Tài liệu Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VŨ THANH TRÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. TS. Trần Thị Phƣơng Liên Thái Nguyên - 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Tác giả Vũ Thanh Trà ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh. Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Tác giả luận án Vũ Thanh Trà iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ................................................................................................... i Lời cảm ơn ...................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................iii Danh mục các từ viết tắt.................................................................................. v Danh mục các bảng .........................................................................................vii Danh mục các hình ..........................................................................................viii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 1.1. Cây đậu tương và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương ......................................... 4 1.1.1. Cây đậu tương .............................................................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương ......................................................... 5 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương .................................. 9 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ......................................................................... 9 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương................................................... 13 1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương ......................... 17 1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái ........................................................ 17 1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học ................................................. 18 1.3.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA ................................................ 20 1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ................................................ 26 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương .................................................. 29 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U ..................33 2.1. Vật liệu ......................................................................................................... 33 2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh ................................................... 33 2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................ 37 2.1.3. Máy móc và thiết bị ...................................................................................... 37 2.1.4. Mồi của phản ứng RAPD và SSR ................................................................ 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 40 2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo .............................................................. 40 iv 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh ........................................................... 43 2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA........................................ 44 2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein .................................................... 48 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................53 3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương nghiên cứu ....................................................................................................... 53 3.2. Phân tí ch đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương ên nghi cứu.... 58 3.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong các hạt của các giống đậu tương nghiên cứu ..................................................................... 58 3.2.2. Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của một số giống đậu tương .................................................................................... 61 3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt ................................................................................ 64 3.3.1. Phân tí ch tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử RAPD.............................................................................................................................. 64 3.3.2. Phân tí ch tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR 3.4. .................................................................................................. 70 Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt ................................................................ 76 3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ......................................................... 77 3.4.2. Phân tích các protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều ...................... 79 3.4.3. Nghiên cứu tí nh đa hì nh protein của các giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều ...................................................................................... 