có tiềm năng 23 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Cát Đông (2014), Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ một số vi khuẩn và vi nấm, Y Học TP.HCM, 18(1), tr. 373-378. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Thị Thu Hòa, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Cát Đông (2015), Thử nghiệm sinh khả dụng của một số chủng Bacillus sinh chất chống oxi hóa, Y Học TP.HCM, 19(3), tr. 283-288. Vũ Thanh Thảo, Vòng Phượng, Lê Thị Hoàng Anh, Trần Cát Đông (2014), Sàng lọc vi khuẩn có tiềm năng sản xuất chất chống oxy hóa, Y Học TP.HCM, 18(2), tr. 277-282. Vũ Thanh Thảo, Trần Hữu Tâm, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Cát Đông (2014), Nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis BS02, Y Học Thực Hành, 907(3), tr. 20-24. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Bảo Anh Trúc, Trần Cát Đông (2015), Nghiên cứu đặc tính probiotic của một số chủng Bacillus sinh chất chống oxi hóa, Y Học TP.HCM, 19(3), tr. 289-295. Vu Thanh Thao, Le Nguyen Thi Hong Ngoc, Tran Cat Dong (2015), Hepatoprotective effects of Bacillus spores against carbon tetrachloride - induced oxidative damage in mice, in The 1st International Conference on Pharmacy Education and Research Network of ASEAN, Bangkok, Thailand, pp. 40-44. Vũ Thanh Thảo, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Nguyễn Ngọc Phương, Lê Văn Thanh, Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2016), Tác dụng bảo vệ chống stress oxy hóa và ổn định đường huyết của bào tử Bacillus sp. trên mô hình đái tháo đường typ 2 ở chuột, Tạp chí Dược học, 56(483), tr. 10-15.