Tài liệu Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại quảng ninh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------***-----BÙI THỊ HƢƠNG PHÚ NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM (Morinda officinalis How) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI QUẢNG NINH CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM SINH NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THỊ THU HÀ THÁI NGUYÊN, NĂM 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tên tôi là: Bùi Thị Hƣơng Phú Học viên cao học khóa 18. Chuyên ngành: Lâm học. khóa 2010 - 2012. Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên. Đến nay tôi đã hoàn thành luận văn nghiên cứu cuối khóa học. Tôi xin cam đoan: - Đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. - Số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan. - Các kết luận khoa học của luận văn chƣa từng ai công bố trong các nghiên cứu khác. - Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên. Thái Nguyên, ngày..... tháng ..... năm 2012 Ngƣời làm cam đoan Bùi Thị Hƣơng Phú Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG TỪ VIẾT TẮT CT - Công thức TN- Thí nghiệm ĐHST – Điều tiết sinh trƣởng MS – Murashinge and Skoog, 1962 BAP – 6- benzylaminopurine Kinetin – 6- furfurylaminopurine NAA - ɑ - Napahlene axetic acid IBA - Indol – 3- butyric acid HSNC – Hệ số nhân chồi TLCHH – Tỷ lệ chồi hữu hiệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -1- MỤC LỤC CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................... 7 1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 7 1.2 Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 8 1.2.1. Mục tiêu chung ........................................................................................ 8 1.2.2.Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 8 1.3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................... 9 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU........................................ 10 2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 10 2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật.............. 10 2.2.1 Tính toàn năng của tế bào ...................................................................... 10 2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ............................................ 11 2.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào....................................................................................................... 13 2.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy.............................................................................. 13 2.3.2. Chất điều hòa sinh trƣởng ..................................................................... 18 2.3.3. Môi trƣờng vật lý .................................................................................. 20 2.3.4 Điều kiện vô trùng.................................................................................. 21 2.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống .......................................... 21 2.5. Những ƣu điểm và hạn chế của vi nhân giống ............................................. 23 2.6. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào.................................................... 25 2.6.1. Trên thế giới .......................................................................................... 25 2.6.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 26 2.7. Tổng quan về cây Ba kích ............................................................................ 27 2.7.1. Đặc điểm thực vật học.......................................................................... 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -2- 2.7.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái ................................................................... 28 2.7.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng ........................................................... 31 2.7.4. Nhân giống cây Ba kích ........................................................................ 32 CHƢƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 34 3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 34 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 34 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 35 3.4. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 41 3.5. Thu thập số liệu xử lý số liệu ....................................................................... 41 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 43 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy ....................................................................................................................... 43 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống của mẫu cấy ............................................................................................ 43 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng chất khử trùng bằng Clolox đến tỷ lệ sống của mẫu cấy ............................................................................................ 