90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................99 1. Kết luận .......................................................................................................99 2. Đề nghị ........................................................................................................100 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN........101 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................102 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl 2DE AFLP Microliter Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản APS Ammonium persulfate AUDPC Area Under Disease Progress Curve Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan bp Base pair - cặp bazơ CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] cm Centimeter CTAB Cetylmethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid - ADN dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid ESI-Q Elecspray ionization Q Trap- Phương pháp khối phổ sử dụng tí nh TRAP năng bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử EtBr Ethidium bromide HPLC High-performance liquid chromatography -Sắc ký lỏng hiệu năng cao IAA Indole-3-acetamide IEF Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện IMA Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria INTSOY International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế, Hoa Kỳ IPG Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định IRRI International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc tế, Philippin Kb Kilo base vi kDa mA MAS ml MS/MS NST OD PCR PEG PIC Kilo Dalton MiliAmpe Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử Mililiter Mass spectrometry/ Mass spectrometry - Khối phổ liên tục Nhiễm sắc thể Optical Density- Mật độ quang học Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase Polyethylene glycol Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình PMSF PR protein QTL R gen R protein RAPD Phenylmethanesulphonylfluoride Pathogenesis-related protein - Protein liên quan đến mầm gây bệnh. Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng Resistant gen – Gen kháng bệnh Resistant protein - Protein khángbệnh Random amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên Restriction fragment length polymorphism - Đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế Ribonucleic acid Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống Sodium dodecyl sulfate SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis - Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có SDS Simple Sequence Repeat - Trình tự lặp lại đơn giản Tris acetate EDTA Trichloracetic acid N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine Phương pháp phân nhóm Volt – Vôn Weight/volume - Khối lượng/thể tích RFLP RNA SAR SDS SDSPAGE SSR TAE TCA TEMED UPGMA V w/v vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu .................................................... 33 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD ........................................................... 38 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR ....................................................... 39 Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến ...................... 46 Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide ...................................................................... 49 Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt .................................. 53 Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipid trong hạt của 50 giống đậu tương ...................... 59 Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương................................ 63 Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu ......................... 67 Bảng 3.5. Kết quả phân tí ch sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR .................................... 72 Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống ĐT 2000 được nhận diện bằng phương pháp khối phổ ........................................................... 84 Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh(ĐT12 và VMK)................................... 92 Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh ĐT12 và VMK ......................... 93 Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và giống kháng (ĐT2000, CBU8325) ..................................................................... 96 Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm với và giống kháng bệnh gỉ sắt ................................................................. 97 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Trang Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) .............................................. 10 Hình 1.2. Hình ảnh nấm P. pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương chụp dưới kính hiển vi điện tử ................................................................................. 12 Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm ......................................... 14 Hình 1.4. Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2-DE .................................................... 19 Hình 2.1. Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm ....................................................................................................... 42 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry ............................ 43 Hình 3.1. Hình ảnh lá của các giống đậu tương ở 3 mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắt .................................................................................................. 57 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 .............................................. 