Tài liệu Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên việt nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐỖ TIẾN MẠNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐỖ TIẾN MẠNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình Hà Nội - 2015 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong Luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Học viên Đỗ Tiến Mạnh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Quý Thầy, Cô đã giảng dạy trong chương trình Cao học khóa 17 - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người đã truyền đạt cho tôi kiến thức hữu ích làm cơ sở giúp tôi thực hiện tốt luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, người Thầy luôn tận tình hướng dẫn, dìu dắt và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ khoa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô chú, anh chị đang làm việc tại Phòng Công nghệ Gen Động vật – Viện Công nghệ Sinh học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập tại phòng thí nghiệm của Viện. Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên để tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn thạc sĩ với kết quả tốt nhất. Học viên Đỗ Tiến Mạnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG .................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH .................................................................................... vii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ......................................................................... 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 4 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ............................ 4 1.1. Tổng quan về nấm Cordyceps spp......................................................................... 4 1.1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps spp. ............................................................. 4 1.1.2. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng .... 6 1.1.3. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới .................................. 6 1.1.3.1. Đa dạng và phân bố ................................................................................ 6 1.1.3.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới.......................... 8 1.1.4. Tình hình nghiên cứu Cordyceps tại Việt Nam........................................ 9 1.1.4.1. Đa dạng và phân bố ................................................................................ 9 1.1.4.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. ở Việt Nam ......................... 12 1.1.5. Thành phần hóa học, hoạt chất sinh học và giá trị dược liệu của nấm Cordyceps spp. .................................................................................................... 13 1.1.5.1. Thành phần hóa học và hoạt chất sinh học .......................................... 13 1.1.5.2. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps spp. ........................................... 14 1.2. Sơ lƣợc về hoạt chất Adenosine...........................................................................16 1.2.1. Cấu trúc hóa học của Adenosine ............................................................ 16 1.2.2. Ứng dụng của Adenosine .......................................................................... 16 1.3. Sơ lƣợc về hoạt chất Beauvericine ......................................................................17 1.3.1. Cấu trúc hóa học của Beauvericine ........................................................ 17 1.3.2. Ứng dụng của Beauvericine .................................................................... 18 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20 2.1. Nguyên liệu ..............................................................................................................20 iii 2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 20 2.1.2. Hóa chất sử dụng ..................................................................................... 20 2.1.3. Thiết bị sử dụng ....................................................................................... 21 2.1.4. Môi trường nuôi cấy ................................................................................ 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................22 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật .......................................................................... 22 2.2.1.1. Phân lập và thuần khiết vi nấm............................................................. 22 2.2.1.2. Hoạt hóa giống...................................................................................... 22 2.2.1.3. Nghiên cứu khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học trên môi trường lỏng và môi trường rắn của chủng nấm nghiên cứu ........................................... 23 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ............................................................... 24 2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 24 2.2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế.................................................... 26 2.2.2.3. PCR ....................................................................................................... 26 2.2.2.4. Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR ................................. 27 2.2.2.5. Xác định trình tự gen ............................................................................ 27 2.2.3. Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC).................................................. 28 2.2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................. 29 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 30 3.1. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng nấm ................................................30 3.2. Đánh giá khả năng tạo thể quả của các chủng nấm phân lập.....................33 3.3. Xác định tên khoa học của chủng nấm phân lập bằng trình tự ITS ...........34 3.4. Lựa chọn môi trƣờng thạch thích hợp cho nhân giống ................................36 3.5. Lựa chọn môi trƣờng lỏng thích hợp cho nhân giống...................................38 3.6. Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối tạo hoạt chất sinh học ................................40 3.6.1. Nhân nuôi trên môi trường lỏng tĩnh ..................................................... 40 3.6.2. Nhân nuôi trên môi trường rắn .............................................................. 42 3.7. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi trƣờng lỏng tĩnh và môi trƣờng rắn............................................................................44 3.7.1. Kết quả trên hệ thống LC/MS. ................................................................. 44 iv 3.7.1.1. Định lượng Adenosine. ........................................................................... 44 3.7.1.2. Định lượng Beauvericine ....................................................................... 47 3.7.2. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi trường lỏng tĩnh và môi trường rắn .................................................................. 48 3.7.2.1. Trong môi trường lỏng tĩnh.................................................................... 48 3.7.2.1. Trong môi trường rắn ............................................................................ 49 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 52 4.1. Kết luận .....................................................................................................................52 4.2. Kiến nghị ...................................................................................................................52 PHỤ LỤC .................................................................................................... 53 Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 54 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng ................................................................... 20 Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ....................... 21 Bảng 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu (g/l) ......... 21 Bảng 2.4. Thành phần PCR .......................................................................... 27 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt PCR ..................................................................... 27 Bảng 2.6. Gradient nồng độ thiết lập ............................................................ 28 Bảng 3.1. Khả năng tạo thể quả của các chủng nấm đã phân lập .................. 33 Bảng 3.2. Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường hoạt hóa lỏng . 39 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh khối lỏng tĩnh ......... 41 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên quá trình tạo thể quả .... 42 Bảng 3.5. Các nồng độ Adenosine sử dụng trong xây dựng đường chuẩn định lượng............................................................................................................ 46 Bảng 3.6. Các nồng độ Beauvericine sử dụng trong xây dựng đường chuẩn định lượng .................................................................................................... 48 Bảng 3.7. Hàm lượng Adenosine, Beauvericine trong sinh khối lên men lỏng tĩnh ............................................................................................................... 49 Bảng 3.8. Hàm lượng Adenosine và Beauvericine trong sinh khối lên men rắn ................................................................................................................ 50 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Nấm C.takaomontana /thể vô tính và hữu tính ............................... 5 Hình 1.2. Nấm Isaria tenuipes / thể vô tính của C.takaomontana .................. 5 Hình 1.3. Nấm Cordyceps crinalis. ................................................................ 7 Hình 1.4. Nấm Cordyceps sinensis (Beck). .................................................... 7 Hình 1.5. Nấm Cordyceps militaris ................................................................ 8 Hình 1.6. Nấm C.nutans. .............................................................................. 11 Hình 1.7. Nấm C.sphecocephala. ................................................................. 11 Hình 1.8. Nấm Cordyceps prolifica.............................................................. 12 Hình 1.9. Nấm Cordyceps pseudomilitaris. .................................................. 12 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Adenosine ...................................................... 16 Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của Beauvericin .............................................. 17 Hình 3.1. Mẫu VN3...................................................................................... 30 Hình 3.2. Mẫu VN4...................................................................................... 30 Hình 3.3. Mẫu VN6...................................................................................... 30 Hình 3.4. Mẫu VN7...................................................................................... 30 Hình 3.5. Mẫu VN8...................................................................................... 30 Hình 3.6. Mẫu VN9...................................................................................... 30 Hình 3.7. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A3 ................... 32 Hình 3.8. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A6 ................... 32 Hình 3.9. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A7 ................... 32 Hình 3.10. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A8 ................. 32 Hình 3.11. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A9 ................. 33 Hình 3.12. Ảnh điện di DNA của chủng A9 ................................................. 34 Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR ......................................................... 35 Hình 3.14. Trình tự ITS của chủng A9 ......................................................... 35 Hình 3.15. Sơ đồ cây phân loại chủng C.takaomontana A9 ......................... 36 Hình 3.16. Biểu đồ tốc độ tăng trưởng đường kính khuẩn lạc của chủng C.takaomontana A9 ................................................................................... 37 vii Hình 3.17. Hình ảnh khuẩn lạc chủng A9 trên các môi trường ..................... 38 Hình 3.18. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần) ................................................................ 40 Hình 3.19. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần) ................................................................ 40 Hình 3.20. Chủng nấm A9 nuôi lỏng tĩnh trên các môi trường ..................... 42 Hình 3.21. Sinh khối tươi của chủng A9 trên các môi trường....................... 42 Hình 3.22. Chủng C.takaomontana A9 nảy mầm trên các môi trường DD ...... 43 Hình 3.23. Thể quả tươi của chủng A9 trên các môi trường DD .................. 44 Hình 3.24. Sắc kí đồ HPLC UV 260 nm của chất chỉ thị Adenosine (A) và của mẫu (B) ........................................................................................................ 45 Hình 3.25. Sắc kí đồ MS ESI Positive của chất chỉ thị Adenosine ............... 46 Hình 3.26. Sắc kí đồ Sim 806,0 của chất chỉ thị Beauvericine (A) và của mẫu (B) ............................................................................................... 47 Hình 3.27. Sắc kí đồ MS - ESI Positive của chất chỉ thị Beauvericine .... 48 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MT : Môi trường LT : Lỏng tĩnh HHL : Hoạt hóa lỏng VN3,4,6,7,8,9 : Các mẫu thu thập tại Việt Nam A3,6,7,8,9 : Các chủng nấm đã phân lập DD : Môi trường dinh dưỡng OD : Opfical Density PCR : Polymerase Chain Reaction ITS : Internal transcribed spacer HPLC : High-performance liquid chromatography ix MỞ ĐẦU Cordyceps spp. là nhóm các loài nấm gây bệnh ở côn trùng, còn được gọi là Đông trùng Hạ thảo dựa vào đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chúng, theo đó mùa đông nấm ký sinh trên vật chủ ở giai đoạn hệ sợi, mùa hè mọc thành cây nấm. Cordyceps spp. được biết đến là dược liệu quý sử dụng trong y học cổ truyền Trung Hoa. Đông trùng hạ thảo có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị quý như Adenosine, Cordycepin, Cordyceptic acid, D manitol, Beauvericin, nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy Ethyl Adenosine Analogs)… với tác dụng tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, điều trị hen suyễn, viêm phế quản, hạn chế khả năng suy thận, tiêu viêm, ức chế nhiều loại vi sinh vật có hại… Không chỉ được sử dụng trong dược phẩm, Đông Trùng Hạ thảo còn được dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị một số bệnh trong đó có ung thư và tăng cường sức khỏe. Trên thị trường Việt Nam hiện đang lưu hành một số sản phẩm Đông trùng Hạ thảo như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana xuất xứ Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản nhưng đa phần là của Trung Quốc. Trong thực tế, C.sinensis mới chỉ tìm thấy ở Tây Tạng, việc nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo cho đến nay chưa hiệu quả, sản phẩm vẫn phải khai thác từ tự nhiên nên giá thành rất cao. C.militaris đã được nghiên cứu nuôi nhân tạo trên nhiều quy mô từ nhỏ đến lớn ở Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc… Việt Nam cũng đã tiến hành nhân nuôi ở quy mô nhỏ, nhưng chưa chủ động được giống, còn phụ thuộc vào nước ngoài, nên không chủ động và khó kiểm soát được chất lượng của giống cũng như sản phẩm tạo ra. Trong khi đó, các nghiên cứu cho thấy, C.takaomontana có gần như đầy đủ các hợp chất sinh học quý như C.militaris và C.sinensis tuy hàm lượng thấp hơn. Đặc biệt, dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol chỉ có trong C.takaomontana có tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50 ở mức mg/ml [20,30], mạnh hơn so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần [36] và 1 Beauvericin với 12 tác dụng gây độc nhiều dòng tế bào ung thư người với các liều gây độc khác nhau, kháng được 10 loại vi khuẩn gram dương và 9 loại vi khuẩn gram âm gây bệnh trên người... [42]. Ở Việt Nam, Phạm Quang Thu và cộng sự năm 2009 và 2010 đã phát hiện C.takaomotana tại vườn Quốc gia Tam Đảo. Ở khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống, Nghệ An cũng thu thập được 29 mẫu, trong đó có C.takaomontana. Trần Ngọc Lân và cộng sự năm 2008 đã xác định được trong hơn 200 mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 loài, đặc biệt chi C.takaomontana có 11 loài, trong đó Isaria tenuipes (thể vô tính của C.takaomontana) là loài phổ biến ở vườn Quốc gia Pù Mát [12]. Có thể thấy rằng, nguồn gen nấm C.takaomontana ở Việt Nam rất phong phú, có thể khai thác nên chủ động được giống. Ngoài ra, thời gian nhân nuôi ngắn, nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất loại nấm này như gạo, nhộng tằm... ở Việt Nam rất dồi dào. Vì vậy, việc nghiên cứu khai thác, phát triển nguồn gen nấm C.takaomontana chứa hoạt chất sinh học quý làm dược liệu có tính khả thi, có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng, mở ra khả năng phát triển một số ngành nghề mới, đầy tiềm năng. Với những lý do như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị”. 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tuyển chọn được chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập, mô tả đặc điểm hình thái mẫu nấm, thuần khiết một số chủng nấm C.takaomontana. - Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chủng thuần khiết ( hệ sợi, khả năng sinh bào tử). - Nghiên cứu trình tự ITS của chủng nấm C.takaomontana tuyển chọn. - Nghiên cứu môi trường thạch thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm C.takaomontana. - Nghiên cứu môi trường lỏng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm C.takaomontana. - Nghiên cứu khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học có giá trị 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về nấm Cordyceps spp. 1.1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps spp. Cordyceps spp. (tên gọi khác là Đông trùng Thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đông trùng), là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng. Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm, gây chết và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm nguồn dinh dưỡng để nấm phát triển. Ở giai đoạn này, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Theo hệ thống phân loại, Cordyceps spp. thuộc chi Cordyceps, họ Clavicipataceae, bộ Hypocreales, lớp nấm Ascomycotes, ngành Ascomycota [52]. Cordyceps spp. là loại nấm dược liệu quý và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Hiện nay, Cordyceps có hơn 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông Trùng Hạ Thảo như Cordyceps liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis Zhang, C. Shanxiensis Liu,… Ngoài ra, còn có các chủng Cordyceps militaris, Cordyceps nutans Pat, C.tricentri Yasuda, C.gunnii Berk. Tuy nhiên cho đến nay, các nước trên thế giới, mới chỉ nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng nhân tạo một số loại nấm như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana,…Theo một số nghiên cứu cho thấy, các chủng nấm Cordyceps spp. khác cũng được tìm thấy tại một số nước châu Âu ( Pháp, Nga, Đức), và một số nước Châu Á khác (Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam). Cordyceps takaomontana được phát hiện và mô tả lần đầu tiên bởi Yakush. và Kumaz. (1941) tại đảo Honshu - tỉnh Musashi (nay là quận Saitm và Kanagawa - Tokyo - Nhật Bản). C.takaomontana tồn tại ở 2 thể hữu tính và vô tính (hình 1.1), còn được gọi bằng nhiều tên khác là Paecilomyces tenuipes hoặc Isaria japonica [9]. 4 Hình 1.1. Nấm C.takaomontana/ thể vô tính và hữu tính (nguồn: Cordyceps.us) + Thể hữu tính: Nấm (stromata) mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vảy, nấm màu vàng chanh nhạt, cuống nấm hình trụ, kích thước 10 - 45 x 1 - 1,5mm. Thể quả dạng chai (perithecia), có hình dạng bình nổi trên bề nặt của phần chóp nấm. Túi bào tử hình chùy, kích thước 1100 1200 x 2,2 - 3,0µm, phần mũ của túi bào tử có hình trứng đến gần cầu, kích thước 2,5 x 3,0µm. Bào tử túi dài, mảnh và dễ bị gãy thành đoạn bào tử, đoạn bào tử có kích thước 6 - 8 x 0,5 - 0,8µm [9]. + Thể vô tính: Hình thái của thể quả nấm (synnemata) bao gồm 2 phần chính: Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structure). Cuống của nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và số lượng thể quả có trên một ký chủ, thường có chiều dài từ 0,5 đến 4,5cm. Phía trên của cuống nấm là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh và căng phồng chứa đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào tử. Bào tử vô tính có hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5 - 1,0 x 2,5 - 3,0µm [9] (hình 1.2). Hình 1.2. Nấm Isaria tenuipes/ thể vô tính của C.takaomontana (nguồn: Daniel Guez, 1989) 5 1.1.2. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải qua 3 giai đoạn: Giai đoạn xâm nhập: Bắt đầu từ khi bào tử nấm nảy mầm đến lúc kết thúc việc xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm, phát sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulolase. Các enzyme nay được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác nhau giữa các loài và ngay cả trong một loài. Enyzm protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy chitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu quả diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng. Giai đoạn sống ký sinh của nấm: Hệ sợ nấm trong khoang cơ thể tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm nhiễm vào hệ hô hấp, làm giảm khả năng hô hấp của ấu trùng khiến hoạt đông của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả làm vật chủ mất khả năng kiếm soát hoạt động sống và dẫn đến chết [41]. Ở giai đoạn cuối cùng (sau khi vật chủ chết), sợi nấm phát triển rất nhanh đồng thời tiết độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch của côn trùng. Trong giai đoạn gây độc vật chủ, một số loài nấm giết chết vật chủ trước khi gây độc toàn bộ cơ thể côn trùng [12]. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới 1.1.3.1. Đa dạng và phân bố Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả 33 loại nấm Đông Trùng Hạ Thảo tại Nhật Bản gồm: C.arigota, C.Longissisma, C.yakushimensis, C.sobolifera, C.heteropoda, C.tricentri, C.coccidiicola, C.nutans, C.ruinosa, C.crilalis, C.militaris, C.takaomontana, C.neovolkiana, C.nakazawai, C.purpureostroma, C.ferruginosa, 6 C.annullata, C.clavata, C.atrovirens, C.gracilioides, C.stylophora, C.macularis, C.discoideocapitata, C.spheciceophala, C.japonensis, C.japonica, C.ophioglossoides, C.capita, C.nigripoda, C.roeostroma, C.michiganensis, C.subbssesilli [54]. Hình 1.3. Nấm Cordyceps crinalis (nguồn: cordyceps.us) Năm 2000, Mao X.L và cộng sự đã mô tả đặc điểm hình thái, ảnh minh họa và công dụng cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài C.hawkesii Gray, Cordyceps barnesii Thwaites, C.nutans Pat, C.capiata (Holmsk; Fk) Link, C.crassiora Zang, Yang et Li, C.gunii (Berk), C.kyushensis Kobayasi, C.martialis Gray, C.tubeculata (Leb), C.ophoglossoides (Ehrenb) Link, C.sobolifera (Hill).Berk, C. sinensis (Beck) Sacc, C.militaris Link [35]. Hình 1.4. Nấm Cordyceps sinensis (Beck) (nguồn: nepl.com.np) Tại Hàn Quốc, Sung Jae Mo và cộng sự (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái của 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm các loài: C.adaesanensis, C.agriota Kawamura, C.bifisispora, C.crassispora, C.scarabaeicola, C.sinensis, C.discoideocapiata, C.formicarum, C.gemiculata, C.gracilis, C.heteropoda, C.ishikariensis, C,kyushuensis, C.yongmoones, C.nutans, C.ochraceostroma, C.ophoglossoides, C.pentatoni, C.pruinosa, C martialis, C.militaris, C.resea, C.sphecocephala, C.tricentri [50]. 7 Hình 1.5. Nấm Cordyceps militaris (nguồn: Daniel Winkler, 2013) 1.1.3.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps spp. được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ,… Tại Hàn Quốc, một số phòng thí nghiệm đã sử dụng giá thể là tằm, nhộng để nuôi trồng thể quả [27]. Tại thành phố Hayward, Bang California, Mỹ, Công ty Công nghệ sinh học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp C.militaris trên giá thể gạo. Sản phẩm của các khu nuôi của các nước được tiêu thụ tại nội địa và xuất ra nước ngoài. Tại Trung Quốc, thủ phủ của Đông trùng hạ thảo, hình thành một số khu nuôi chuyên biệt cho loại nấm Cordyceps tại một số tỉnh như: Thượng Hải, Quảng Châu, Vân Nam…và cho ra thị trường mỗi năm hàng trăm kilogram sản phẩm. Năm 2005, Dong và cộng sự tiến hành nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống lỏng tĩnh cho sự phát triển của sợi nấm C.sinensis. Các tác giả đã chỉ ra rằng, điều kiện môi trường tối ưu để thu được sinh khối sợi nấm cao nhất gồm 5% đường sucrose, 1% peptone và 0.3% cao nấm men. Sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường tối ưu, sinh khối nấm tươi thu được đạt trên 20 mg/l [21]. Đã có nhiều công trình công bố trên thế giới về lựa chọn môi trường tối ưu cho nhân giống cấp I nấm Cordyceps spp.. Trong nghiên cứu của mình, Bhushan kết luận chủng nấm C.militaris được tối ưu trên các môi trường giàu dinh dưỡng như SDAY, SMAY, CZYA có thể đảm bảo được các yêu cầu về sinh trưởng của sợi nấm. Năm 2013, Rupesh tiến hành so sánh môi trường SDAY với các môi trường khác nhằm tìm được môi trường nhân giống tối ưu cho sợi nấm C.sinensis [43]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trong tổng số 6 môi trường nghiên cứu, khuẩn lạc của chủng C.sinensis đạt tốc độ sinh trưởng lớn nhất trên môi trường SDAY (tốc độ sinh trưởng 3.74mm/ngày). Tác giả 8 cũng nghiên cứu các mức nhiệt độ và pH khác nhau đối với tốc độ sinh trưởng của nấm trên môi trường SDAY. Kết quả nghiên cứu khẳng định SDAY có tác dụng hỗ trợ tối đa cho sự sinh trưởng của sợi nấm C.sinensis [43]. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu Cordyceps tại Việt Nam 1.1.4.1. Đa dạng và phân bố Kết quả nghiên cứu của Trịnh Tam Kiệt và cộng sự cho thấy, ở Việt Nam có 3 loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps marialis Speg., Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và loài C.sobolifera (Hill) Berk & Br. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng, có 21 tỉnh của Việt Nam có sự phân bố của nấm Đông trùng Hạ thảo gồm: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh [15,16]. Năm 2009, Phạm Quang Thu đã phát hiện ở 2 tỉnh Vĩnh Phúc và Bắc Giang có sự xuất hiện của 2 loài nấm Đông trùng hạ thảo mới, đó là Cordyceps nutants và Cordyceps gunnii [6,7]. Phạm Thị Thùy (2009) tiến hành thu thập nấm Cordyceps ở vườn quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình. Kết quả đã phát hiện được loài Đông trùng Cordyceps militaris - loài lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam. Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900m đến 2.100m so với mực nước biển. Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 - 6,5cm, hình chùy, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu phình to có chiều rộng đến 0,6cm. Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn và có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và có nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300 - 510µm x 3,50 5µm, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,50 - 5µm [10]. Năm 2010, nấm Cordyceps takaomontana được phát hiện và ghi nhận lần đầu tiên tại Việt Nam bởi Phạm Quang Thu và Nguyễn Mạnh Hà. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã mô tả đặc điểm hình thái và sự phân bố của nấm 9