Tài liệu Nghiên cứu về listeria monocytogenes trong các sản phẩm thuỷ sản

Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản CHƯƠNG I GIỚI THIỆU SVTH: Võ Thành Hưng 1 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản 1.1. Đặt vấn đề Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế này tạo nên độc lực (virulence) của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này. Listeria monocytogenes là tác nhân gây bệnh listeriosis. Vi khuẩn này được xếp là tác nhân gây bệnh đứng thứ ba thuộc nhóm B sau Streptococcus và E. coli. Đồng thời là nguồn chính lây nhiễm bệnh cho người trong các sản phẩm bảo quan lạnh, vi sinh vật này có khả năng tồn tại tăng trưởng trong sản phẩm suốt quá trình bảo quản lạnh. Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng sẻ phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh các triệu chứng lâm sàn biểu hiện. Trong đó Listeria monocytogenes hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội. Mặc dù bệnh do Listeria monocytogenes gây ra là ở tầng số thấp, 2 - 5 trường hợp trên một triệu người một năm, nhưng tỉ lệ chết do vi khuẩn này là rất cao, 25 - 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh. Đối tượng bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes gây ra thường gặp ở trẻ em, trẻ sơ sinh, người già, thai phụ và người có hệ miễn dịch kém. Listeria monocytogenes gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não hoặc sốt viêm dạ dày ruột, đồng thời cũng là nguyên nhân gây ra trẻ chết sau khi sinh, đẻ non và sẩy thai ở phụ nữ. Do đó, với tính phân bố rộng và khả năng gây ra những tác hại nghiêm đối với người bị nhiễm L. Monocytogenes và được sự chấp thuận của khoa Môi trường và Công SVTH: Võ Thành Hưng 2 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản nghệ sinh học, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản”. 1.2. Mục đích Cấu trúc và cơ chế gây bệnh của Listeria monocytogenes. 1.3. Nội dung nghiên cứu  Khảo sát về cấu trúc của Listeria monocytogenes.  Khảo sát về sự phân bố của Listeria monocytogenes.  Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay.  Một số phương pháp xác định Listeria monocytogenes. SVTH: Võ Thành Hưng 3 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản CHƯƠNG II TỔNG QUAN SVTH: Võ Thành Hưng 4 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản 2.1. Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm 2.1.1. Salmonella sp Hình 2.1: Salmonella vi khuẩn chuyên chở bệnh thương hàn 2.1.1.1. Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Salmonella  Loài: Salmonella sp 2.1.1.2. Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm. Hầu hết các loài Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vậy có khả năng di động, không sinh bào tử. Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 m. Salmonella là vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 370C, pH tối ưu 7,2 - 7,6. Để mọc trên các môi trường thông thường. SVTH: Võ Thành Hưng 5 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản  Đặc điểm sinh hóa: Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, Indol âm tính, Methyl Red dương tính, VP âm tính, Citrat thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính)... Lên men sinh hơi các đường glucose, manit, sorbitol, lên men không đều sacharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose … (Tô Minh Châu và Trần Bích Liên, 1999). 2.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên  Kháng nguyên O Mỗi Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố kháng nguyên. Hiện nay người ta biết có 67 yếu tố kháng nguyên O. Việc xác định các yếu tố kháng nguyên O là hết sức quan trọng để định nhóm và định type.  Kháng nguyên H Chỉ có ở những Salmonella có lông. Kháng nguyên H của Salmonella có thể tồn tại dưới 2 pha.  Pha đặc hiệu (phase 1): là những yếu tố có tính chất đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn Salmonella, gồm 28 kháng nguyên lông được kí hiệu bằng chữ cái a, b, c, g,….  