65 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18 ............................................... 66 Hình 3.4. Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân nhóm UPGMA ................................................................................................. 69 Hình 3.5. Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C), Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương ...................................................................... 71 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR .................................. 74 Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá đậu tương VMK, CBU8325, ĐT12 và ĐT 2000 ............................................ 78 Hình 3.8. Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu tương giống ĐT2000 ở thời điểm 6 (A) ngày và 9 ngày (B) ............................... 79 ix Hình 3.9. So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống ĐT12, ĐT2000, CBU8325 và VMK ............................................................... 81 Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký khối phổ ........................................................................................................... 83 Hình 3.11. Sơ đồ phân nhóm chức năng protein lá đậu tương giống ĐT2000 ............................................................................................................ 89 Hình 3.12. So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm của 2 giống sau khi gây nhiễm bệnh9 ngày (ĐT12 và VMK) .............................. 91 Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9 ngày của 2 giống nhiễm bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và 2 giống kháng bệnh gỉ sắt (ĐT2000 và CBU8325) ............................................ 95 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao , mang ý nghĩ a trong cải tạo đất trồng , dễ canh tá c, đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau . Hạt đậu tương chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế (lysine, leucine, tryptophan, methionine, cysteine…), 12-25% lipid và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) cần thiết cho cơ thể . Các sản phẩm từ đậu tương được sử dụng rộng rãi cho các mục đí ch khác nhau như làm thức ăn , dầu ăn, thực phẩm chức năng , nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng ca o, cây đậu tương còn có khả năng cố đị nh đạm nhờ vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần . Vì thế, việc trồng cây đậu tương không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn có tác dụng cải tạo đất. Do đó , cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới . Ở Việt Nam, đậu tương là cây trồng chí nh được ưu tiên khuyến khí ch phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc. Việt Nam từng là một nước “xuất khẩu” đậu tương vào những năm 1980 theo hạng mục tiểu ngạch , tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn hàng triệu tấn khô dầu đậu tương hàng năm . Mặc dù diện tí ch g ieo trồng có tăng hàng năm nhưng năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn đị nh , khả năng chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tí ch gieo trồng và làm giảm năng suất , chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm P. pachyrhizi gây ra và đang được coi là một trong những mối đe dọa chí nh trên cây đậu tương gây thiệ t hại đáng kể , làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở nhiều 2 nước trên thế giới trong đó có Việt Nam . Yêu cầu đặt ra hiện nay là cần phải chuyển giao các tiến bộ khoa học kỹ thuật đặc biệt là tạo ra nhữn g giống cây có năng suất cao , có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở rộng diện tí ch gieo trồng và nâng cao chất lượng hạt , đáp ứng được nhu cầu đậu tương trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu . Do đó , nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải pháp mang tí nh chiến lược cho sự phát triển bền vững. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể , tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trì nh phát triển bệnh , nghiên cứu dị ch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tí ch phản ứng bệnh mà chưa chú t rọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này . Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao. Xuất phát từ những lý do trê n chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài : “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ sắt nhằm phát hiện các giống kháng và nhiễm mới. 2.2. Xác định được sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA của các giống đậu tương nghiên cứu. 3 2.3. So sánh đa hình protein , lập được sơ đồ điện di protein lá đậu tương , sơ bộ rút ra được nét đặc trưng về protein giữa giống kháng và giống nhiễm bệnh gỉ sắt. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương. - Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu. - Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR. - Lập sơ đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp điện di một chiều , hai chiều và nhận diện protein trên hệ sắc ký -khối phổ. Đồng thời phân tích , so sánh sự đa dạng thành phần protein lá của một số giống đậu tương nhiễm và kháng bệnh gỉ sắt. 