Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của triterpenoit khung lupan ’’ thành “ Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường Glibenclamide và Metformin hydrochloride

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ́ C GIAHỌ TRƢỜNG I HỌ C KHOA TƢ̣I NHIÊN ĐẠĐẠ I HỌ C QUÔ HÀCNỘ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN -------- -------- ĐINH THỊ CÚC NGUYỄN HOÀNG MINH HUỆ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC CHỮA BỆNH TIỂU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ VÀMETFORMIN CHUYỂN HÓA ĐƢỜNG GLIBENCLAMIDE HYDROCHLORIDE MỘT SỐ 4-FORMYLSYDNONE TETRA-O- ACETYL-β-D-GALACTOPYRANOSYL THIOSEMICARBAZON THẾ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN -------- ĐINH THỊ CÚC NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC CHỮA BỆNH TIỂU ĐƢỜNG GLIBENCLAMIDE VÀ METFORMIN HYDROCHLORIDE Chuyên ngành : Hoá Hữu cơ Mã số : 60 44 0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến Hà Nội-2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và T.S Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa Dƣợc, cử nhân Nguyễn Bích Thuận, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Thị Phƣơng đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên, các em sinh viên phòng Hóa Dƣợc, các bạn học viên lớp K22- lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè tôi những ngƣời đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Hà nội,ngày 12 tháng 8 năm 2014. Học viên Đinh Thị Cúc. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN................................................................................................................... MỤC LỤC ........................................................................................................................ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.......................................... DM1 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ................................................................. DM2 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .................................................................................... DM3 MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1.Khái quát về bệnh tiểu đƣờng................................................................................. 3 1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đƣờng. ................................................................................... 3 1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết .......................................................... 3 1.1.2.1.Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:................................................. 3 1.1.2.2.Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ............................................................... 4 1.1.2.3.Thuốc chống tăng đƣờng huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym -glucosidase)4 1.1.3.Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng........................................... 5 1.1.4.Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng......................................................... 5 1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Glibenclamide. ....................................................... 5 1.3.Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Metformin hydrochloride. ...................................... 7 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. ....................................................................... 7 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. ...................................................................... 8 CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM ................................................................................11 2.1.Hóa chất và thiết bị. ................................................................................................11 2.1.1.Hóa chất và dung môi. ........................................................................................11 2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc...................................................................................11 2.1.3. Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp đƣợc. ....................................................................................................12 2.2.Tổng hợp Glibenclamide . .....................................................................................12 2.2.1. Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride. .............................................12 2.2.2. Tổng hợp chất trung gian (4). ............................................................................13 2.2.3. Tổng hợp Glibenclamide (5). ............................................................................14 2.2.4. Phân tích hàm lƣợng sản phẩm glibenclamide (5) theo tiêu chuẩn dƣợc điển châu Âu 2002. ...............................................................................................................15 2.3.Tổng hợp Metformin hydrochloride. ....................................................................15 2.3.1. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride. ................................................16 2.3.1.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton. ........................16 2.3.1.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH..........................17 2.3.1.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH............................17 2.3.2.Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride. .....17 2.3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................18 2.3.2.2. Phƣơng pháp nghiên ứ c u ................................................................................18 2.3.2.3. Kết quả nghiên cứu. ........................................................................................18 2.3.3.Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLCMS) ................................................................................................................................19 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................22 3.1. Tổng hợp Glibenclamid. .......................................................................................22 3.2. Tổng hợp metformine hydrochloride. ..................................................................28 3.2.1. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride ...............................................29 3.2.2. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride .....30 3.2.3. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC ...................31 KẾT LUẬN ..................................................................................................................33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................34 PHỤ LỤC......................................................................................................................38 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 13 C- NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic Resonance) DMSO Dimethyl sulfoxide 1 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic Resonance) H- NMR HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối lƣợng va chạm điện tử ( Electron Impact-Mass Spectrometry) H, C Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon ppm Phần triệu ( parts per million ) s singlet dd Double doulet CHCl3 Clorofoc EtOH Etanol MW Microwave MeOH Metanol OMe Methoxy SOCl2 Sulfonylchlorua DM 1 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Bảng 2.1. Kế t quả thƣ̉ đô ̣c tiń h cấ p của metformine hydrochloride............. 19 Hình 2. 1. Biể u đồ về mố i tƣơng quan giƣ̃a liề u dùng và số chuô ̣t chế...... t 19 Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (4). ...................................... 23 Hình 3.2: : Phổ 13C-NMR của chất trung gian (4) .................................... 24 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất glibenclamide (5). ................................ 25 Hình 3.4: : Phổ 13C-NMR của chất glibencalmide (5) ............................. 26 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride. .................... 28 Hình 3.7: : Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride. ................ 29 Hình 3.9: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride ........................ 32 DM 2 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamide ................................................ 7 Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidin ............................................... 8 Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ................................. 8 Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro ............ 9 Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi........ 9 Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin .......................................... 9 Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 10 Sơ đồ 3.1. Tổng hợp glibenclamide. ............................................................... 22 Sơ đồ 3.2: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride…………………...27 DM 3 MỞ ĐẦU Tiểu đƣờng là căn bệnh nguy hiểm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm trọng sức khoẻ con ngƣời và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu đƣờng tuýp II (chiếm tới 90-95%). Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đƣờng, tử vong của bệnh này đứng hàng thứ tƣ ở các nƣớc phát triển, bệnh có thể gây nhiều tai biến nguy hiểm nhƣ: mù loà và giảm thị lực ở ngƣời trƣởng thành; đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn ngƣời bình thƣờng từ 15-40 lần; suy thận giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những biến chứng tim mạch nguy hiểm. Theo ƣớc tính, hiện thế giới có 194 triệu ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ƣớc tính đến năm 2025 số ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng sẽ là 333 triệu ngƣời. Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đƣờng ở Việt Nam là 5% dân số (khoảng 4,5 triệu ngƣời) và 7,2% tại các thành phố lớn. TP. Hồ Chí Minh có hơn 800.000 ngƣời mắc bệnh. Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, glibenclamide và metformin là một trong hai thuốc tiểu đƣờng duy nhất sử dụng theo đƣờng uống chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp II. Glibenclamide và metformin đƣợc dùng riêng rẽ hoặc dùng tổ hợp với nhau. Glucovance (thuốc tổ hợp của glibenclamide và metformin) dùng để chữa bệnh tiểu đƣờng có đƣờng huyết cao. Glibenclamide kích thích tuyến tụy tiết insulin còn metformin làm chậm hấp thụ đƣờng trong ruột non; ngăn cản gan chuyển đƣờng dự trữ vào trong máu và giúp cơ thể sử dụng insulin tự nhiên hiệu quả hơn. Vì vậy, sử dụng glucovance rất hiệu quả và ít gây phản ứng phụ.Nhƣ vậy nếu tổng hợp đƣợc glienclamide và metformin thì chúng ta có thể chủ động sản xuất đƣợc hai loại thuốc thiết yếu nhất để chữa bệnh tiểu đƣờng túyp II, làm tăng thêm sự lựa chọn, tăng tính hiệu quả của việc chữa bệnh tiểu đƣờng và chủ động sản xuất thuốc generic chữa bệnh tiểu đƣờng giá rẻ ở Việt nam. 1 Vì vậy,chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường glibenclamide và metformin hydrochloride” có ý nghĩa rất lớn về khoa học và thực tiễn. 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1.Khái quát về bệnh tiểu đƣờng. 1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đƣờng. Bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành hai loại nhƣ sau: Tiểu đƣờng tuýp 1: Tiểu đƣờng túyp 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ thống miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin của đảo tuỵ. Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thƣờng dẫn đến các biến chứng mãn tính Tiểu đƣờng túyp 2: Bệnh tiểu đƣờng túyp 2 đƣợc đặc trƣng bởi kháng insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thƣờng. Các túyp tăng đƣờng huyết đặc hiệu khác: - Đái tháo đƣờng thai kỳ. - Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào . - Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin. - Bệnh tuyến tụy ngoại tiết .... 1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau: - Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin. - Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin. - Các thuốc chống tăng đƣờng huyết sau bữa ăn 1.1.2.1.Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin: + Insulin: Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế điều hoà đƣờng huyết của cơ thể. Insulin là một trong những hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng 3 lƣợng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hƣởng cuối cùng là trên chuyển hoá glucid, lipid và protid. + Thuốc kích thích bài tiết insulin Các sulfonylurea. Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đƣờng huyết của dẫn suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thƣơng hàn. Từ phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của các sulfonylurea đã đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II (Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho ngƣời bệnh. 1.1.2.2.Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin Các biguanide: Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin. Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này. Công thức chung: R-NH-C-NH-C-NH2 NH NH Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất, vì ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng đƣờng huyết, không gây hạ đƣờng huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ, không có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ bài tiết insulin. 1.1.2.3.Thuốc chống tăng đƣờng huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym glucosidase) Acarbose: 4 Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột. Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh đƣợc tình trạng tăng đƣờng huyết sau ăn. Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 tuýp bệnh. 1.1.3.Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng. Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều. 1.1.4.Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu nhƣ sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch, Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mƣớp đắng (Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl, Scrophulariaceae)... 1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Glibenclamide. Glibenclamide là thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng thuộc vào nhóm sulphonylure. Các hợp chất thuốc thế hệ một của loại thuốc này đƣợc phát hiện từ những năm 1950 nhƣ: tolbutamide (1956), acetohexamide (1964), tolazamide (1961), chlopropamide (1959). Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai phải kể đến nhƣ: glibenclamide (1971), glipizide, glimepiride(1999). Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai có hiệu quả ở liều thấp nhờ sự tăng sự hấp thụ qua màng tế bào beta. Sulphonylure đƣợc liên kết với thụ thể của nó trong tế bào beta của tuyến tuỵ. Hoạt tính chống bệnh tiểu đƣờng của các chất này phụ thuộc vào ái lực của các thuốc sulphonylure với thụ thể của nó. Cơ chế hoạt động của lớp thuốc này chủ yếu đƣợc giải thích bới sự kìm hãm của các kênh KATP khởi xƣớng sự tiết insulin. Sự thành công của việc phát hiện ra những chất sulphonylure có ái lực cao và chọn lọc vào thụ thể của sulphonylure nhƣ là glibenclamide mất 27 năm sau khi phát hiện ra chất đầu 5 tiên có hoạt tính hạ đƣờng huyết và phải tổng hợp khoảng 12000 dẫn chất của nó để sàng lọc, nghiên cứu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc. Ngoài glibenclamide, một số thuốc thế hệ thứ hai nhƣ đã đề cập ở trên cũng đƣợc phát hiện . Tiếp đó đã có một số nhóm nghiên cứu tổng hơp các chất trên cơ sở khung sulphonylure để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học. Một số dẫn của nhóm diarylylsulphonylure có hoạt tính chống ung rất mạnh. Có rất nhiều nghiên cứu về quan hệ hoạt tính chống ung thƣ và cấu trúc của lớp chất này. Tuy nhiên, hoạt tính chống bệnh đái tháo đƣờng của lớp chất diarylylsulphonylure không thể hiện rõ. Ngoài việc nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính của các dẫn chất glibenclamide thì những nghiên cứu về cơ chế và tìm hiểu sâu sắc về bản chất của thụ thể của nó cũng đƣợc nghiên cứu nhiều. Năm 1995, 26 năm sau khi phát hiện glibenclamide có ái lực cao với thụ thể của nó ở tuyến tuỵ ngƣời ta đã nhân dòng và phát hiện ra thụ thể của nó là thành phần của protein ABC vận chuyển liên họ. Gần đây ngƣời ta đã phát hiện rằng thụ thể của nhóm sylphonylure điều tiết hoạt động của protein 38KDa (Kir 6.2) mà thụ thể đó cùng với protein đƣợc tách ra và cùng có chức năng nhƣ kênh KATP. 6 Thuốc glibenclamide hầu nhƣ chủ yếu đƣợc nhập ngoại. Việc nghiên cứu tổng hợp thuốc này ở Việt Nam chƣa thấy đề cập trong tài liệu.Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu tổng hợp glibenclamide để làm thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng với hi vọng kết quả này sẽ đƣợc đƣa vào áp dụng trong thực tiễn sản xuất thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng để đƣa vào sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng ở Việt Nam. 1.3.Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Metformin hydrochloride. 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. Cho đến nay, ở trong nƣớc có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp đƣợc đƣợc tiến hành qua 3 bƣớc [5]: * Bƣớc 1: Tổng hợp calci cyanamide: Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid Calci cyanamide đƣợc tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo 2 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC - Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC *Bƣớc 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine : 7 Từ calci cyanamide đã đƣợc tổng hợp trong bƣớc 1, đem đun nóng trong dung môi H2O nhận đƣợc 1-cyanoguanidin đƣợc mô tả trong sơ đồ sau: 1-cyanoguanidine Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ 70 oC trong khoảng thời gian 30 phút. Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng .1Cyanoguanidine đƣợc tổng hợp từ nguyên liệu rẻ nhƣ CaO và ure rất có ý nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 7500C nên khó kiểm soát và ít có ý nghĩa thực tiễn. * Bƣớc 3: Tổng hợp metformin hydrochloride: 1-Cyanoguanidine đƣợc phản ứng với dimethylamin hydrochloride ở nhiệt độ cao nhận đƣợc metformin hydrochloride. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả trong sơ đồ sau: H2 N C NH CN NH + t0 C (CH 3 )2 NH.HCl NH CH 3 H2N C NH CN CH 3 NH HCl metformin hydrochloride Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride. Mặc dù phƣơng pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền nhƣ: CaO, ure và dimethylamin nhƣng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide). 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới đƣợc FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp 2 ở Mỹ [19]. 8 Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide hydrochloride) đƣợc tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [31] bằng cách cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ 140oC (sơ đồ 1.4). Bằng con đƣờng này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp đƣợc hàng trăm dẫn chất biguanid. Các dẫn chất này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính hạ đƣờng huyết. H 2N H 2N H3C NH.HCl H3C C N C N H3C H3C 1400C NH NH N C NH C NH2.HCl metformin hydrochloride Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro Năm 2008, Anvar Shalmashi [32] đã đƣa ra phƣơng pháp mới để tổng hợp metformin hydrochloride. Phản ứng điều chế metformin đƣợc thực hiện trên bản mỏng điều chế và đƣợc đặt trong thiết bị microwave ở bƣớc sóng 540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%. H 2N H 2N H3 C NH.HCl H3 C C N C N MW 5min, 540W H3 C H3 C NH NH N C NH C NH2.HCl Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đƣờng. Kristiina và các cộng sự [22] đã tổng hợp đƣợc một số tiền chất của metformin nhƣ mô tả trong sơ đồ 6 và sơ đồ 7. Các chất này có khả năng tan tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột. NH NH NH NH2 N N N H S R N N H NH 2 Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin 9 O R-S-S-R + NH NH 2 O N-Br N-S-R O O N N N H S R R=cyclohexan R=Ph Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni. Các phức này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính hạ đƣờng huyết. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [30]. Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro(metformin)platin (IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thƣ P388 tƣơng tự nhƣ Cis-platin [15]. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, hợp chất metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp 2 rất hiệu quả mà cũng có khả năng chống ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ vú [12,20,21,26,27,33,34]. Từ các tƣ liệu đã có có thể thấy rằng con đƣờng tổng hợp metformin từ dicyano diamide là khả thi. Tổng hợp theo con đƣờng này chỉ có một bƣớc phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực hiện đƣợc ở quy mô pilot. 10 CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM 2.1.Hóa chất và thiết bị. 2.1.1.Hóa chất và dung môi. Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi đƣợc mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích. Bột silica gel cho sắc ký cột 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel đế nhôm Art. 5554 DC – Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck). 2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp đƣợc, chúng tôi tiến hành các phƣơng pháp sau: - Xác định nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo trên máy đo trên máy Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ – Viện hóa học – Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam. - Phổ hồng ngoại (IR) Phổ IR của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên máy Impact 410 – Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn. - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13 C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu đƣợc đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân – Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. - Phổ khối lƣợng (MS) 11 Phổ khối của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên LC – MSD – Trap – SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2.1.3. Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp đƣợc. Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng đƣợc xác định nhờ các phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13 C- NMR,phổ hồng ngoại ( IR). Các sản phẩm phản ứng đƣợc kiểm tra độ sạch bằng các phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS). Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thƣờng chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng đã xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chƣa kết thúc là dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tƣơng ứng. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm đƣợc dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm đƣợc hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất. 2.2.Tổng hợp Glibenclamide . 2.2.1. Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride. Hoà tan 10g (53,76mmol) 5-chloro-2-methoxybenzoic acid trong 200 ml CHCl3. Hỗn hợp này đƣợc làm lạnh xuống 00C, sau đó nhỏ giọt từ từ (12,69g, 107,52 mmol) SOCl2. Sau khi kết thúc nhỏ giọt, phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ 250C, trong khoảng 8h. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc làm nguội, cất 12