45 4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng thủy ngân chlorua đến tỷ lệ sống của mẫu cấy ............................................................................. 46 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ......................................................................... 49 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ..................................................... 50 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ..................................................... 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -3- 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng phối hợp của chất điều tiết sinh trƣởng BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu............... 56 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích .......................................................................................... 60 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng NAA đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích ............................................................... 60 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng IBA đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích tím ................................................................ 64 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng chiều cao cây con Ba kích tím ở giai đoạn vƣờn ƣơm .................... 68 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 72 5.2. Tồn tại........................................................................................................... 72 5.3. Kiến nghị ...................................................................................................... 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 74 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -4- DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của BAP đến HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu chồi hữu hiệu Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của 2mg/lBAP + Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng NAA đến sự ra rễ của chồi Ba kích Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng IBA đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của BAP đến tỷ lệ chồi hữu hiệu Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của Kinetin đến đến hệ số nhân chồi Đồ thị 4.7. Ảnh hƣởng của Kinetin đến tỷ lệ chồi hữu hiệu Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng của 2mg/l BAP + kinetin đến hệ số nhân chồi Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng của 2mg/l BAP + Kinetin đến tỷ lệ chồi hữu hiệu Đồ thị 4.10. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng NAA tới tỷ lệ chồi ra Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -5- rễ Đồ thị 4.11. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng NAA tới số rễ trung bình (rễ/cây) Đồ thị 4.12. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng NAA tới chiều dài trung bình rễ (cm) Đồ thị 4.13. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng IBA tới tỷ lệ chồi ra rễ Đồ thị 4.14. Ảnh hƣởng của IBA tới số rễ trung bình (rễ/cây) Đồi thị 4.15. Ảnh hƣởng của IBA tới chiều dài trung bình rễ Đồ thị 4.16. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện tới chiều cao trung bình cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm DANH MỤC ẢNH Hình 4.1. Nuôi cấy khởi đầu Hình 4.2. Chồi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung BAP Hình 4.3. Chồi đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung Kinetin Hình 4.4. Chồi đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung 2mg/l BAP+ Kinetin. Hình 4.5. Chồi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung NAA Hình 4.6. Chồi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung IBA Hình 4.7. Chồi Ba kích nuôi cấy mô sinh trƣởng trong giá thể ngoài vƣờn ƣơm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -6- LỜI CẢM ƠN Luận văn này đƣợc thực hiện và hoàn thành theo chƣơng trình đào tạo thạc sĩ lâm nghiệp của trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Nhân dịp hoàn thành luận văn, tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Thu Hà. Ngƣời đã bồi dƣỡng kiến thức quý báu và đã dành tình cảm tốt đẹp cho tác giả từ khi hình thành, phát triển ý tƣởng, xây dựng đề cƣơng, tổ chức triển khai và hoàn thiện luận văn. Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận đƣợc sự quan tâm và giúp đỡ tận tình của Trƣờng đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy. Xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng công nghệ sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tƣ vấn, góp ý trong quá trình hoàn thiện bản luận văn này. Đối với địa phƣơng, tác giả chân thành cảm ơn các cán bộ công nhân viên phòng công nghệ sinh học Trƣờng Cao đẳng Nông lâm Đông Bắc. Nơi tác giả đã tiến hành nghiên cứu, thu thập số liệu để hoàn thiện luận văn. Xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình đã khuyến khích, giúp đỡ tác giả trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Mặc dù đã làm việc nghiêm túc với tất cả nỗ lực, song luận văn không tránh khỏi những thiếu sót nhất định. Tác giả rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học, các bạn bè đồng nghiệp và xin chân thành tiếp thu các ý kiến đóng góp đó. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả BÙI THỊ HƢƠNG PHÚ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -7- CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Với mục tiêu phát triển của nghành Lâm nghiệp Việt Nam giai đoạn 2010 2020 là nâng cao tỷ lệ che phủ của rừng và chất lƣợng rừng trồng. Do vậy những loài cây đƣợc trồng không chỉ là những cây lấy gỗ lâu năm phù hợp với hoàn cảnh đất trồng rừng mà còn phải đảm bảo có năng suất cao, chu kỳ kinh doanh ngắn có nhiều tác dụng đáp ứng nhu cầu cấp thiết đặt ra hiện nay. Đặc biệt trong những năm gần đây việc trồng cây lâm sản ngoài gỗ dƣới tán rừng đƣợc xem nhƣ là một chiến lƣợc lớn nhằm đáp ứng cả hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện tích trồng rừng và cải thiện môi trƣờng cũng nhƣ tính đa dạng sinh học của rừng. Một trong những loài cây dƣợc liệu có giá trị kinh tế cao đang đƣợc đƣa vào trồng xen dƣới tán rừng đó là cây Ba Kích. Cây Ba kích có 2 loại là Ba kích trắng và Ba kích tím. Cây Ba kích tím đƣợc sử dụng nhiều bởi hàm lƣợng dƣợc liệu có trong củ tốt hơn so với cây Ba kích trắng. Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê Rubioceae. Cây Ba kích tím đƣợc xem là cây bản địa của tỉnh Quảng Ninh đây là loài cây dƣợc liệu quý hiếm có rất nhiều công dụng. Nƣớc Ba kích sắc có tác dụng hạ huyết áp, tăng sức dẻo dai, tăng cƣờng đề kháng cơ thể, chống viêm, chữa thận hƣ, tráng dƣơng, phụ nữ khó thụ thai, tay chân đau nhức, chữa gân xƣơng yếu…. có giá trị xuất khẩu cao. Ngoài ra củ Ba kích còn đƣợc dùng ngâm rƣợi là một loại đặc sản của Quảng Ninh. Những năm gần đây Ba kích mọc tự nhiên trong rừng bị khai thác cạn kiệt dẫn đến diện tích bị thu hẹp, nguồn giống cạn dần. Hiện nay nhiều hộ gia đình tiến hành phát triển trồng cây Ba kích. Song từ trƣớc đến nay chủ yếu dùng cây giống nhân từ hạt và hom. Việc nhân giống bằng hạt không phải bao giờ cũng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -8- thuận lợi và hợp lý, thời gian nảy mầm dài, tỷ lệ nảy mầm thấp mặt khác cây giống đem trồng có nguồn gốc từ hạt không đảm bảo do hiện tƣợng phân ly trong sinh sản hữu tính nên quần thể cây rừng không còn giữ đƣợc phẩm chất ƣu việt của nguồn giống đem trồng. Đối với phƣơng pháp giâm hom thì hệ số nhân giống thấp, cây trồng bằng hom có sức sống kém, chất lƣợng củ kém. Khó khăn lớn nhất hiện nay là nguồn giống có phẩm chất di truyền tốt phục vụ cho trồng rừng đại trà còn hạn hẹp. Cùng với yêu cầu và sự phát triển của thị trƣờng hiện nay cần một lƣợng cây giống có chất lƣợng cao rất lớn. Để giải quyết nhu cầu cây giống hiện nay và tƣơng lai việc nhân giống cây Ba kích bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào là một hƣớng đi cần thiết bởi có thể nhân số lƣợng cây lớn trong thời gian ngắn để cung cấp thị trƣờng mặt khác cây nuôi cấy mô mang nhiều ƣu điểm, có sức trẻ hóa cao, cây con mang đuợc toàn bộ tiềm năng di truyền quý của bố mẹ, tăng sự đồng đều rừng trồng, cây trồng có sức sinh trƣởng và phát triển cao có tuổi thọ lớn. Cây con đƣợc tạo ra từ công nghệ nuôi cấy mô tế bào sẽ khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm của việc tạo cây con từ hạt và giâm hom. Để góp phần giải quyết các tồn tại trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào tại Quảng Ninh”. 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân giống cây Ba kích bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, nhằm góp phần phục vụ công tác duy trì và sản xuất giống cây Ba kích bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh. 1.2.2.Mục tiêu cụ thể Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -9- - Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu cây Ba kích - Nghiên cứu ảnh hƣởng một số chất điều tiết sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh của chồi Ba kích. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA, IBA tới khả năng ra rễ của chồi Ba kích . - Xác định ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống và sinh trƣởng chiều cao cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm. 1.3. Ý nghĩa của đề tài * Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu sẽ đƣa ra đƣợc một biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Ba kích bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Đánh giá đƣợc tác động của một số chất điều tiết sinh trƣởng trong nhân giống cây Ba kích. - Đánh giá đƣợc tác động của các thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm. - Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất cây Ba kích. * Ý nghĩa thực tiễn sản xuất: Sản xuất đƣợc cây con sinh trƣởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lƣợng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -10- CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture): Là phƣơng pháp sản xuất hàng loạt cây con (bản sao) từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng có môi trƣờng thích hợp và đƣợc kiểm soát (Ngô Xuân Bình, 2000) [1]. Vật liệu để nhân giống có thể là các cơ quan của cây: rễ, thân, lá, hoa, quả, các tế bào đƣợc phát sinh từ các bộ phận của cây (mô sẹo - callus) hoặc các tế bào đơn đƣợc tách từ các mô, các tế bào đã đƣợc loại bỏ phần vách (tế bào trần protoplast) [1]. Phƣơng pháp nhân giống này sử dụng một bộ phận rất nhỏ của cơ thể