Pha không đặc hiệu (phase 2): được kí hiệu số 1, 2, 3,…. (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)  Kháng nguyên Vi Là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài vách tế bào vi khuẩn, dưới dạng một màng mỏng không nhìn thấy được ở kính hiển vi thường. Kháng nguyên Vi chỉ có ở 2 type huyết thanh Salmonella typhi và S. paratyphi C. Người ta dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên để xếp loại Salmonella. SVTH: Võ Thành Hưng 6 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Bảng 2.1: Phân biệt các kháng nguyên O, H, Vi: Kháng nguyên Tính chịu nhiệt O Ổn nhiệt 2h30 ở 1000C Vi H Tác động của Formol 50% alcohol 50% Kháng Bị ngăng trở ngưng kết Biến nhiệt 15’06” ở 1000C Nhạy cãm Kháng Biến nhiệt 2h ở 1000C Nhạy cãm Kháng Hình 2.2: Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella. 2.1.1.4. Yếu tố độc lực Có hai loại độc tố là nội độc tố và ngoại độc tố Ngoại độc tố đường ruột (entero toxin) có hai loại là LT và ST.  Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcuclase trong tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-monophosphate), c-AMP SVTH: Võ Thành Hưng 7 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản sẽ kích thích tiết Cl- và HCO3- ra khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na+ vào bên trong tế bào. Hậu quả tích nước trong ống ruột dẫn đến tiêu chảy.  Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự như LT. ST hoạt hóa enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cycle guanosine 5-monophosphate) ở trong tế bào dẫn tới hiện tượng tiêu chảy. 2.1.1.5. Khả năng gây bệnh Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống…. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua 1 màng nhày và vào thành ruột. Các tế bào Paneth của niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân người hoặc động vật, từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng nhiễm vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. trong quá trình giết mổ củng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm.  Bệnh thương hàn Hình 2.3: Viêm dạ dày – ruột SVTH: Võ Thành Hưng 8 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhi, sau đó đến S. paratyphi A, còn S. paratyphi B và S. paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người này sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi khỏi bệnh về mặt lâm sàng, khoảng 5% bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài hàng tháng hoặc hàng năm. Ở họ, ổ chứa Salmonella là đường mật và vi khuẩn vẫn được tiếp tục đào thải theo phân ra ngoại cảnh. Người lành mang vi khuẩn là nguồn lan truyền bệnh quan trọng. Sinh bệnh học: Trực khuẩn thương hàn vào cơ thể qua đường tiêu hóa đến ruột non thì chui qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đó chúng nhân lên và một phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng ra nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở bụng, gây thương tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột. Ngoài ra, nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba, gây ra trạng thái sốt kéo dài, li bì, và gây ra biến chứng trụy tim mạch... Từ các hạch mạc treo ruột vi khuẩn lan tràn vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết và lan đi khắp cơ thể, rồi vi khuẩn vào mật và từ đó quay trở lại ruột. Vi khuẩn theo phân ra ngoại cảnh.  Các bệnh khác Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là một nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa trong các trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà Salmonella typhimurium... là tác nhân hay gặp nhất, sau đó là Salmonella enteritidis... Nhiễm trùng nhiễm độc do Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 đến 48 giờ. Bệnh biểu hiện có sốt, nôn, tiêu chảy. Bệnh khỏi sau 2 - 5 ngày, không có biến chứng. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thương ở ngoài đường tiêu hóa như viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi...  Khả năng gây bệnh của một số loài:  Salmonella typhi : Chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi gây ra.  Salmonella paratyphi A : Chỉ gây bệnh thương hàn cho người và cũng hay gặp ở nước ta sau S. typhi. SVTH: Võ Thành Hưng 9 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản  Salmonella paratyphi B : Gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh thường gặp ở các nước châu Âu.  Salmonella paratyphi C : Gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết. Bệnh thường gặp ở các nước Đông Nam Á.  Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis : Gây bệnh cho người và gia súc, gặp trên toàn thế giới. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn do ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella.  Salmonella cholerae suis : Loại này hay gây nhiễm khuẩn huyết. 2.1.2. Campylobacter sp Hình 2.4: Phẩy khuẩn Campylobacter 2.1.2.1. Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Eubateriales  Họ: campylobacteriaceae  Chi: Campylobactes  SVTH: Võ Thành Hưng Loài: Campylobactes sp 10 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản 2.1.2.2. Đặc điểm Campylobactes là những vi khuẩn bé, mảnh, Gram âm, hình dấu phẩy nhọn hai đầu, có kích thước 0,2-0,8m x 0,5-5m, rất di động nhờ có 1 lông ở 1 đầu, không sinh bào tử. Nuôi cấy Campylobacters trên môi trường nhân tạo thường khó khăn vì vi khuẩn đòi hỏi điều kiện vi hiếu khí (micro-aerophile). Mọc được ở 370C nhưng mọc tốt hơn ở 420C, không mọc ở 250C. Thường dùng các môi trường chọn lọc như thạch máu Columbia, thạch máu tryptose để phân lập vi khuẩn. Campylobacters mọc chậm sau 2 đến 3 ngày. Bảng 2.2: Đặc điểm sinh hóa – phân biệt loài và dưới loài của vi khuẩn Campylobacter Phát triển Loài – dưới loài 250 420 C C C. fetus ss vene + C. fetus ss fetus Tính chất sinh hóa 1%G 3.5%N Catalase Nitrate H H2S - - - + - - - + - + - + - - - C. jejuni - + + - + - + - C.coli - + + - + - - - C. cryaerophila + - - - + + - - C. faecalis - + + + + + - + C. lari - + + - + + - - C. hyointestinalis + + + - + + - + C. spu ss spu + + - - - + - + C. spu ss bu + + + + - + - + C. upsaliensis - + + - - + - - Chú thích: 1%G = 1% glycerin 3,5%N = 3,5% NaCl H = Hippurate hydrolysis sinh H2S trên môi trường TSI (< 3 ngày) SVTH: Võ Thành Hưng 11 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản C. fetus ss vene = C. fetus subsp venerealis C. fetus ss fetus = C. fetus subsp fetus C. Spu ss Spu = C. Sputorum subsp Sputorum C. Spu ss bu = Sputorum subsp bubulus Vi khuẩn dương tính Oxydase và Catalase, phân hủy nitrat, H2S dương tính, không oxy hóa hoặc không lên men các loại đường. 2.1.2.3. Cấu trúc kháng nguyên Các nghiên cứu về kháng nguyên của Campylobacter phần lớn dựa vào cấu trúc của loài C. jejuni. Đến nay đã xác định được 3 loại kháng nguyên đó là:  Kháng nguyên bề mặt LPS: có bản chất là lipopolysaccharide, gồm ít nhất 50 serotype bền với nhiệt.  Kháng nguyên lông H: có bản chất là protein với hơn 36 serotype  Kháng nguyên màng ngoài OMP (Outer membrane protein): là loại protein bề mặt chuyên biệt và duy nhất để sản xuất vacin. (Phan Hồng Diển, 2005) 2.1.2.4. Yếu tố độc lực Độc tố của Campylobacter gồm hai loại độc tố: nội độc tố (endotoxin) và ngoại độc tố (exotoxin). Trong ngoại độc tố có chứa độc tố đường ruột (enterotoxin) và độc tố thần kinh (cytotoxin). Vai trò tác động của các loại độc tố này vẫn chưa được biết rõ. Liều gây độc ở người là 500 – 1000 vi khuẩn. Khả năng của vi khuẩn Campylobacter ở người có lẽ do số lượng lẫn độc tố (Hà Huy Khôi, 2004). 2.1.2.5. Khả năng gây bệnh Campylobacters là một tác nhân gây viêm ruột cấp tính thường gặp ở người. Chúng xâm nhập vào người do ăn uống các thức ăn và nước bị nhiễm khuẩn, do tiếp xúc với động vật, chủ yếu là với gia cầm, gia súc. Thời gian ủ bệnh 2 - 11 ngày. Thể lâm sàng thường gặp là bệnh cảnh của một viêm ruột cấp tính với dấu hiệu đau bụng, tiêu chảy dữ dội, phân nước có khi có máu và mủ. Có trường hợp xảy ra nhiễm khuẩn huyết. Tiêu chảy do C. jejuni kéo dài 5 - 10 ngày. Đa số trường hợp khỏi không cần điều trị bằng kháng sinh. SVTH: Võ Thành Hưng 12 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Cơ chế gây bệnh chưa rõ. Campylobacters có độc tố ruột, nhưng có ý kiến cho rằng vi khuẩn này có khả năng xâm nhập giống như Shigella. Campylobacters nhân lên chủ yếu ở hồi tràng và hổng tràng. Bệnh viêm ruột do C. jejuni xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới, gây tiêu chảy cấp ở người, đặc biệt ở trẻ em và ở khách du lịch từ các nước phát triển đến các nước nhiệt đới. SVTH: Võ Thành Hưng 13 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Bảng 2.3: Khả năng gây bệnh của Campylobacter. Loài Nguồn nhiễm Bệnh trên người Nhiễm trùng máu, C. fetus subsp fetus Trâu, bò, cừu sẩy thai, viêm màng não và bệnh dạ day ruột C. fetus subsp venerealis Trâu, bò