Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học một số loài cây thuộc chi polygonum, họ rau răm (polygonaceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Trần Thanh Hà NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỘC CHI POLYGONUM, HỌ RAU RĂM (POLYGONACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2016 Công trình được hoàn thành tại: khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu. Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Đậu Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vào hồi giờ ngày tháng năm 20... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước và con người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Hệ thực vật ở Việt Nam ước tính có khoảng 13.000 loài với khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Tính đến nay đã có hơn 3800 loài thực vật bậc cao và bậc thấp được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền nhằm kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm nhiễm, chống ung thư, điều hòa miễn dịch, chữa các bệnh liên quan đến tim mạch, diệt côn trùng. Chi Polygonum (họ rau Răm, Polygonaceae) có khoảng 230 loài phân bố chủ yếu ở phía bắc bán cầu trong đó có Việt Nam. Nhiều loài trong chi này được sử dụng trong y học dân gian với công dụng kháng viêm, lưu thông máu, chữa lỵ, lợi tiểu. Theo các nghiên cứu đã công bố thành phần hóa học của các loài thuộc chi Polygonum bao gồm flavonoid, anthraquinon, coumarin, lignan, napthaquinon, polyphenol, tecpenoid với nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý như chống khối u, chống oxy hóa, chống viêm, chống HIV, chống suy giảm miễn dịch và chống côn trùng. Cả ba loài cây thuộc chi Polygonum là cây mễ tử liễu (Polygonum plebeium R. Br.), cây thồm lồm gai (Polygonum perfoliatum L.), cây nghể trắng (Polygonum barbatum L.) tuy đã được nghiên cứu trên thế giới nhưng ở Việt Nam hầu như chưa có công bố nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài cây này tại Việt Nam, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần sáng tỏ công dụng chữa bệnh của các dược liệu này, chúng tôi lựa chọn đề tài:: “Nghiên cứu thành phần hóa học một số loài cây thuộc chi Polygonum, họ Rau răm (Polygonaceae)”. 2. Đối tượng nghiên cứu của luận án Đối tượng nghiên cứu của luận án cụ thể là cây Polygonum perfoliatum L. (thồm lồm gai), Polygonum barbatum L. (nghể trắng), Polygonum plebeium R.Br. (mễ tử liễu, rau đắng),. 3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thồm lồm gai (P. perfoliatum L.), nghể trắng (P. barbatum L.) và mễ tử liễu (P. plebeium R.Br.) ở Việt nam. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với các phương pháp quang phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 24 hợp chất từ thân rễ cây thồm lồm gai, 17 hợp chất từ thân rễ cây nghể trắng, 20 hợp chất từ toàn cây mễ tử liễu. Trong đó, có hai hợp chất thuộc lớp chất sphingoglycolipid lần đầu tiên được công bố trong tài liệu khoa học, 9 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Polygonum, 12 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P. perfoliatum L., 15 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P. barbatum L., 12 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P. plebeium R.Br. 3.2. Đã đánh giá hoạt tính độc tế bào của 11 cặn chiết (etanol, metanol, nước) từ các bộ phận khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu trên 5 dòng tế bào ung thư: khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela). Kết quả cho thấy cả 11 mẫu cặn chiết đều cho tác dụng độc tế bào với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL. 3.3. Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH, ABTS của ba mẫu: cặn chiết etanol 90% thân rễ P. perfoliatum L., cặn chiết etanol 90% thân rễ P. barbatum L., cặn chiết etanol 90% toàn cây P. plebeium R.Br. Trong đó, cặn chiết etanol 90% thân rễ P. barbatum L. cho tác dụng loại gốc DPPH cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml. 1 3.4. Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH của 14 hợp chất tinh khiết được chọn lọc từ các hợp chất phân lập. Kết quả cho thấy 5 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ, chống tác nhân oxi hóa DPPH tốt là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1), acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]carbamic (TLE5), ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3), isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6), quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2) với giá trị EC50 <128 µg/ml. Trong số 5 chất có hoạt tính, hợp chất TLE1.1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ EC50 =3,2 (µg/ml), mạnh hơn rất nhiều so với chất đối chứng là quercetin EC50 =10,82 (µg/ml). 4. Bố cục của luận án Luận án gồm: 196 trang chưa kể 5 phụ lục, trong đó có 8 bảng số liệu, 10 sơ đồ, 13 hình vẽ, 166 tài liệu tham khảo. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang); Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (7 trang); Chương 3: Thực nghiệm (54 trang); Chương 4: Kết quả và Thảo luận (80 trang); Kết luận (4 trang); Các công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (15 trang); Phụ lục (90 trang). II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. Chương 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: - Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của chi Polygonum; - Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Polygonum; - Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Polygonum; - Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của ba loài thồm lồm gai (P. perfoliatum L.), nghể trắng (P. barbatum L.) và mễ tử liễu (P. plebeium R.Br.) Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT Sử dụng các phương pháp chiết lỏng-rắn và lỏng- lỏng để chiết xuất các chất ra khỏi nguyên liệu thực vật và phân đoạn các lớp chất có độ phân cực khác nhau. 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH Sử dụng chủ yếu phương pháp sắc ký như lớp mỏng để phân tích các phần chiết, kiểm tra độ tinh khiết của các chất; Sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau để phân lập các chất. Bên cạnh đó luận án cũng sử dụng phương pháp kết tinh lại tách và làm sạch các chất. 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý: điểm chảy, năng suất quay cực và các phương pháp phổ: phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1DNMR): 1H-NMR, 13CNMR kết hợp kỹ thuật DEPT, và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY. 2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.4.1. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro 2 Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính của các cặn chiết trên 5 dòng tế bào ung thư: khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela). 2.4.2. Thử tác dụng chống oxy hóa Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của ba mẫu cặn chiết cồn 90% của các đối tượng theo phương pháp quét gốc DPPH, định lượng ABTS+.. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của 14 hợp chất tinh khiết phân lập được theo phương pháp quét gốc DPPH 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis, Excel và phần mềm thống kê GraphPad Prism 6.0 phù hợp tùy theo mỗi phép thử để có kết quả chính xác, đáng tin cậy. Chương 3: THỰC NGHIỆM 3.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 3.1.1. Thiết bị Phần này trình bày cụ thể về các thiết bị được sử dụng trong luận án với chỉ tiêu kỹ thuật và địa chỉ thực hiện . 3.1.2. Hóa chất Phần này trình bày cụ thể các hóa chất được sử dụng trong luận án về xuất xứ, nguồn gốc, mục đích. 3.2. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT Phần này trình bày cụ thể về nơi thu mẫu, người thu, giám định tên khoa học, nơi lưu mẫu tiêu bản của mẫu nguyên liệu thực vật được sử dụng trong luận án 3.3. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT Phần này trình bày cụ thể cách tiến hành định tính nhóm chất từ các đối tượng nghiên cứu bằng phản ứng hóa học 3.4. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu Nguyên liệu dùng để điều chế các phần chiết là thân rễ của cây thồm lồm gai (P. perfoliatum L.), thân rễ của cây nghể trắng (P. barbatum L.), toàn bộ cây mễ tử liễu (P. plebeium R.Br) được sấy khô ở 50oC, sau đó xay thành bột. 3.4.2. Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật 2,5 kg nguyên liệu được ngâm với cồn 90% ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 4 ngày). Các dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng. Cặn chiết này được phân bố lại lần lượt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat, n-butanol; cất loại hết dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cặn chiết tương ứng n-hexan, etyl axetat, n-butanol. Cất kiệt dịch nước còn lại dưới áp suất giảm ở 80°C cho phần chiết nước. 3.5. PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG Phần này trình bày phân tích các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n-butanol của ba đối tượng nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng nhằm định hướng cho quá trình phân lập các chất. 3 3.6. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHẦN CHIẾT Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n-butanol của ba đối tượng nghiên cứu. 3.6.1. Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai 3.6.1.1. Phân tách phần chiết n-hexan (TLH) Phần chiết n-hexan (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 100/1, 20/1, 10/1, 9/1, 4/1, 3/1 và 2/1 (v/v). 3.6.1.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (TLE) Phần chiết etyl axetat (TLE) (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 100/1, 20/1, 15/1, 10/1, 4/1 và 2/1 (v/v). 3.6.1.3. Phân tách phần chiết n-butanol (TLB) Phần chiết chiết n-butanol (50 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với điclometan và hệ dung môi gradient gradient điclometan/metanol/nước với tỷ lệ 9/1/0,1 và 3/1/0,1 (v/v). 3.6.2. Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng 3.6.2.1. Phân tách phần chiết n-hexan (NTH) Phần chiết n-hexan (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 20/1, 10/1, 8/1, 5/1, 3/1 và 1/1 (v/v) 3.6.2.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (NTE) Phần chiết etyl axetat (NTE) (50 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 20/1, 9/1, 8/1, 5/1, (v/v) 3.6.2.3. Phân tách phần chiết n-butanol (NTB) Phần chiết n-butanol (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với hệ dung môi gradient điclometan/metanol/H2O với các tỷ lệ (9/1/0,1; 6/1/0,1; 3/1/0,1; v/v; 1/1/0,1 3.6.3. Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu 3.6.3.1. Phân tách phần chiết n-hexan (MTH) Phần chiết n-hexan (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 99/1, 20/1, 9/1, 7/1, 5/1, 3/1 và 2/1 (v/v) 3.6.3.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (MTE) Phần chiết etyl axetat (MTE) (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 99/1, 9/1, 8/1, 5/1, 1/1 (v/v) 3.6.3.3. Phân tách phần chiết n-butanol (MTB) 4 Phần chiết n- butanol (MTB) (40 g) được phân tách bằng sắc ký cột (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol/nước 99/1/0,11, 9/1/0,1, 8/1/0,1, 5/1/0,1, 1/1/0,1 (v/v) 3.7. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT Phần này trình bày chi tiết các đặc trưng vật lý, các dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ ba đối tượng nghiên cứu. Dưới đây chỉ đưa ra hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất tiêu biểu: 3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9)- Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài thồm lồm gai Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLH9. Tinh thể hình kim màu trắng, đnc. 123-125°C Rf = 0,51 (TLC, silica gel, n-hexan/etyl axetat 3/1), hiện màu tím đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,28 (1H, m, H-3), 1,73 (3H, s, H-18), 0,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J=4,0Hz, H-19b), 0,97 (6H, s, H-21& H-28), 4,10 (1H, t, J=7,5Hz, H-24), 4,83 (1H, s, H-26a), 4,93 (1H, d, J=5,5 Hz, H-19b), 0,87 (3H, s, H-27), 0,80 (3H, s, H-29), 0,89 (3H, s, H-30), 2,17 (3H, s, 3COCH3). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 31,9 (C-1), 30,4 (C-2), 78,9 (C-3), 40,5 (C-4), 47,2 (C-5), 21,1 (C-6), 26,0 (C-7), 47,9 (C-8), 20,0 (C-9), 26,1 (C-10), 26,5 (C-11), 32,9 (C-12), 45,3 (C-13), 48,9 (C14), 35,6 (C-15), 28,1 (C-16), 52,2 (C-17), 18,0 (C-18), 29,9 (C-19), 35,9 (C-20), 18,3 (C-21), 31,9 (C-22), 31,7 (C-23), 76,4 (C-24), 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26), 17,6 (C-27), 25,5 (C-28), 14,0 (C-29), 19,3(C-30), 170,0 (C=O), 21,4 (C-COCH3 ). 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene1, 3, 4-triol (TLH23)- Hợp chất chưa có công bố trong tài liệu khoa học. Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLH23. Tinh thể hình kim màu trắng, đnc. 216-218°C. Rf = 0,35 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 10/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°. LC/ESI-MS/MS: m/z 962 [M+Na]+, 800 [M+Na-Glc]+. M=939 đvC, C55 H105NO10 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 4,08 (1H, dd, J= 4,0; 10,5 Hz, H-1a), 3,82 (1H, dt, J= 2,0; 4,0; 10,5 Hz, H-1b), 4,27 (1H, m, H-2), 3,62 (1H, t, J=6,0 Hz, H-3), 3,53 (1H, m, H-4), 1,66 (1H, m, H-5a), 1,43 (1H, m, H-5b), 1,60 (2H, m, H-6), 1,99 (2H, m, H-7), 5,44 (1H, m, H-8), 5,44 (1H, m, H-9), 1,99 (2H, m, H-10), 1,31 (18x2H, m, H-11→H-28), 0,92 (3H, t, J= 6,5 Hz, H-29). 4,04 (1H, m, H-2'),1,78 (1H, H-3'a), 1,62 (1H, H3'b), 1,44 (2H, H-4'), 1,31 (4x2H, H-5'→8'), 2,08 (2H, m, H-9'), 5,38 (1H, m, H-10'), 5,38 (1H, m, H-11'), 2,08 (2H, m, H-12'), 1,31 (7x2H, m, H-13'→19'), 0,92 (3H, t, J= 6,5 Hz, H-20'); Glc: 4,30 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1''), 3,20 (1H, quartet, J= 8,0 Hz, H-2''), 3,38 (1H, m, H-3''), 3,29 (1H, m, H-4''), 3,30 (1H, m, H-5''), 3,89 (1H, d, J= 11,5, H-6''a), 3,68 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6''b). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 69,9 (C-1), 51,7 (C-2), 75,6 (C-3), 72,9 (C-4), 32,9 (C-5), 27,2 (C-6), 33,8 (C-7), 131,5 (C-8), 131,4 (C-9), 33,7 (C-10), 30,3-30,9 (C-11→C-26), 33,1 (C-27), 23,7 (C-28), 14,5 (C-29), 177,1 (C-1'), 72,9 (C-2'), 35,7 (C-3'), 26,1 (C-4'), 30,3-30,9 (C-5'→C-8'), 28,3 (C-9'), 130,8 (C-10'),130,9 (C-11'), 28,4 (C-12'), 30,3-30,9 (C13'→C-17'), 33,1 (C-18'), 23,7 (C-19'), 14,5 (C-20'); Glc: 104,7 (C-1''), 75,0 (C-2''), 77,9 (C-3''), 71,6 (C-4''), 78,0 (C-5''), 62,7 (C-6''). 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1)- Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLE1. Chất rắn màu trắng, đnc. 296-298°C. Rf = 0,51 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 20/1), hiện màu hồng với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 6,39 (2H, s, H-3a), 7,535 (1H, s, H-5), 7,533 (1H, s, H-5'), 4,05 5 (3H, s, 3'-OCH3). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 112,7 (C-1), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 104,3 (C-3a), 150,0 (C-4), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6), 158,3 (C-6a), 110,9 (C-1'), 141,6 (C-2'), 140,2 (C-3'), 150,0 (C-4'), 112,1 (C-5'), 116,0 (C-6'), 157,6 (C-6'a), 60,9 (3'-OCH3). N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)-Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLE5. Tinh thể hình trụ, màu hồng nhạt, đnc. 244-246ºC. Rf = 0,53 (TLC, silica gel, điclometan/metanol/nước 4/1/0,1, v/v/v), hiện màu hồng đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. EI-MS (%) m/z: 158 (m/z, 5), 141 (10), 130 (58), 115 (32), 87 (98), 44 (100); CTPT: C4H5N3 O4. 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 10,52 (1H, s, O-H), 8,04 (1H, s, N1-H), 6,87 (1H, d, J=8,0 Hz, N6- H), 5,24 (1H, d, J= 8,0 Hz, C4-H), 5,77 (1H, s, N3-H). 13C- NMR (125 MHz, DMSO-d6 ), δ (ppm): 173,6 (C-7), 157,3 (C-5), 156,7 (C-2), 62,3 (C-4) Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4)- Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLB4. Chất rắn màu vàng, đnc. 188-190oC. Rf = 0,33 (TLC, silica gel, toluent/acid axetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5% ESI-MS: pos 595 [M+H]+, neg 593 [M-H]ˉ. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,22 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8), 8,10 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2' & 6'), 6,90 (2H, d, J=9,0 Hz, H-3'& 5'), glc: 5,05 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1''), 3,33 (1H, s, H-2''), 3,63 (1H, m, H-3''), 3,81 (1H, s, H-4''), 3,55 (1H, m, H5''), 3,41 (1H, m, Ha-6''), 3,74 (1H, m, Hb-6''); Rha: 4,55(1H, s, H-1'''), 3,63 (1H, m, H-2'''), 3,55 (1H, m, H3'''), 3,82 (1H, m, H-4'''), 3,54 (1H, m, H-5'''), 1,20 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6'''). 13C-NMR (125 MHz, CD3ODd4 ), δ (ppm): 158,5 (C-2), 135,7 (C-3), 179,6 (C-4), 162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,0 (C-7), 94,9 (C-8), 161,6 (C-9), 105,5 (C-10), 122,6 (C-1'), 132,5 (C-2'), 116,1 (C-3'), 159,4 (C-4'), 116,1 (C-5'), 132,5 (C-6'), 105,6 (C-1''), 73,9 (C-2''), 75,4 (C-3''), 70,1 (C-4''), 75,1 (C-5''), 67,4 (C-6''), 101,9 (C-1'''), 72,1 (C-2'''), 72,3 (C3'''), 72,9 (C-4'''), 69,7 (C-5'''), 17,9 (C-6''') 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol (NTH24.2)- chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học Được phân lập từ nhóm phân đoạn NTH24. Chất vô định hình màu trắng. Rf = 0,64 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 9/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. LC/ESI-MS/MS: (m/z): 972 [M+NH4]+, 902 [M+3H-3HOH]+, 792[M+H-Gal]+, 472 [M+H-Gal-C23H45 ]+•. M=953, CTPT: C56H107NO10. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3& CD3OD), δ (ppm): 4,09 (1H, dd, J = 6,0; 10,5 Hz, H-1a), 3,80 (1H, dt, J = 2,0; 5,5; 10,5 Hz, H-1b), 4,23 (1H, m, H-2), 3,61 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-3), 3,55 (1H, m, H-4), 1,66 (1H, m, H-5a), 1,43 (1H, m, H-5b), 1,59 (2H, m, H-6), 2,03 (2H, m, H-7), 5,41 (1H, m, H-8), 5,41(1H, m, H-9), 2,04 (2H, m, H-10), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-18), 4,04 (1H, m, H-2'), 1,76 (1H, H3'a), 1,60 (1H, 3'b), 1,39 (2H, m, H-4'), 5,36 (1H, m, H-10'), 5,36 (1H, m, H-11'), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H22'); galc: 4,32 (1H, d, J =8,0 Hz, H-1''), 3,24 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-2''), 3,62 (1H, t, J =5,0 Hz, H-3''), 3,38 (1H, m, H-4''), 3,35 (1H, m, H-5''), 3,85 (1H, d, J = 12 Hz, H-6''a), 3,71 (1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, H-6''b). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3& CD3OD), δ (ppm): 68,6 (C-1), 50,1 (C-2), 76,7 (C-3), 72,0 (C-4), 32,2 (C-5), 26,9 (C-6), 32,3 (C-7), 130,4 (C-8), 129,9 (C-9), 32,2 (C-10), 29,4-28,9 (C-11→ C-15), 31,6 (C-16), 22,3 (C-17), 14,3 (C-18), 222,4 (C-1'), 72,9 (C-2'), 34,2 (C-3'), 24,9 (C-4'), 29,4-29,0 (C-5'→C-8'), 28,9 (C-9'), 6 129,6 (C-10'), 129,1 (C-11'), 28,9 (C-12'), 29,4-29,0 (C-13'→C-19'), 32,3 (C-20'), 25,6 (C-21'), 14,3 (C-22'), galc: 102,8 (C-1''), 73,3 (C-2''), 74,1 (C-3''), 69,8 (C-4''), 76,1 (C-5''), 61,3 (C-6''). Isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Được phân lập từ nhóm phân đoạn MTB6. Chất rắn màu vàng, đnc. 185-188oC. Rf = 0,25 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%. ESI-MS m/z 793,1 [M+Na]+ , 769,1 [M-H]- , CTPT: C34H42O20. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4 ), δ (ppm): 6,21 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,96 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,93 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5'), 7,60 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 3,99 (3H, s, O-CH3), glc: 5,75 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,64 (1H, m, H-2''), 3,58 (1H, m, H-3''), 3,62(1H, s, H-4''), 3,41 (1H, m, H-5''), 3,85(1H, m, H-6a''), 3,43(1H, m, H-6b''); rham: 4,56 (1H, s, H-1''' ), 3,79 (1H, dd, J= 9,5; 3,0 Hz H-2'''), 3,49 (1H, s H-3'''), 3,24 (1H, m H4'''), 4,05 (1H, q, H-5'''), 1,09 (3H, d, J=6,5Hz, H-6'''); rham: 5,21(1H, s, H-1''''), 4,02 (1H, s, H-2''''), 3,49 (1H, s, H-3''''), 3,35 (1H, m, H-4''''), 3,42 (1H, m, H-5''''), 0,94 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6''''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 158,4 (C-2), 134,3 (C-3), 179,2 (C-4), 163,1 (C-5), 99,8 (C-6), 165,7 (C-7), 94,7 (C-8), 158,6 (C-9), 105,9 (C-10), 123,7 (C-1'), 114,5 (C-2'), 148,4 (C-3'), 150,6 (C-4'), 116,1 (C-1'), 123,4 (C-6'), 57,0 (O-CH3); glc: 100,5 (C-1''), 80,1 (C-2''), 78,8 (C-3''), 72,0 (C-4''), 77,2 (C-5''), 68,2 (C-6''); rham: 102,3 (C-1'''), 72,3 (C-2'''), 72,1 (C-3'''), 73,8 (C-4'''), 69,9 (C-5'''), 17,8 (C-6'''); rham: 102,7 (C-1''''), 72,4 (C-2''''), 72,1 (C-3''''), 73,9 (C-4''''), 69,7 (C-5''''), 17,5 (C-6'''') Quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2) chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Được phân lập từ phân đoạn MTB10. Chất rắn màu vàng, đnc. 191-193°C. Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%. ESI-MS: pos, m/z: 795,2 [M+Na]+, M=772 đvC, CTPT: C33H40O21.1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,23 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,41 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,68 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,95 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5'), 7,56 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'); β-glc: 5,30 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,33 (1H, m, H-2''), 3,77 (1H, s, H-3''), 3,44(1H, m, H-4''), 3,42 (1H, m, H-5''), 3,83 (1H, dd, J= 1,5; 2,0 Hz, Hb-6′′′), 3,74 (1H, dd, J= 11,5, 5,0 Hz, Ha-6′′′); β-glc: 4,78 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1'''), 3,42 (1H, m, H-2'''), 3,35 (1H, m, H-3'''), 3,33 (1H, m, H-4'''), 3,60 (1H, m, H-5'''), 3,37 (1H, s, Ha-6′′), 3,80 (1H, m , Hb-6′′); α-rham: 4,51(1H, d, J=1,0 Hz, H-1''''), 3,50 (1H, dd, J= 9,5; 3,5 Hz, H-2''''), 3,60 (1H, m, H-3''''), 3,27 (1H, t, J=9,5 Hz, H-4''''), 3,45 (1H, m, H-5''''), 1,11 (3H, d, J=6,5 Hz , H-6''''). 13C-NMR (125 MHz, CD3 OD-d4), δ (ppm): 158,5 (C-2), 134,9 (C-3), 179,6 (C-4), 163,1 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,9 (C-8), 159,2(C-9), 105,7 (C-10), 123,23 (C-1'), 116,2 (C-2'), 145,9 (C-3'), 149,8 (C-4'), 117,7 (C-1'), 123,17 (C-6'); β-glc: 101,2 (C-1''), 76,99 (C-2''), 82,6 (C-3''), 71,1 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,4 (C-6''), β-glc: 104,8 (C-1'''), 75,5 (C-2'''), 78,2 (C-3'''), 71,3 (C-4'''), 77,9 (C-5'''), 68,1 (C-6'''); α- rham: 102,2 (C-1''''), 72,3 (C-2''''), 72,1 (C-3''''), 73,9 (C-4''''), 69,7 (C-5''''), 17,8 (C-6'''') Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương này trình bày kết quả định tính các lớp chất có mặt trong ba đối tượng nghiên cứu, biện giải cấu trúc của các hợp chất phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các cặn chiết và một số chất tinh khiết. 4.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 7 Kết quả định tính sơ bộ thành cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cả ba đối tượng là các flavonoid, phytosterol, acid hữu cơ, chất béo. 4.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAO CHIẾT 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các mẫu cặn chiết Bảng 4.2. Hiệu suất của các cặn chiết khác nhau STT Cây Bộ phận Dung môi Hiệu suất (%) 1 P. barbatum thân rễ MeOH 5,1 2 P. barbatum thân rễ EtOH 90% 6,9 3 P. barbatum thân rễ H2O 7,2 4 P. barbatum lá MeOH 3,2 5 P. perfoliatum thân rễ MeOH 9,3 6 P .perfoliatum thân rễ EtOH 90% 19,3 7 P. perfoliatum thân rễ H2O 20,7 8 P. perfoliatum lá MeOH 13,2 9 P. plebeium toàn cây MeOH 8,7 10 P. plebeium toàn cây EtOH 90% 11,6 11 P. plebeium toàn cây H2O 6,6 Theo tiêu chuẩn của U.S. National Cancer Institute một dịch chiết được xem có khả năng độc tế bào in vitro khi giá trị IC50 nhỏ hơn 20 μg/mL, trong khi với chất tinh khiết, giá trị này được tính là nhỏ hơn 10 μg/mL. Qua bảng 4.3. kết quả thử hoạt tính độc tế bào có thể nhận thấy toàn bộ 11 cặn chiết từ ba loài cây nghiên cứu đều cho tác dụng độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm HT-1080, MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR và Hela với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL. Bảng 4.3. Kết quả thử độc tế bào của các mẫu cao chiết trên 5 dòng tế bào ung thư IC50 (µg/mL) STT Mẫu HT-1080 MDA-MB 231 MCF-7/adr MCF-7/TAMR Hela 1 8.5 ± 0.3 5.5 ± 0.3 7.8 ± 0.2 8.1 ± 0.4 7.1 ± 0.5 2 5.1 ± 0.7 6.6 ± 0.5 5.9 ± 0.3 5.4 ± 0.3 7.2 ± 0.4 3 7.4 ± 0.5 8.2 ± 0.4 9.2 ± 0.4 7.1 ± 0.6 9.4 ± 0.5 4 11.5 ± 0.4 12.6 ± 0.5 12.5 ± 0.5 14.2 ± 0.6 13.2 ± 0.4 5 12.8 ± 0.6 13.7 ± 0.3 18.2 ± 0.7 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.4 6 12.9 ± 0.3 13.4 ± 0.4 14.5 ± 0.7 15.4 ± 0.5 15.4 ± 0.6 7 17.5 ± 0.4 16.4 ± 0.5 17.2 ± 0.3 19.9 ± 0.4 13.8 ± 0.5 8 11.1 ± 0.5 10.6 ± 0.4 11.9 ± 0.7 12.4 ± 0.9 10.3 ± 0.4 9 12.6 ± 0.9 10.2 ± 0.4 11.7 ± 0.3 11.5 ± 0.4 10.4 ± 0.6 10 14.3 ± 0.2 13.5 ± 0.3 12.6 ± 0.4 11.8 ± 0.6 10.9 ± 0.5 11 11.9 ± 0.8 9.1 ± 0.5 12.4 ± 0.4 11.9 ± 0.6 12.4 ± 0.5 Tamoxifen** - 12.4 ± 0.8 10.9 ± 1.1 11.1 ± 0.8 - * Kết quả được lấy trung bình của 3 lần thí nghiệm khác nhau; ** chứng dương; - Không thử Trong số các mẫu này, bốn cặn chiết từ cây P. barbatum (1-4) thể hiện khả năng gây độc tế bào trên năm dòng tế bào kể trên mạnh hơn cả với các giá trị IC50 chỉ từ 5,1 – 9,4 µg/mL, bốn mẫu P. perfoliatum (5- 8 8) và ba mẫu P. plebeium (9-11) thể hiện tác dụng này yếu hơn với IC50 từ 9,1 -19,9 µg/mL. Các cao chiết EtOH 90% bộ phận thân rễ của P. perfoliatum, P. barbatum và P. plebeium, đều thể hiện tác dụng độc tế bào mạnh hơn các cao chiết metanol, nước của cùng một cây cũng như phụ thuộc vào từng dòng tế bào. Đây cũng là một cơ sở để định hướng cho quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ ba loài cây này. Kết quả nghiên cứu tác dụng độc tế bào này của luận án lần đầu tiên được công bố. 4.2.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết Bảng 4.4. Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của các cặn chiết STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 107,50 ± 3,95 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 35,53 ± 2,41 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 55,60 ± 3,92 4 Acid ascorbic 34,08 ± 0,36 Trong ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu, cặn chiết từ cây nghể trắng cho tác dụng cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml. Bảng 4. 5. Kết quả định lượng ABTS•+ của các cặn chiết STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 48,57 ± 8,874 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 29,83 ± 6,60 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 26,50 ± 5,92 4 Trolox 9,47 ± 0,25 Nhận xét: Từ bảng 4.2. cho thấy cả ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu đều có khả năng dọn gốc tự do ABTS•+. Trong đó cây mễ tử liễu cho tác dụng cao nhất với IC50 = 26,50 ± 5,92 µg/ml, tiếp đó là cây nghể trắng với IC50 = 29,83 ± 6,60 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 48,57 ± 8,874 µg/ml với chất đối chứng Trolox IC50 =9,47 ± 0,25 µg/ml. Qua kết quả định tính nhóm chất và kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào, chống oxy hóa của các phần chiết khác nhau từ các bộ phận khác nhau của cả ba loài nhận thấy cặn chiết etanol 90% bộ phận thân rễ của hai loài thồm lồm gai, nghể trắng và toàn cây mễ tử liễu cho thấy tác dụng độc tế bào và tác dụng quét gốc DPPH rõ rệt nhất. Hơn nữa dung môi chiết xuất etanol 90% là dung môi có thể chiết xuất được hầu hết các các nhóm chất có độ phân cực khác nhau có mặt trong cả ba loài. Vì vậy, luận án lựa chọn đối tượng nghiên cứu cụ thể cho quá trình phân lập các chất là thân rễ thồm lồm gai, thân rễ nghể trắng, toàn cây mễ tử liễu với dung môi chiết xuất là etanol 90%. 4.3. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT Quy trình chiết được áp dụng chung cho cả ba mẫu thực vật nêu trên và được tóm tắt ở Sơ đồ 4.1 9 Mẫu nguyên liệu (TL 2,5 kg; NT 2,5 kg, MT 2,5 kg) Phần chiết tổng (TL; 290,00 g, 11,60 %) (NT; 207,26 g, 8,29 %) (MT; 289,85g, 11,59 %) 1. Ngâm chiết với EtOH 90% (4 ngày, 3 lần) 2. Lọc, cất loại EtOH 1. Hòa vào nước cất 2. Chiết bằng n-hexan 3. Cất loại kiệt n-hexan, 60 °C Dịch nước Phần chiết n-hexan (TLH; 17,00 g, 0,68 %) (NTH; 40,29 g, 1,61 %) (MTH; 71,86 g, 2,87 %) 1. Chiết với EtOAc 2. Cất loại kiệt EtOAc, 60 °C Dịch nước Phần chiết EtOAc (TLE; 100,00 g, 4,00 %) (NTE; 50,97 g, 2,04 %) (MTE; 71,25 g, 2,85 %) 1. Chiết với n-butanol 2. Cất loại kiệt n-butanol, 70 °C Dịch nước Cất loại kiệt nước, 100 °C Phần chiết n-butanol (TLB; 47,30 g, 1,89 %) (NTB; 35,76 g, 1,43 %) (MTB; 41,43 g, 1,66 %) Phần chiết nước (TLW; 105,00 g, 4,20 %) (NTW; 76,80 g, 3,07 %) (MTW; 96,00 g, 3,84 %) Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ ba đối tượng nghiên cứu 4.4. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHẦN CHIẾT Phần này trình bày kết quả phân tích các phần chiết bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi dung để phân lập các chất bằng sắc ký cột. 4.5. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ các phân đoạn khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu. 4.5.1. Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai Từ phần chiết n-hexan cây thồm lồm gai thu được các hợp chất TLH4 (30 mg), TLH5 (15 mg), TLH7 (12 mg), TLH9 (15 mg), TLH23.3 (21 mg), TLH24 (27 mg), TLH29 (13 mg). Từ phần chiết etyl axetat (TLE) thu được chất TLE 1.1 (8 mg), TLE1.1.2 (12 mg), TLE1.1.3 (14 mg) TLE 1.1.4 (11 mg), TLE1.2 (20 mg), TLE1.3 (8 mg), TLE1.4 (11 mg), TLE1.5 (11 mg), TLE1.7 (21 mg), TLE1.8 (13 mg), TLE1.9 (13 mg), TLE 2.1 (13mg), TLE 2.1.3 (18 mg), TLE 2.1.4 (30 mg), TLE2.2 (12 mg), TLE2.6 (13 mg), TLE3 (16 mg), TLE5 (17 mg). Từ phần chiết n- butanol thu được chất TLB1(11 mg), TLB4 (23 mg), 10 TLB7 (24 mg), TLB11 (16 mg), TLB13 (13 mg). 4.5.2. Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng Từ phần chiết n-hexan thu được chất NTH1 (50 mg), NTH2 (140 mg), NTH6 (14 mg), NTH24.1 (13 mg), NTH24.2 (21 mg), NTH26.2 (15 mg), NTH26.3 (35 mg), NTH30 (30 mg). Từ phần chiết etyl axetat (NTE) thu được chất NTE1.1 (9 mg), NTE1.6 (14 mg), NTE2.4.2 (8 mg), NTE 2.6.1 (13 mg), NTE2.6.2 (40 mg), NTE2.7.1 (15 mg), NTE3 (15 mg), NTE 5.7 (11 mg), NTE8 (22 mg), NTE12 (14 mg). Từ phần chiết n-butanol thu được chất NTB3 (17 mg), NTB4 (20 mg), NTB8 (13 mg), NTB11 (38 mg). 4.5.3. Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu Từ phần chiết n-hexan thu được chất MTH8.1 (31 mg), MTH10 (35 mg), MTH11 (15 mg), MTH13 (12 mg), MTH16 (17 mg), MTH 18 (205m g). Từ phần chiết etyl axetat (MTE) thu được chất MTE2.4 (17 mg), MTE2.5 (10 mg), MTE2.9 (17 mg), MTE2.9.9 (14 mg), MTE2.10.1 (13 mg), MTE2.10.2 (20 mg), MTE3.4 (11 mg), MTE3.8 (16 mg), MTE4 (30 mg), MTE5 (15 mg), MTE8.1 (7 mg). Từ phần chiết etyl axetat n- butanol thu được chất MTB4 (35 mg), MTB6 (22 mg), MTB 10.2 (56 mg). 4.6. CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP Cấu trúc của các chất được xác định dựa vào việc phân tích các dữ kiện phổ thực nghiệm, kết hợp khảo sát các đặc trưng vật lý, kết hợp tham khảo các tài liệu. Dưới đây chỉ ra cấu trúc các chất đã được xác định, và trình bày phương pháp xác định cấu trúc của một số hợp chất điển hình từ ba loài cây. 4.6.1. Các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây thồm lồm gai Từ các phần chiết thân rễ cây thồm lồm gai đã phân lập và xác định cấu trúc được 24 hợp chất bao gồm: 26 22 18 OH 8 24 20 17 27 29 10 5 4 3 β-Sitosterol (TLH4) 1 O HO HO OH 2 O O 13 11 8' 2' 8 4' OH 12 24 27 17 19 8' 10' 11' 7' 3 O OH 5 O Daucosterol (TLE1.2) 4' 2' 6-Geranyl-7-hydroxy-8-methoxy coumarin (TLH29)-Mới trong chi Polygonum OH 2 4 3 10 OH 2' HO 7 9 O 6' OH O Quercetin (TLE1.3) 11 3' OH OH 1 1' O O OCH3 4' 8 3 2 9 8 OH HO 4 10 7 20' 29 5 6 13' 12' 6 HOH HO HO 28 6' 1' 3' 18 26 22 18 5' HO 6' 5' 3' 10 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (TLH23)- chất mới trong tự nhiên 21 10' 7' 9 7 6 1' 29 3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9) -Mới trong cây 3 HN 28 9' 5 26 8 30 29 OH 27 5 OH HOH 9 3 H3 C Musizin (TLH5) Mới trong cây HO 25 24 23 13 14 10 O 20 17 19 1 5 3 22 18 2 6 OH 21 1 9 7 28 19 OH O 5 10 OH 4 OH 1' 2 6' 3 OH O Myricetin (TLE 1.5) O OH O 6a O 6 O 3a 3 OCH3 3' 1' 1 8 8a O 6'a O 7 1 9a 9 5 OCH3 4 O H3CO O 4 1' 1 2 3 H3CO Physcion (TLE1.1.2) 2' 3' 4' 6' 5' 1'' O 2'' O 7' O OH CH3 4'' HO 6'' 5 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic axit (TLE1.1) Mới trong chi Polygonum 3,3',4-Trimethoxy 4'-O-α-Lrhamnopyranoside ellagic acid (TLE1.4) Mới trong cây 4 3 1 O 8 OH OH 3'' 5'' O OH O OCH3 5 6 3 4a 10a 6' O OH 10 H3C 6 OH O O 4-Hydroxymellein (TLE1.1.4) Mới trong cây O 1 2 3 4 HO O 6 7' 5 O 2' 6' 2 10 5 OH OH Acid chlorogenic (TLE1.7) OH O 4',5,7-Trihydroxy-3',5'dimethoxyflavone (TLE1.8) Mới trong cây 3' OH O H 5 4 OH O HO O OH4" O 5'' 1'' 9 2 6 10 5 OH COOH O HO HO 1' O HO 7 3'' OCH3 8'' N H 1'' OH O 1''' HO OH HO OH 2'' 7'' 6 O OH HO O 5 OH O (-)- Epicatechin (TLE2.1) O O H OH Maltose (TLE2.1.3) O OH O 4'' OH OH OH O 5'' O 2'' 3'' 4 OH 3 OH 4 1'' OH O HO H OH 6" Quercetin-3-O-β-D-glucuronid (TLE2.1.4) HO 6' 5' OH O 6'' CH3 Myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (TLE1.9) 4' 1' O 7 7 2" 8 HO OH 6' OH OH 2' 2 1' 10 5 OH 1' O 9 2 43 3 OH 3' 7 OCH3 6' 4 4' 1 HO O 7 3' 8' 9 HO OH 1' 9' 5' 9 3' OH 2' OH OH HO OH OCH3 HO 4 1 3 HN 4' N-[(4R)-2,5-dioxo-4imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5) Mới trong chi Polygonum 9'' OH 2 O OH 1'' NH HO HO 5' O 2' 1 O 5'' OH 5 OH O 2 3 O 3''' 6'' O 1' 3' H3CO HO O 6' 4'' O 2''' 4 6 OH 9''' 4''' 1''' 5''' 7''' 8''' 6''' 1,3- Diferuloyl O-Z-β-D-fructofuranosyl (1→2)-α-D-glucopyranosid (TLB11) Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4) 12 H3CO 1 6 HO 8 7' OH 9 7 3 8' 9' 9 10 3 OH O 5 OH 8' OH 11' OH Lyoniside (TLB13) O 2 1' 4 O O HO OH4" OH O 1'' 5'' Phổ 1H-NMR của TLH9 cho tín hiệu singlet của các proton thuộc về bảy nhóm metyl, trong đó có 6 nhóm metyl thế ba lần ở δH 1,73 (3H, s, H-18), 0,97 (6H, s, H-21& H-28), 0,87 (3H, s, H-27), 0,80 (3H, s, H29), 0,89 (3H, s, H-30) và một nhóm metyl cacbonyl ở δH 2,17 (3H, s, 3-COCH3); hai proton của vòng cyclopropane cho tín hiệu doublet rất đặc trưng tại δH 0,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J=4,0Hz, H19b). Một proton metin cộng hưởng chuyển dịch về trường thấp hơn (δH 4,10) chứng tỏ nó phải liên kết với cacbon gần dị tố (ở đây là nguyên tử oxi của nhóm hydroxyl). Tín hiệu proton của một nối đôi đầu mạch δ H 4,83 và 4,93. Thêm vào đó, sự có mặt của proton ở δH 3,28 (1H, m, H-3) chứng tỏ rằng TLH9 là một triterpene có khung cycloartane. Kết hợp giữa phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy TLH9 gồm 7 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 7 C bậc 4. Tín hiệu δC 170,0 và 21,4 (C-COCH3) đặc trưng cho sự có mặt của chức acetoxy (COCH3) trong công thức cấu tạo của TLH9. Sự xuất hiện của nối đôi đầu mạch (>C=CH2) cũng được khẳng định bởi các tín hiệu tại δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26) tương ứng với hai tín hiệu proton ở δ 4,83 và 4,93. Điều đặc biệt ở đây là sự xuất hiện của các pic cacbon theo cặp đôi của C-25 và C-26 ở δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25) và 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) chứng tỏ rằng hợp chất TLH9 là một hỗn hợp epimer R/S với tỷ lệ khoảng 01:01 gây ra bởi nguyên tử carbon bất đối ở C24. Từ việc phân tích trên, kết hợp với tham khảo tài liệu, so sánh các dữ kiện phổ đã công bố cho các hợp chất tương tự [10] cho phép kết luận về cấu trúc của TLH9 là 3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thồm lồm gai. OH 22 18 19 1 O 10 3 20 17 13 14 9 24 25 27 23 26 8 30 5 H 3C 28 29 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene1, 3, 4-triol (TLH23) - chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học Hợp chất TLH23 kết tinh dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, có điểm nóng chảy ở 216-218 °C. Các dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của chất TLH23 chỉ ra sự có mặt của một chức amid đặc trưng bởi một nhóm metin liên kết với nitơ ở δH 4,27 (1H, m, H-2) và tín hiệu cacbon cacbonyl ở δC 177,1 (C-1'); hai mạch cacbon béo đặc trưng bởi các tín hiệu ở δH 1,31 (60 H) và δH 0,92 (6H, t, J=6,5 Hz, H-20' & H-29), tín hiệu của hai nối đôi ở δH 5,44 (m, H-8, H-9) tương ứng với δC 131,5 (C-8), 131,4 (C-9) và 5,38 (m, H-10', H-11') tương ứng với δC 130,8 (C-10'), 130,9 (C-11'). Sự có mặt của đường glucose được đặc trưng bởi tín hiệu proton anome [δH 4,30 (d, J = 7,5 Hz, H-1'')] và cacbon anome δC 104,7 (C-1') và các tín hiệu 13C-NMR khác 13 OH Quercetin 3-O-β-D- glucopyranosid (TLE3) 3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9)- chất mới trong cây cây thồm lồm gai. 21 6" OH (–)-Epigallocatechin 3-O-gallate (TLE2.6) OH 9 2" 9' 13' HO HO OH 7 O OCH3 H3CO 3' OH 6' 7' OH 2' 6' 2 5 1" OH 1' O 7 O OH 1' HO O 5" OCH3 OH 3' OH nhau ở δC 62,7 (C-6''), 71,6 (C-4''), 75,0 (C-2''), 78,0 (C-5'') và 77,9 (C-3''). Tương tác giữa C-1 và H-1'' trên phổ HMBC cho phép khẳng định vị trí của liên kết glucosid giữa đường và amid. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết hợp chất TLH23 là một glycosphingolipid được tạo thành bởi hai hợp phần acid béo và bazơ mạch dài [117]. Phân tích tiếp phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu của ba proton hydroxymetin khác chuyển dịch về trường thấp ở δH 3,62, 3,53 , 4,04. Các tương tác COSY quan sát được của hai proton metylen (H-1) ở δH 4,08 và 3,82 với proton metin ở δH 4,27, tương tác của hai proton metin ở δH 4,27 với δH 3,62, tương tác của proton metin δH 3,62 với proton metin ở δH 3,53; đồng thời tương quan HMBC của proton ở δH 4,04 và C=O (δC 177,1) cho phép xác định vị trí liên kết chính xác của các proton này là ở C-3, C-4 và C 2'. Từ đây, cũng khẳng định về cấu trúc 1,3,4-triol của sphingolipid này OH OH 1 2 RO R1 3 R 1 , R 2 : M ach dài 4 HN 2' 1' R : glucose hoac g alactose R2 . OH O Để xác định hai hợp phần này ta sử dụng phương pháp thủy phân và kết hợp khảo sát phổ ESI-MS của sản phẩm như sau: Hợp chất TLH23 (15 mg) được hòa tan trong hỗn hợp dung môi metanol-acid HCl (5ml, 1M HCl trong 82% aq. MeOH), đun hồi lưu ở 80°C trong 18 giờ [117]. Để nguội phản ứng và chiết với nhexan. Phần chiết n-hexan sau đó được cô loại dung môi thu được sản phẩm là metyl este của hợp phần acid béo (TLH23.1). Độ dài mạch của hợp phần TLH23.1 được xác định bởi phổ ESI-MS (neg) với píc ion m/z 339 [M-H]- cho thấy mạch acid béo phải có 20 cacbon và chứa một nối đôi. Như vậy, nối đôi còn lại thuộc về hợp phần base. Vị trí của nối đôi trong phần acid béo được xác định tại C-10'/C-11' dựa trên các phân mảnh ở phổ ESI-MS (neg) của TLH23.1: m/z 227 [M-H-C8H18]-, m/z 213 [M-H-C9H18]-, m/z 187 [M-HC11H21]-, , m/z 173 [M-H-C12H23]-. Cấu hình của nối đôi này là Z do sự chuyển dịch về trường cao của hai cacbon kề bên C-9 (δC 28,3) và C-12 (δC 28,4). 2' 4' O 1' O 3' 6' 8' 20' 12' 227 173 OH 13' 10' 11' 7' 5' 187 213 m/z: 339 [M-H]- Trên phổ khối của TLH23 cho pic ion m/z 962 [M+Na]+ tương ứng với khối lượng phân tử 939 đvC và công thức phân tử C55H105NO10. Kết hợp với việc xác định được phần acid béo ở trên, ta xác định được độ dài của hợp phần base là 29 cacbon. Phân tích tỉ mỉ các tương tác COSY và HMBC xác định được vị trí của nối đôi trong mạch base là ở vị trí C-8. Cấu hình của nối đôi này được xác định là E dựa trên sự chuyển dịch về trường thấp của hai cacbon bên cạnh C-7 (δC 33,8) và C-10 (δC 33,7). Kết hợp với tài liệu tham khảo [27] cho phép kết luận cấu trúc hợp chất TLH23 là 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1,3,4-triol. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được công bố phân lập từ thiên nhiên. OH HOH HO HO O OH 29 OH 1 2 O 5 7 11 13 3 6 HN 9 1' O 2' OH 8 4' 3' 14 10 6' 5' 8' 7' 12 18 13' 10' 11' 12' 20' 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Phổ 1H-NMR của TLE1.1 chỉ xuất hiện 2 tín hiệu singlet tại δH 7,535 (1H, s, H-5') và 7,533 (1H, s, H5) được xác định là hai proton của vòng benzen. Tín hiệu singlet tại δH 6,38 (2H, s, H-3a) cho thấy sự có mặt của 2 proton methylenedioxy. Ngoài ra, nhóm methoxy được xác định bởi tín hiệu ở δH 4,05 (3H, s). Phổ 13C-NMR và DEPT của TLE1.1 cho thấy hợp chất này có 15 C trong đó 12 tín hiệu δC 110,9 (C1'), 112,1 (C-5'), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6'), 116,0 (C-6), 112,7 (C-1), 140,2 (C-3'), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 141,6 (C-2'), 150,0 (C-4), 150,0 (C-4') thuộc về hai vòng benzen với 10 cacbon bậc 4 và 2 cacbon metin. Ngoài ra, hai tín hiệu cacbon cacbonyl xuất hiện tại δC 157,6 (C-6'a), 158,3 (C-6a), rất đặc trưng cho cặp este nội vòng trong các dẫn xuất của ellagic acid. Phổ 13C-NMR và DEPT còn cho thấy sự xuất hiện của nhóm CH2 liên kết với 2 nguyên tử O tại δC 104,3 (C-3a) và nhóm methoxy tại δC 60,9 (s, 3-OCH3). Dựa vào dữ liệu phổ trên đồng thời so sánh với các dữ kiện phổ đã được công bố trước đó [21], [152], cấu trúc của chất TLE1.1 được xác định là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxyellagic acid. Đây là công bố đầu tiên về sự có mặt của hợp chất này trong P. perfoliatum cũng như các loài trong chi Polygonum. O 6a O 6 O 3a 3 OCH3 3' 1' 1 OH 6' O O 6'a O N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Hợp chất TLE5 có dạng tinh thể hình trụ màu trắng. Hiện màu tím với thuốc thử ninhydrin cho giả thiết về sự có mặt của nhóm amino trong cấu trúc của TLE5. Phổ 1H và 13 C- NMR (DMSO-d6) chỉ ra sự có mặt của 5 proton ở δH 10,52 (1H, s), 8,04 (1H, s), 6,87 (1H, d, J=8,0 Hz), 5,24 (1H, d, J=8,0 Hz), 5,77 (1H, s) và 4 tín hiệu cacbon (δC 173,6, 157,3, 156,7 và 62,3). Tuy nhiên trên phổ HSQC chỉ quan sát thấy duy nhất một tương tác doublet của một cacbon (δC 62,4) và proton (δH 5,24). Như vậy khung cấu trúc của hợp chất TLE5 không chỉ chứa cacbon và hydro mà còn có chứa các nguyên tử khác. Phổ HMBC chỉ ra tương tác của proton ở δH 8,04 với cacbon ở δC 62,4, 156,7, 173,6; của proton δH 6,87 với cacbon δC 62,4, 157,3, 173,6; proton ở δH 5,24 với cacbon at δC 157,3, 173,6; proton δH 5,77 và cacbon δC 62,4. Phổ MS của TLE5 không chỉ ra pic ion phân tử mà cho các phân mảnh ở m/z: 158, 141, 130, 115 và 87. Từ các dữ kiện phổ trên, kết hợp với tài liệu tham khảo [156] cho nhận định về cấu trúc của hợp chất TLE5 là 2,5-dioxo-4imidazolidinyl)-carbamic acid. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây thồm lồm gai và chi polygonum. Trên thế giới, cho đến nay cũng mới chỉ ghi nhận một tài liệu tham khảo về sự phân lập hợp chất này trong tự nhiên (trong cây Cistanche deserticola Y.C.ma, một loài cây thuộc họ Orabanchaceae ở Trung Quốc). O O 5 6 HO 7 N H 4 1 3 HN NH 2 O Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4) - chất mới từ chi Polygonum Trên phổ 1H-NMR cho các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton nhân thơm với hằng số tương tác J = 1,5 Hz đặc trưng cho proton ở vị trí meta ở vòng A của 5,7-flavonol với H 6,22 (1H, H-6), 6,42 (1H, H-8). Cặp 15 hai tín hiệu doublet khác tại H 8,10 (2H, d, J = 9,0, H-2', H-6') và 6,90 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5') đặc trưng cho hai proton ở vị trí meta với nhau thuộc vòng B thế para. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết TLB4 là một flavonoid có nhân kaempferol. So sánh số nguyên tử cacbon của TLB4 với kaempferol, kết hợp phân tích các tín hiệu cộng hưởng của nhiều proton trong vùng H 3,29 - 5,06 ppm chứng tỏ TLB4 phải chứa 2 đường. Trong đó một đường là rhamnose đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng proton doublet rất mạnh ở H 1,20 ppm (3H, d, J = 6,0 Hz) của nhóm CH3. Một đường khác là glucose với proton anomer ở H 5,05 (H-l'', d, J = 8,0 Hz) gắn trực tiếp vào nhân kaempferol tại OH ở vị trí C-3 (C 135,7) và nối với rhamnose ở H-1''' (H 4,55, s) thể hiện rõ nét trên phổ HMBC qua tương tác C-3 và H-1' và C-6'' và H-1'''. Cấu trúc kaempferol glycosid của TLB4 một lần nữa được khẳng định qua các dữ liệu phổ 13C-NMR với 27 tín hiệu C, trong đó ngoài 12 tín hiệu của 2 vòng đường tại C 105,6 (C-1''), 73,9 (C-2''), 75,4 (C-3''), 70,1 (C-4''), 75,1 (C-5''), 67,4 (C-6''), 101,9 (C-1'''), 72,1 (C-2'''), 72,3 (C-3'''), 72,9 (C-4'''), 69,7 (C-5'''), 17,9 (C-6'''), 15 tín hiệu còn lại của 15 nguyên tử cabon thuộc vào khung flavon. Hai tín hiệu CH bị chập đôi tại C 132,46 và 116,13 với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu CH khác và trên phổ HSQC chúng tương ứng với 2 tín hiệu proton mà mỗi tín hiệu có cường độ tích phân là 2H cũng khẳng định rõ vòng B thế para. Kết hợp với việc phân tích các dữ kiện phổ COSY, HSQC, HMBC có thể khẳng định rằng TLB4 là một flavonoid có tên gọi kaempferol-3-βD-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid [18]. Hợp chất này lần đầu tiên được công bố phân lập từ cây thồm lồm gai và chi polygonum. OH HO O OH HO O O OH O O OH O 1'' O OH O OH HMBC:H O O 1''' HO HO C O OH OH HO OH OH OH O HO OH 4.6.2. Các hợp chất được phân lập từ cây nghể trắng Từ các phần chiết thân rễ cây nghể trắng đã phân lập và xác định cấu trúc 17 hợp chất bao gồm: 25 26 O 16 17 14 15 11 13 8 10 12 6 7 9 5 22 OH 18 1 4 19 2 3 N H 18 28 31 Axit margaric (NTH1) Mới trong cây H N 16 10 28 19 21 O 29 27 24 20 17 22 O 12 9 O 17 13 8 7 O 14 20 5 3 CH3 1 4 HO Asperglaucide (NTH6) Mới trong cây β-Sitosterol (NTH2) OH 30 29 12 25 11 HO 2 4 HO 23 26 1 5 8 7 22 28 17 14 10 3 13 18 OH OHOH 20 31 1 O H HO 1'' OH COOCH3 3 5 15 1' O 6 24 Methyl maslinat (NTH24.1) Mới trong cây 12 18 2' 4' 3' 27 OH 13 11 8 2 HN 16 9 6 O 6' 5' 8' 7' 10' 11' 13' 22' 12' 32' 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8octadecaene-1, 3, 4-triol (NTH24.2)-Mới trong tự nhiên 16 30 20 29 25 26 13 14 1 9 10 3 HO 4 8 22 17 25 COOH 18 26 28 14 9 15 10 8 5 7 3 4 HO 6 Acid ursolic (NTH26.2) Mới trong cây 15 18 27 29 28 19 8 HO 9 HO HO OH 5 3 O 10 5 O O OH Daucosterol (NTH30) 4 O HO H3CO 4 3 OH OH Acid isoferulic (NTE2.6.1) Mới trong cây 30 29 8 19 6 2 HO 1 OH OH Axit gallic (NTE2.6.2) Mới trong cây CH3 H3CO 1 3 22 11 18 26 14 OH 4 20 12 25 OH 9 8 2 COOH Ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3) Mới trong cây O COOH 1 7 7 3 6' Isorhamnetin (NTE2.4.2) Mới trong cây O 1 3 7 6 O 9 H3C O 11 5 OH 1' 2 HOH 12 Zedoalactone B (NTE1.6) Mới trong chi OCH3 17 O 13 24 3' 24 8 7 OH 14 27 Acid oleanolic (NTH26.3) Mới trong cây 22 4 COOH 28 26 21 10 5 6 23 24 OH 1 22 17 13 1 27 7 5 23 12 18 15 HO 20 19 19 12 30 29 3 10 5 16 OH 28 8 27 6 HO 24 23 Uvaol (NTE3) Mới trong cây O OCH3 OCH3 OH 1 3 3 OCH3 OH 3-Methoxy-4-hydroxyacetophenone (NTB4)- Mới trong cây HO HO HO 1 6' O 1' 3' O OH 3,4,5-Trimethoxyphenol-1-O-βD-glucopyranoside (NTB8) - Mới trong cây 5 HO OH OH Acid 3,4,5-trihydroxycyclohex-1enecarboxylic (NTB11) 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol (NTH24.2)- chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học Các dữ kiện phổ 1H và 13 C-NMR của chất NTH24.2 có những nét tương đồng với hợp chất TLH23 được phân lập từ cây thồm lồm gai cho dự đoán về cấu trúc của glycosphingolipid. Phân tích chi tiết các dữ kiện phổ cho thấy, đơn vị đường liên kết với chức amid ở NTH24.2 là galactose thay vì glucose như ở TLH23. Đường galactose được đặc trưng bởi bởi tín hiệu proton anome [δH 4,32 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1'')] và cacbon anome δC 104,2 (C-1'') và các tín hiệu 13C-NMR khác nhau ở δC 61,3 (C-6''), 69,8 (C-4''), 73,3 (C2''), 76,1 (C-5'') và 74,1 (C-3''). Tương tác giữa C-1 và H-1'' trên phổ HMBC cho phép khẳng định vị trí của liên kết glycosit giữa đường và amid. Chức amid đặc trưng bởi một nhóm metin liên kết với nitơ ở δH 4,23 (1H, m, H-2) và tín hiệu cacbon cacbonyl ở δC 222,4 (C-1'); hai mạch cacbon béo đặc trưng bởi các tín hiệu trong khoảng δH 1,27–1,34 (54 H) và δH 0,88 (6H, t J = 6,5 Hz, H-19 & H-22'), tín hiệu của hai nối đôi ở δH 5,36 (m, H-10', H-11') và 5,41 (m, H-8, H-9) tương ứng với δC 129,7 (C-10'), 129,2 (C-11'), 130,4 (C-8), 129,6 (C-9). Tiếp tục phân tích phổ 1H và 13C-NMR, HMBC ta còn thấy rõ ba proton metin khác có liên kết với nhóm hydroxy chuyển dịch về trường thấp ở δH 3,62 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-3), δH 3,55 (1H, m, H-4), δ H 17 4,04 (1H, m, H-2'). Ở vùng trường thấp trên phổ 1H-NMR xuất hiện các cặp pic tín hiệu hướng về nhau theo hiệu ứng mái nhà, mỗi tín hiệu tương ứng với một proton, điều này chứng tỏ các cặp đôi này thuộc về một nhóm methylen bị phân tách tín hiệu δH 4,09 (1H, dd, J = 6,0; 10,5 Hz, H-1a); 3,80 (1H, dt, J = 2,0; 5,5; 10,5 Hz, H-1b) và δH 3,85 (1H, d, J = 12 Hz, H-6''a); 3,71 (1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, H-6''b). Ngoài sự khác nhau về phần đường, các cấu trúc glycospingolipid khác nhau còn có đặc trưng về vị trí nối đôi trong mạch bazơ và axít béo cũng như độ dài của mỗi mạch này. Để xác định số C và vị trí của nối đôi của NTH24.2, ta tiếp tục khảo sát phổ khối lượng phân giải cao. Trên phổ LC/ESI-MS/MS cho pic ion m/z [M+NH4 ]+ ở 972 tương ứng với khối lượng phân tử là 953 đvC và công thức phân tử là C56H107NO10. Các phân mảnh chính ở m/z 902 [M+3H-3HOH], 792 [M+H-Gal]+ chứng tỏ sự có mặt của 3 nhóm hydroxy và phân tử đường có trong phân tử của chất NTH24.2. Phân mảnh m/z 472 [M+H-Gal-C23H45]+•, 495 [M+HGal-C21H43]+• xác định vị trí nối đôi ở C-10'/C-11'; Phân mảnh m/z 478 [M+H-Gal-C18H34O3NH]+, 450 [M+H-Gal-C18 H34O3NH-CO]+• khẳng định có 32 nguyên tử C trong phần acid. Từ đây ta xác định được số phân tử cacbon của mạch bazơ còn lại là 18 cacbon. Vị trí của nối đôi trên mạch bazơ được xác định tại vị trí C-8/C-9 nhờ sự phân tích tỉ mỉ các tương tác C-H trên phổ HMBC. Cấu hình của các nối đôi được xác định dựa trên sự chuyển dịch về trường thấp của hai cacbon bên cạnh với C-8/C-9 là E do có C-7 (δC 32,3) và C10 (δC 32,2); và với C-10'/C-11' là Z do có C-9' (δC 28,9) và C-12' (δC 28,9). Kết hợp với tài liệu tham khảo [27] cho phép kết luận hợp chất NTH24.2 là một cerebroside có tên gọi 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được công bố phân lập từ tự nhiên. OH OH OHOH 1 O H HO 1'' 3 5 9 6 O OH 18 2' 4' HN 1' 4.6.3. 12 2 6' 8' 13' 10' 11' 7' 5' 3' O 13 11 8 22' 12' 32' OH Các hợp chất được phân lập từ cây mễ tử liễu Từ các phần chiết toàn bộ cây mễ tử liễu đã phân lập và xác định cấu trúc 20 hợp chất bao gồm 26 28 16 21 22 18 4 27 28 19 29 18 14 22 25 28 16 CH3 22 COOH 27 5 HO 3 23 Lupeol (MTH13) - Mới trong cây 1 1' O 7 28 16 9 1 24 24 18 14 8 HO 8 27 HO 21 26 8 3 3' H 19 12 9 1 29 H3C 21 26 28 β-Sitosterol (MTH10) 30 30 12 27 5 3 H 19 24 HO H H3 C 20 17 19 5 3 HO Stigmasterol (MTH11) 25 18 2 Axit montanic (MTH8.1) - Mới trong cây H 22 29 17 COOH 12 24 26 6 4 3 5 OH O Chrysin (MTE2.4) Mới trong cây 5 23 Acid betulinic (MTH16) 18 5' 29