sinh vật làm vật liệu để nhân giống nên còn đƣợc gọi là vi nhân giống và thƣờng đƣợc thực hiện ở điều kiện vô trùng trong ống nghiệm có môi trƣờng thích hợp và đƣợc kiểm soát nên đƣợc gọi là nuôi cấy in vitro để phân biệt với quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên, ngoài ống nghiệm (in vivo) (Vũ Thị Huệ, 2008) [18]. Phƣơng pháp nhân giống này thƣờng đƣợc gọi chung là nhân giống bằng nuôi cấy mô và tế bào, là một trong những ngành kỹ thuật trẻ, mới đƣợc hình thành từ những năm đầu của thế kỷ XX và đƣợc phát triển mạnh trong vài chục năm gần đây. Ngày nay phƣơng pháp này đƣợc coi là một công cụ đắc lực để nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực có đối tƣợng sinh vật và là một nội dung quan trọng không thể thiếu đƣợc của công nghệ sinh học hiện đại [18]. 2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 2.2.1 Tính toàn năng của tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -11- Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học ngƣời Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen. Đặc tính của thực vật đƣợc thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tƣơng ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tƣơng tác qua lại với điều kiện môi trƣờng, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống nhƣ cây mẹ. [15] Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham, Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.[25] Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con ngƣời đã hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hóa và phản phân hóa tế bào. Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có đƣợc cấu trúc chuyên môn hóa nhất định nhờ sự phân hóa [16]. Phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -12- hóa có thể diễn ra nhƣ sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở lại về dạng giống nhƣ tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hóa. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa của tế bào. Phân hóa Tế bào phôi sinh Tế bào chuyển hóa Tế bào giãn Phản phân hóa Hình 1.01: Tóm tắt quá trình sự phản phân hóa của tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đƣợc hoạt hóa để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen đƣợc hoạt hóa, quá trình phân chia sẽ đƣợc xảy ra theo một chƣơng trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994) [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -13- Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật là Auxin và Cytokinin [13]. 2.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào Môi trƣờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. 2.3.1. Môi trường nuôi cấy Trong nuôi cấy mô và tế bào, môi trƣờng nuôi cấy và môi trƣờng xung quanh là hai vấn đề chính quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trƣởng và phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Cơ sở của việc xây dựng các môi trƣờng nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây. Vì thế thời gian đầu các nhà cấy mô đã sử dụng các môi trƣờng tự nhiên có nguồn gốc thực vật nhƣ dịch chiết lá, nƣớc nội nhũ... nên không thành công. Cho đến nay, rất nhiều môi trƣờng dinh dƣỡng đã lần lƣợt đƣợc tìm ra và chúng đều mang tên tác giả đề xuất nhƣ: White (1934), Knudson (1964), Vacin and Went (1949), Murashige – Soog (MS 1962), Knop (1974)... Tuy nhiên mỗi môi trƣờng chỉ thích hợp vài loài cây nhất định cho nên trong nuôi cấy in vitro, tùy thuộc vào quá trình phát triển mà chọn môi trƣờng dinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -14- dƣỡng cho phù hợp. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh thành phần, hàm lƣợng các chất trong môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng phát sinh hình thái của các bộ phận nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi, lá, rễ của cây hoàn chỉnh cũng nhƣ sự sinh trƣởng phát triển của toàn cây. Tùy từng loại giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tùy cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh dƣỡng cần cho sự sinh trƣởng tối ƣu của chúng là khác nhau. Trong môi trƣờng nuôi cấy số lƣợng và các loại hóa chất phải cực kỳ chính xác với từng đối tƣợng cụ thể. Hầu hết các loại môi trƣờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm; các loại muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng, nguồn cácbon, vitamin, các chất điều hòa sinh trƣởng, các nhóm chất bổ sung, chất nền. * Khoáng đa lượng Đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Những nguyên tố N,S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tƣợng nuôi cấy. Riêng Na và Cl cũng đƣợc sử dụng trong một vài loại môi trƣờng, nhƣng chƣa rõ vai trò của chúng [18]. Nitơ (N): đƣợc sử dụng ở dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase. Ammonium đƣợc tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ nhƣ axit amin. Nhƣng điều đáng lƣu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì sinh trƣởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Vì vậy hầu hết các loại môi trƣờng đều dùng nitrat và ammonium dạng phối hợp, nhƣng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp [18]. Môi trƣờng giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trƣờng giàu kali sẽ xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -15- Phốt pho (P) là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu rất cao, thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng ortophotphat hoặc đƣờng photphat. Phốt pho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nuleic. Ngoài ra khi phốt pho ở dạng H2PO4 và HPO4 còn có tác dụng nhƣ một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trƣờng trong quá trình nuôi cấy. Lƣu huỳnh (S) đƣợc sử dụng chủ yếu và tốt nhất là ở dạng muối SO4-2 với nồng độ thấp. * Khoáng vi lượng Là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm, nhƣng rất nhiều nguyên tố vi lƣợng đã đƣợc chứng minh là không thể thiếu đƣợc đối với sự phát triển của mô là: Sắt, Đồng, Kẽm, Mangan, Molybden, Bo, Coban, Iot. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym, chúng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lƣợng [3]. Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia. Thiếu Fe làm giảm lƣợng ARN và sinh tổng hợp protein nhƣng làm tăng lƣợng ADN và axit amin tự do dẫn đến giảm phân bào. Fe thƣờng tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trƣờng thay đổi, phức hợp này mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào [3]. Mangan (Mn): thiếu Mn cũng làm cho hàm lƣợng các axitamin tự do và ADN tăng lên, nhƣng ARN và sinh tổng hợp protêin giảm đến kém phân bào [3]. Bo (B): thiếu B trong môi trƣờng gây nên biểu hiện nhƣ thừa auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhƣng thƣờng là loại mô sẹo xốp, mọng nƣớc, kém tái sinh. Molypden (Mo): đóng vai trò co- factor trong hệ thống nitrat reductase, nhƣ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -16- vậy Mo tác động trực tiếp nên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật. * Nguồn cacbon Cây invitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị dƣỡng, mặc dù dƣới ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhƣng bị hạn chế cho nên việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cácbon dƣới dạng hữu cơ và bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối [12]. Tùy thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô trong trƣờng hợp đặc biệt có thể dùng các loại đƣờng khác nhau: Sucrose, Maltose, Galactose và Lactose. Hàm lƣợng đƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy khác nhau nhƣng thƣờng dùng với hàm lƣợng từ 20-40 g/l [20]. Việc trải qua nồi hấp điện gây ra việc phân hủy đƣờng do sự thủy phân nhƣng không thể hiện điều bất lợi nào cho sự phát triển của thực vật. Trong sản xuất đại trà cây giống, ngƣời ta thƣờng sử dụng đƣờng sucrose có giá rẻ và sẵn có trên thị trƣờng. * Vitamin Các vitamin, các axitamin và các chất phụ gia hữu cơ thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhằm thúc đẩy quá trình sinh trƣởng, phát triển của mô nuôi cấy. Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả năng tự tổng hợp đƣợc hầu hết các loại vitamin, nhƣng thƣờng không đủ về lƣợng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B. Tùy từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy mà các vitamin đƣợc bổ sung một lƣợng thích hợp để mô đạt sinh trƣởng tối ƣu [23]. Vitamin B1 (thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cácbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy hóa khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thƣờng dùng từ 0,1 – 10 mg/l. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -17- Vitamin B6 (piridoxin): tham gia vào thành phần các enzym khử cácbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin. Nồng độ dùng từ 0,1- 1mg/l. Myo- inostol cần đƣợc bổ sung với lƣợng khá lớn từ 50 – 500 mg/l và tỏ ra có tác dụng rất rõ rệt đến sự phân chia của mô. * Chất nền Để cố đinh mẫu cấy trong môi trƣờng nuôi cấy ngƣời ta thƣờng sử dụng chất làm đông cứng môi trƣờng là thạch. Thạch là một loại polysaccharit của tảo biển. Khả năng ngậm nƣớc của thạch khá cao 6- 12g thạch / l nƣớc, ở 800c thạch ngậm nƣớc chuyển sang trạng thái sol và ở 400c trở về trạng thái gel. Độ thoáng khí của môi trƣờng thạch có ảnh hƣởng rất rõ đến sinh trƣởng của mô nuôi cấy. Nồng độ của thạch dùng trong môi trƣờng nuôi cấy dao động tùy thuộc vào độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thƣờng từ 5-10g/l) [21]. Ngoài ra nƣớc pha môi trƣờng phải là loại nƣớc hoàn toàn sạch ion. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng nƣớc cất hai lần và tốt nhất sử dụng hệ thống cất nƣớc thủy tinh. Độ pH của môi trƣờng là yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng hòa tan các chất khoáng trong môi trƣờng, sự ổn định của môi trƣờng, khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của cây. Vì vậy đối với mỗi loại môi trƣờng nhất định và đối với từng trƣờng hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh pH của môi trƣờng về mức ổn định ban đầu. Nếu pH thấp (pH < 4,5) hoặc cao hơn (pH > 7,0) đều gây ức chế sinh trƣởng, phát triển của cây trong nuôi cấy invitro [21]. * Các chất phụ gia Cho đến nay thành phần môi trƣờng ngày càng phong phú, đầy đủ và phức tạp. Ngƣời ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dƣỡng tự nhiên nhƣ: Nƣớc dừa đƣợc sử dụng từ năm 1941 để nuôi phôi của Datura. Kết quả phân tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn