Tài liệu Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng lc msms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơn quỹ Nafosted đã tài trợ một phần kinh phí để em thực hiện đề tài này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động viên em hoàn thành luận văn. Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng không trách khỏi những thiếu sót, em kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 8 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hạnh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon.............................................. 3 1.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon................................................. 3 1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu............................................ 5 1.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ ............................ 6 1.2.1. Sắc ký lỏng ......................................................................................... 6 1.2.2. Khối phổ ............................................................................................. 7 1.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ.................................................................... 11 1.2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng 2 lần khối phổ......................................... 12 1.2.5. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký..................................... 12 1.3. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải..... 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 15 2.2. Phương tiện nghiên cứu......................................................................... 15 2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn...................................................... 15 2.2.2. Thiết bị - dụng cụ .............................................................................. 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 16 2.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử.................................. 16 2.3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký ........................................... 17 2.3.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu...................................................... 18 2.3.4. Thẩm định phương pháp ................................................................... 18 2.3.5. Ứng dụng phân tích mẫu thực ........................................................... 20 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................... 21 3.1. Xây dựng quy trình phân tích............................................................... 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo khối phổ................................................... 21 3.1.2. Khảo sát các điều kiện của sắc ký ..................................................... 23 3.1.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .......................................................... 29 3.1.4. Quy trình phân tích............................................................................ 33 3.2. Đánh giá phương pháp .......................................................................... 35 3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống................................................................. 35 3.2.2. Tính đặc hiệu của phương pháp ........................................................ 36 3.2.3. Độ tuyến tính ..................................................................................... 39 3.2.4. Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp............................................ 40 3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn đ ịnh lượng....................................... 43 3.3. Ứng dụng quy trình, xác định dư lượng kháng sinh có trong nước thải công nghiệp dược ................................................................................... 46 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 48 4.1. Về phương pháp xử lý mẫu .................................................................. 48 4.2. Về phương pháp phân tích.................................................................... 48 4.3. Về thẩm định phương pháp ................................................................. 50 4.4. Về ứng dụng phương pháp ................................................................... 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril MeOH MOXI OFLO CIP NOR HPLC tR Methanol Moxifloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin Norfloxacin Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) Sắc kí lỏng khối phổ (High performance liquid chromatography –Mas Spectrometry) Thời gian lưu S Diện tích pic TB Trung bình RSD Độ lệch chuẩn tương đối IS Chuẩn nội (Internal Standard) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) AOAC Association of Official Agricultủal Chemists PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis) API Ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization) ESI Ion hóa tia điện (Electrospray Ionizaton) APCI Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) APPI Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization) Dược điển Mỹ 38 (The United States Pharmacopoeia) (bản online) HPLC-MS USP 38 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon ... 48 Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu ……5 Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu .. 15 Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS ...................... 23 Bảng 3.2 : Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích chiết ....................... 31 Bảng 3.3: Hiệu suất chiết các kháng sinh khi dùng các dung môi rửa giải khác nhau ...................................................................................... 32 Bảng 3.4 : Kết quả xác định độ thích hợp hệ thống ................................... 36 Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp ...................... 39 Bảng 3.6.a : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức LQC) ........ 41 Bảng 3.6.b : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức MQC) ...... 42 Bảng 3.6.c : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức HQC) ....... 43 Bảng 3.7 : Kết quả giá trị LOD, LOQ của phương pháp .............................. 45 Bảng 3.8 : Kết quả phân tích mẫu nước thải ở một số cơ sở sản xuất .......... 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống LC- MS .................................................................. 6 Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI ............................................. 9 Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba ........................ 10 Hình 3.1: Phổ đồ của các chất phân tích ....................................................... 22 Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột SB- C18 với các thể tích tiêm mẫu 1, 5, 10 µl .................................................. 24 Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột Eclipse- C18 với các thể tích tiêm mẫu 5, 10, 20 µl ......................................... 25 Hình 3.4: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khảo sát các tốc độ dòng 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút ............................................................................ 27 Hình 3.5: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát pha động ........... 29 Hình 3.6: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát thể tích chiết ..... 31 Hình 3.7: Biểu đồ hiệu suất chiết của các dung môi rửa giải ........................ 33 Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu ...................................................... 38 Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định giá trị LOD, LOQ của phương pháp .............. 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Thực trạng kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam với gánh nặng về các bệnh nhiễm khuẩn và chi phí bắt buộc cho việc thay đổi kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới. Trong khi các kháng sinh mới ra đời ngày càng ít, thì việc kháng các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người. Nguyên nhân do trình độ dân trí còn hạn chế, lạm dụng kháng sinh liều cao, kháng sinh mạnh, sử dụng kháng sinh mà không có chỉ định của bác sĩ làm gia tăng tỷ lệ kháng kháng sinh. Ngoài ra, lượng kháng sinh tồn dư trong nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay từ các công ty sản xuất dược phẩm cũng là nguyên nhân quan trọng dẫn tới sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn [7]. Theo kết quả nghiên cứu ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng (2009- 2010) về tình trạng kháng thuốc kháng sinh, tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm cephalosporin thế hệ 3,4 là 66-83%, fluoroquinolon 60%, imipenem 35% [9]. Theo qui định của cục Quản lý Dược hiện nay, các công ty sản xuất thuốc nói chung và các công ty sản xuất kháng sinh nói riêng muốn sản xuất kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP với hệ thống xử lý nước thải. Tính từ năm 2009 đến tháng 7/2014, theo số liệu của Cục quản lý Dược Việt Nam, số kháng sinh sản xuất trong nước nhóm quinolon được cấp số đăng ký chiếm tỷ lệ tương đối so với các kháng sinh nhóm khác. Nếu như kháng sinh Ciprofloxacin có 49 lượt, Ofloxacin có 31 lượt cấp phép đăng kí sản xuất thì Cefadroxil có 27 lượt, Metronidazol 37 lượt được cấp số đăng kí. Tuy vậy, theo quy định hiện hành về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường của Bộ Tài nguyên và Môi trường năm 2011, lại chưa có quy định giới hạn mức hàm lượng cụ thể của kháng sinh trong nước thải [3]. Trong khi đó, chỉ một lượng nhỏ tồn dư kháng sinh trong môi trường tích tụ lâu ngày sẽ làm biến 1 đổi gen của các vi sinh vật. Nguyên nhân này góp phần làm gia tăng tỷ lệ kháng kháng sinh ở nước ta. Vì vậy, vấn đề cấp thiết đặt ra là phải có phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải của các công ty sản xuất nhằm hạn chế sự phát tán của kháng sinh trong môi trường. Ở Việt Nam, đã có một vài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay công ty dược. Các nghiên cứu này tập trung phân tích, định lượng hàm lượng của một kháng sinh cụ thể hoặc hỗn hợp nhiều kháng sinh. Tuy nhiên, chưa có đề tài nào về xác định hàm lượng nhóm kháng sinh quinolon trong nước thải từ các cơ sở sản xuất dược phẩm trong khi đây là nhóm kháng sinh được sử dụng và sản xuất khá rộng rãi ở nước ta. Vì vậy, cần thiết phải xây dựng được một phương pháp xác định giúp phát hiện sự có mặt, với dư lượng kháng sinh ở hàm lượng thấp trong nước thải công nghiệp dược góp phần giảm thiểu nguy cơ phát tán kháng sinh ra ngoài môi trường, từ đó, làm giảm khả năng kháng kháng sinh. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh Quinolon trong nước thải công nghiệp Dược bằng LC- MS/MS” với các mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng được phương pháp xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon (Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin) có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng LC- MS/MS ở nồng độ ppb. 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để xác định dư lượng của một số kháng sinh quinolon có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược trong nước. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH NHÓM QUINOLON 1.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon [6], [11] * Nguồn gốc Không giống như một số thuốc kháng sinh đầu tiên được phát hiện trong thế kỷ trước, các kháng sinh quinolon không phân lập từ các sinh vật sống, mà được tổng hợp bởi các nhà hóa học. * Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng Công thức cấu tạo chung Phân loại và phổ tác dụng: có nhiều cách phân loại quinolon như phân loại dựa trên phổ tác dụng và công dụng, dựa vào phân tử có hoặc không có fluor. Ngày nay, các quinolon được phân loại chi tiết thành 4 thế hệ: 3 Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon Quinolon Phổ tác dụng Công dụng Thế hệ I Enoxacin Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), Nhiễm khuẩn tiết đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu chưa biến chứng niệu Enterobacter, Không tác dụng trên P.aeruginosa Flumequin T1/2 ngắn, bài tiết qua nước tiểu Acid nalidixic Cinoxacin Thế hệ II Phổ rộng với Gram (-), cả P.aeruginosa. Tác dụng trên một số Gram (+), bao gồm cả Staphylococcus pneumoniae, trừ Streptococcus pneumonia. T1/2 dài hơn. Nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn bể thận, sinh dục, tiền liệt tuyến, da và mô mềm Gemifloxacin Phổ rộng với Gram (-), một số cả trên P.aeruginosa; Phổ mở rộng trên Gram (+), cả S. pneumoniae và các vi khuẩn đã kháng penicillin. Gatifloxacin Một số có thời gian bán thải dài hơn. Đợt cấp của viêm phế quản mạn tính, viêm phổi mắc phải ở cộng đồng, nhiễm khuẩn mô mềm, xương Ciprofloxacin Ofloxacin Norfloxacin Lomefloxacin Thế hệ III Levofloxacin Moxifloxacin Thế hệ IV Grepafloxacin Trovafloxacin Alatrovafloxacin Như thế hệ III. Phổ mở rộng với các vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không điển hình. Một số có thời gian bán thải dài hơn. Như thế hệ I, II, III (trừ nhiễm khuẩn niệu phức tạp), nhiễm khuẩn đường hô hấp, ổ bụng, vùng chậu * Cơ chế tác dụng Các quinolon đều ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn. Ngoài ra còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Các quinolon đều là thuốc diệt khuẩn. 4 1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu [8], [21] HIện nay, các kháng sinh quinolon thế hệ I ít sản xuất, kháng sinh thế hệ IV ít hoặc hầu như chưa sản xuất ở Việt Nam. Các kháng sinh thế hệ II và III được sản xuất khá phổ biến. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số kháng sinh quinolon nhóm II và III, các chất này có công thức hóa học và tính chất lý hóa như sau: Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu Quinolon CTHH Tính chất Moxifloxacin C21H24FN3O4, MW: 401.431 Ciprofloxacin Bột hay tinh thể màu vàng hoặc vàng nhạt. Tan trong nước, ít tan trong EtOH. pKa1 = 5,69; pKa2 = 9,42 Bột kết tinh màu hơi vàng. Tan trong nước, khó tan trong MeOH, EtOH. C17H18FN3O3 , MW: 367.80 Norfloxacin pKa1 = 5,76; pKa2 = 8,68 Bột kết tinh màu trắng ngà đến ánh vàng. pKa1 = 5,77 ; pKa2 = 8,68 C16H18FN3O3 ; 319.34 Ofloxacin Tinh thể hình kim không màu. Ít tan trong H2O hoặc EtOH pKa1 = 5,45; pKa2 = 6,2 C18H20FN3O4, 361.38 5 1.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi hiện nay để nghiên cứu các chất với khả năng xác định hàm lượng vết chất phân tích và ứng dụng trong quá trình nhận biết, phân tích cấu trúc phân tử của các chất hữu cơ. Về cơ bản, đây là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ. Hình 1.1 : Sơ đồ hệ thống LC- MS 1.2.1. Sắc ký lỏng [1], [12] Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn được nhồi trên cột và pha động là chất lỏng. Mẫu phân tích được đưa lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. a. Pha tĩnh Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ lưu giữ chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ từ 3-7 μm. Trong phần tổng quan này, chúng tôi trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật phổ biến nhất và cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu. Tùy theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân bố được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. * Sắc ký lỏng pha đảo: Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn 6 các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol như cột C8, C18, cột Phenyl... * Sắc ký lỏng pha thuận: Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn các nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino... ví dụ như cột Silica, Cyano, Amino, ... b. Pha động Trong HPLC, pha động là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm được hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp. Yêu cầu: - Độ tinh khiết cao. - Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh. - Không có bọt khí, không có tiểu phân (siêu âm, lọc). Có 2 cách dùng pha động để rửa giải: - Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký. - Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc ký. Chế độ gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ phân giải. Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn góp phần vào khả năng ion hóa của chất. Chúng có những yêu cầu cao hơn về độ tinh khiết, hàm lượng các tạp chất. Có những dung môi được sản xuất riêng cho LC-MS/MS. 1.2.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) [1], [12], [22] Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá 7 các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion...). 1.2.2.1 Nguyên tắc Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng ion hóa áp suất khí quyển (API- Atmospheric Pressure Ionization) với kiểu ion hóa tia điện (ESI- Electrospray Ionizaton), ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization- APCI), hoặc ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure PhotoionizationAPPI). Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion. Từ đó, xác định các chất. 1.2.2.2. Cấu tạo bộ phận phân tích khối phổ a. Nguồn ion Có 3 kỹ thuật ion hóa được sử dụng là ion hóa tia điện (ESI), ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng máy phân tích với bộ phận ion hóa bằng kỹ thuật ESI để ion hoá các phân tử trung hoà thành các ion phân tử, các mảnh ion hoặc các gốc mang điện tích. Đây là kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn và được xem là kỹ thuật ion hóa “êm dịu” hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol. Với kỹ thuật ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng 8 làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Đến một giới hạn, các hạt sương bị phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Sau đó, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong ESI, các ion được hình thành như sau: Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI b. Bộ phận phân tích khối (Mass analyzer) Các ion hình thành ở nguồn ion hoá sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu. Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích tứ cực, bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight- TOF). Bộ phân tích khối tứ cực chập ba được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây cũng là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này. Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua, được đóng vai trò như bộ lọc khối. Khi một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào 9 tỉ số m/z và trường RF. Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này. Bộ phân tích khối tứ cực chập ba gồm ba tứ cực được ghép nối với nhau. Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp suất cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 có nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận phát hiện. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba c. Bộ phận phát hiện (detector) Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier). Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinod làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinod tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương 10 pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn. 1.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm : * Quét toàn phổ (Full Scan) Khi thao tác với chế độ scan, detector sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ. * Chế độ chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring: SIM) Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ. * SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring) Đối với khối phổ ba tứ cực, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM. SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện. MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ 11 cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện. 1.2.4. Ứng dụng của LC-MS/MS - Nghiên cứu hợp chất mới, đặc biệt là nghiên cứu phát triển thuốc. - Nghiên cứu, xác định hợp chất sinh học phức tạp, định dạng protein. - Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng trưởng. - Phân tích, định lượng thuốc trong dịch sinh học: theo dõi thông số dược động học, sinh khả dụng, theo dõi điều trị. - Phân tích, định lượng thuốc trong các mẫu nước thải bệnh viện, nước thải của các nhà máy sản xuất dược phẩm, các mẫu nước tự nhiên. 1.2.5. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký Các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction– SPE).... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí: - Làm sạch mẫu một cách chọn lọc. - Cô đặc mẫu - Lượng mẫu không cần nhiều. - Lượng dung môi tiêu thụ ít. - Độ thu hồi cao, không gây nhiễu. - Đơn giản, nhanh. Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu mà chúng tôi chọn phương pháp SPE để xử lý mẫu. Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn: Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được 12