Nhiễm trùng máu C. mucosalic Không gây bệnh C. cryaerophila Heo Trâu, bò, heo, ngựa, cừu Bệnh trên động vật Sẩy thai trên trâu, bò, cừu và rối loạn tiêu hóa Sẩy thai, chết phôi và vô sinh Viêm ruột và hoại tử trên heo Trong phân gia súc Chưa xác định khỏe, đôi khi gây chết phôi Bệnh dạ dầy ruột, Gia cầm, heo, C. jejuni subbp deylei trâu, bò, cừu, chó, chim, côn trùng, mèo và trong môi C. jejuni subsp jejuni trường Bệnh dạ dày ruột, sẩy thai, viêm màng não,viêm khớp, hội chứng cuillian-barre viêm vú, sẩy thai vào cuối giai đoạn của mang thai hoặc đẻ con yếu hoặc chết vài ngày sau khi sinh, gà thường là vật mang trùng C. Helvetius C. laridis C. upsaliensis Chó, mèo Không gây bệnh Gia cầm, heo, Bệnh dạ dày ruột, trâu, bò, cừu, viêm nhiễm trùng chó, chim, khỉ máu Chó, mèo, người Apse, nhiễm trùng máu Bệnh dạ dày ruột Bệnh dạ dày ruột Bệnh dạ dày ruột (Verkens, 1996) SVTH: Võ Thành Hưng 14 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản 2.1.3. Escherichia Coli Hình 2.5: Escherichia Coli 2.1.3.1. Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Escherichia  Loài: e. Coli 2.1.3.2. Đặc điểm  Hình thái và đặc điểm nuôi cấy E.coli là trực khuẩn Gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng E.coli có vỏ polysaccharide, không sinh bào tử. E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản. Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài. Đây là những vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 500C. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH tối ưu là 4,4. SVTH: Võ Thành Hưng 15 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Phát triển mạnh trong môi trường Mac Conkey, EMB. Trên môi trường EMB, E. coli cho khuẩn lạc có màu ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng lớn hơn 0,5m. Trong môi trường lỏng, E. coli làm đổi màu môi trường, sinh hơi hoặc làm đục môi trường.  Đặc tính sinh hóa E.coli lên men nhiều loại đường sinh axit và sinh hơi như: Glucose, lactose, ramnose; khử nitrat thành nitric, gây nhầy nhớt hư hỏng thực phẩm, indol dương tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính. 2.1.3.3. Cấu trúc kháng nguyên Gồm có các loại kháng nguyên  Kháng nguyên O (somatic antigen): là kháng nguyên của thành tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide. Các đặc tính của kháng nguyên O  Chịu nhiệt, không bị hủy ở 1000C trong 2 giờ.  Không bị hủy với cồn 50%.  Bị hủy bởi focmol 5%.  Rất độc (1/20mg gây chết chuột sau 24 giờ) Kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ gây ra phản ứng ngưng kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò quan trọng đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.  Kháng nguyên H (Flagellar antigen): được cấu tạo bởi protein, khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẻ xảy ra hiện tượng ngưng kết H. kháng nguyên H có các đặc tính sau  Không chịu nhiệt.  Bị hủy bởi cồn 50%.  Bị hủy bởi protease.  Không bị hủy bởi focmol 5%. SVTH: Võ Thành Hưng 16 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản Kháng nguyên K (Capsular antigen): loại này chỉ có ở một số ít vi khuẩn đường ruột, được cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein. Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn sẽ ngăn cảng phản ứng ngưng kết O.  Kháng nguyên tiêm mao F (Fimbrial antigen): có dạng hình roi, dài khoảng 4m, thẳng hay xoắn, đường kính 0,7 – 2,1m, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Hiện nay có khoảng 700 tuype huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp của các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó người ta có thể định danh vi khuẩn. 2.1.3.4. Yếu tố độc lực Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, mỗi nhóm sinh ra các loại độc tố khác nhau, hiện có 5 nhóm chính : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E.Coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC (Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative E.Coli) và EIEC (Enteroinvasive E.Coli)  Nhóm STEC STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2. Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chịu nhiệt EAST1. EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper, 1998). Trên plasmid này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open reading frame ORF) là hlyCABD. Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin. Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng có ở SVTH: Võ Thành Hưng 17 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm STEC  Nhóm EPEC Các yếu tố độc lực chính bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần thiết cho việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP ( bundle – forming pilus ), PER ( plasmid – encoded regulator ) và Ler ( LEE – encorded regulator). Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP (mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô và CDT ( Cytolethan distending toxin )  Nhóm ETEC Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF).  Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC gồm những E. Coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST.  Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT của E.Coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (cholera toxin - CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor, hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào. Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi. Đích đến của LT trong tế bào là enzym adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. Vì vậy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được họat hóa dẫn đến SVTH: Võ Thành Hưng 18 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản sự phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998). Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của LT và CT, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ chế phức tạp hơn. Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến những prostaglandin E (PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng hợp và phóng thích những chất chuyển hóa của acid arachidonic như prostaglandin và leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu động ruột. Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột. Cơ chế thứ ba là CT và LT gây đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ.  Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Sta (hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia enterocolitica và V. cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.  Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF). CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Gen của CFA thường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT. SVTH: Võ Thành Hưng 19 Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản  Nhóm EAEC Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và độc tố EAST – 1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). AFF được xem là yếu tố quyết định độc lực. Ba loại AAF đã được biết đến gồm AAF/I, AAF/II và AAF/III, trong đó loại I và loại II có cấu trúc bó, loại III có cấu trúc dạng sợi riêng biệt. Các AAF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch lên tế bào Hep – 2. Yếu tố aggR có vai trò điều hòa sự biểu hiện của các AAF. Protein Pet được tiết ra màng ngoài vi khuẩn gây ra sự tụ dịch và gây độc cho biểu mô tiêu hóa. EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô. Ngoài các yếu tố độc lực nêu trên, EAEC còn tiết ra một protein làm tan máu và làm mất thăng bằng vận chuyển protein qua màng. Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC chủ yếu được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa. Một số yếu tố độc lực được mã hóa trên các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu  Nhóm EYIC EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140 MDa. Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa : Invasion plasmid antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc ruột giống một số Shigella. Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác. 2.1.3.5. Khả năng gây bệnh Khả năng gây bệnh rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với cơ thể yếu thì gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy.  Bệnh tiêu chảy do E.coli Các E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người gồm có:  Enterotoxigenic E.coli (ETEC) Là loại E.coli sinh độc tố ruột. ETEC là một nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy nặng giống triệu chứng do Vibrio cholerae 01 gây ra ở người. Bệnh tiêu chảy do SVTH: Võ Thành Hưng 20