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1. Cây đậu tƣơng Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu (Fabaceae). Chi Glycine có hai chi phụ là Glycine và Soja. Chi phụ Soja có hai loài là G.max (L.) Merrill và G. soja Sieb. et Zucc. Glycine soja là dạng mọc leo hoang dại, hạt nhỏ, cứng và sản lượng thấp nên không được sử dụng trong nông nghiệp. Glycine max không thấy mọc hoang dại. Về nguồn gốc, đậu tương có nguồn gốc từ Đông Á , có thể mọc hoang dại từ thung lũng sông Dương Tử , các tỉnh phía Bắc và Đông Bắc Trung Quốc, hoặc các vùng kế cận của Cộng hòa liên bang Nga , Triều Tiên và Nhật Bản. Hầu hết các giống đậu tương địa phương đang trồng tại nước ta hiện nay đều du nhập từ Trung Quốc [8]. Về đặc điểm hình thái, cây đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm (lá tử diệp), lá nguyên (lá đơn) và lá kép, mỗi lá kép có từ 3 - 4, thậm chí đến 5 lá chét, mọc so le. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm, có màu sắc tuỳ từng giống khác nhau: màu trắng, tím, tím nhạt. Tỷ lệ đậu quả 20 - 30% tuỳ từng vụ... Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu. Tuỳ điều kiện canh tác mỗi cây con cho từ 20 400 quả. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Hạt to, nhỏ tuỳ theo các giống khác nhau, khối lượng 1000 hạt thay đổi trung bình từ 100 - 200g. Màu sắc rốn hạt ở các giống khác nhau là một biểu hiện đặc trưng của giống [9]. Về đặc điểm di truyền, đậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể (NST) lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn , ít có khả năng thụ phấn chéo . 5 Những nghiên cứu về hệ gen (genome) đậu tương cho thấy, bộ gen đậu tương có từ 1,29 x 109 đến 1,8 x 109bp cho bộ đơn bội. Trong số đó có khoảng 40 65% trình tự lặp lại (những trình tự này có kích thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb), các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có chiều dài 1,1 - 1,4kb) được xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [95]. Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm (từ 75 - 85 ngày); chín trung bình (từ 85 - 100 ngày) và chín muộn (từ 100 - 120 ngày). Thời gian sinh trưởng là yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh hay xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và các mầm bệnh, các giống thường thích hợp với từng vụ khác nhau [3]. 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tƣơng 1.1.2.1. Thành phần protein trong hạt đậu tương Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55%. Thực tế cho thấy, tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong hạt của loài thực vật này nhưng chúng vẫn lớn hơn hàm lượng protein của nhiều loài thực vật khác [6]. Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trì nh nảy mầm của hạt. Loại protein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin. Dựa vào hệ số lắng, người ta chia protein của hạt đậu thành 3 loại: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Những loại protein chính trong hạt đậu tương là: protein dự trữ (chiếm 70% tổng số protein), các enzyme, các chất ức chế protease và lectin. Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7%. Protein dự trữ trong hạt đậu tương bao gồm hai thành phần: conglyxinin (7,9S) và glyxinin (12,2S). Conglyxinin là vixilin của đậu tương, 6 có hệ số lắng là 7,9S, là protein dự trữ phổ biến trong hạt. Conglyxinin tách biệt ra trong các thể protein và được dự trữ trong suốt quá trình phát triển của hạt. Nó được thuỷ phân sau khi hạt nảy mầm để cung cấp nguồn carbon và nitơ cho hạt phát triển. -conglyxinin là một trong những cấu tử của conglyxinin, có khối lượng phân tử là 140 - 180 kDa. -conglyxinin gồm có nhiều tiểu phần khác nhau, trong đó có 3 tiểu phần chính là  (76 kDa), ‟ (72 kDa),  (53 kDa). Ngoài ra, còn có các tiểu phần nhỏ khác hiếm hơn đã được mô tả là ‟, ,  [94]. Thành phần thứ hai là glyxinin với hệ số lắng 12,2S và là dạng legumin của đậy tương. Glyxinin là protein chứa nhiều nhất trong đậu tương. Glyxinin là một hexamer protein gồm 5 tiểu phần. Mỗi tiểu phần bao gồm một chuỗi polypeptide có tính acid (trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 - 45 kDa) ký hiệu là A1a, A1b, A2, A3, A4 và chuỗi polypeptide có tính kiềm (khối lượng phân tử xấp xỉ 18 - 20 kDa) ký hiệu là B1b, B1a, B2, B3, B4, được nối với nhau bằng cầu nối disulfide [114]. Các giống đậu tương khác nhau cũng khác nhau về thành phần các chuỗi polypeptide cấu tạo nên glyxinin. Glyxinin của các giống khác nhau đã được chứng minh là khác nhau về thành phần amino acid, trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện (isoelectric point-pI). Tỷ lệ giữa glyxinin và -conglyxinin là 1,6: 1,0 (biến thiên từ tỉ lệ 3,0: 1,0 đến 1,0: 1,0 tuỳ giống). Glyxinin là nguồn dự trữ carbon và nitơ và được tích trữ trong quá trình hình thành phôi. Protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, bởi vì chúng chứa tất cả các amino acid không thay thế và cần thiết cho cơ thể. Hơn nữa protein của cây họ đậu còn có hàm lượng lysine rất cao so với protein từ các loại ngũ cốc khác. Tuy vậy, hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như methionine, cysteine vẫn còn thấp [3]. 7 1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạt đậu tương Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzen, toluen, ete, dầu hoả... Lipid còn là thành phần quan trọng của màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể . Ở đậu tương , hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E (200 mg/100g lipid). Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như carbohydrade , muối khoáng , nucleic acid , kích thích sinh trưởng [3]. Nói chung, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao. Giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipid, trong đó hàm lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định, làm cho hạt đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và làm thức ăn cho gia súc. Hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau. Bên cạnh đó, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có màu đen. 1.1.2.3. Protein lá và hệ protein lá đậu tương Protein là các đại phân tử có ở trong tất cả các loại tế bào và các bào quan. Protein lá đậu tương rất đa dạng , có hàng nghìn loại với kích thước phân tử khác nhau , từ những peptide nhỏ đến những phân tử với khối lượng lớn. Protein có nhiều vai trò khác nhau về chức năng sinh học , nhưng chủ yếu đóng vai trò quan trọng trong quá trì nh quang hợp giúp tổng hợp chất dinh dưỡng từ nguồn năng lượng ánh sáng mặt trời. Hệ protein (Proteome) là phần bổ trợ của hệ gen (Genome), hệ protein lá đậu tương bao gồm tất cả các protein có mặt trong tế bào lá ở một thời điểm nhất định . Trong lá có các protein liên quan đến chu trì nh quang hợp , 8 các protein tham gia vào phản ứng quang hóa, các protein dự trữ, các enzyme, các chất đề kháng , chất oxi hóa ... Ở các mô khác nhau, các giai đoạn khác nhau hệ protein lại có sự khác nhau . Vì hệ protein lá rất phong phú , đa dạng và không ổn định như hệ gen của cây đậu tương cho nên nghiên cứu hệ protein lá không hề đơn giản và đòi hỏi sự kết hợp của rất nhiều công nghệ và kỹ thuật [68], [86], [100]. Chức năng chính của lá thực vật là thu nhận năng lượng ánh sáng chuyển hóa chúng và dữ trữ dưới dạng các liên kết hóa học , . Do đó , có một số lượng lớn các protein của lá đậu tương là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Các protein lá đậu tương có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử như tiểu phần trung tâm phản ứng PSI, protein phức hệ liên quan oxi PSII, carbonic anhydrase, ferrodoxin. Các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi và chuyển hóa carbon như Rubisco, malate dehydrogenase, sedoheptulose-1,7-biphosphatase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase, phosphoglycerate kinase. Rubisco là enzyme chính có vai trò rất quan trọng trong quá trình cố định carbon. Ngoài ra, protein lá đậu tương có thể là các protein dự trữ như vegetative storage protein, stem 28 kDa protein, cyclophilin hoặc các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress như ascorbate peroxidase, catalase. 1.1.2.4. Một số nghiên cứu về hệ protein lá đậu tương Gần đây, các nghiên cứu về protein thực vật sử dụng phương pháp điện di 2 chiều (Two dimension electrophoresis-2DE) đã được công bố [33], [58], [74], [86], [92]. Một số nghiên cứu tập trung vào các protein của các bào quan như lục lạp [47], [72], ty thể [33], một số lại tập trung vào các mô thực vật như lá ngô [92], lá đào [101]. Các nghiên cứu trên rễ đậu tương [116] hoặc 9 trên hạt đậu tương đã thu được một số kết quả đáng kể [58], [83], [86], tuy nghiên các nghiên cứu về protein ở lá đậu tương vẫn đang ở mức sơ khai . Trong nghiên cứu của Sarma và cộng sự , các tác giả đã thành công trong việc phân tách hàng trăm các protein của các mô như lá, hạt và rễ đậu tương khi sử dụng phương pháp tách chiết protein và điện di 2 chiều [100]. Trong khi đó , Krishnan và cộng sự đã nghiên cứu hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp điện di 2 chiều và khối phổ , các tác giả đ ã phát hiện được 28 loại phosphoprotein trong lá [68]. Tương tự trong nghiên cứu của Xu và cộng sự , bằng phương pháp điện di và khối phổ các tác giả đã phân tách được 119 điểm protein trong đó đã nhận diện được 71 protein ở lá đậu tương [113]. Đây là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn , bằng việc áp dụng các kỹ thuật proteomics (kỹ thuật nghiên cứu , phân lập , tách chiết, phân tách và nhận diện cấu trúc , chức năng của hệ protein ) các tác giả đã gợi ý các ứng dụng trong việc xác đị nh các protein kháng bệnh. Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế. Đặc biệt trong vấn đề phân tích, nhận dạng và so sánh các protein lá đậu tương còn ít được công bố [113]. Từ thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận án này chúng tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và so sánh protein của lá đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương. Hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương. Bệnh gỉ sắt (soybean rust) được phát hiện đầu tiên vào năm1902 ở Nhật Bản sau đó lan nhanh sang hầu hết các nước châu Á , châu Phi, Nam Mỹ [80] và Mỹ 10 [102]. Các phát hiện về bệnh gỉ sắt ở Hawaii năm 1994 [67], Zimbabwe năm 1998 [69], Nigeria năm 1999 [28], Nam Mỹ năm 2001 [93], và Argentina năm 2002 [99] cho thấy nấm P. pachyrhizi vẫn đang lan tràn sang các vùng địa lý mới và ảnh hưởng nghiêm trọng đến mùa màng. Bệnh gỉ sắt được coi là mối đe dọa chính đối với năng suất đậu tương tại Mỹ [102]. Ở Brazil, bệnh này gây thiệt hại 1,2 tỷ đô la chỉ riêng trong năm 2003 [115]. Tại các nước bệnh đã trở thành dịch, năng suất đậu tương có thể giảm từ 10% đến 80% [90]. Về mầm bệnh, bệnh gỉ sắt ở đậu tương do hai loài nấm là P. pachyrhizi và P. meibomiae gây ra. Loài nấm gỉ sắt ở Châu Á P. pachyrhizi Sydow là loài gây hại nhất cho đậu tương và có độc tính cao hơn loài P. meibomiae (hình 1.2). Nấm gỉ sắt là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới cũng như ở Việt Nam . Nấm gỉ sắt là loại nấm ký sinh phá huỷ lớp tế bào bao bọc làm cho cây bị thoát hơi nước mạnh, các bộ phận cung cấp nước không thể tiếp tế đủ số nước bị mất đi, dẫn đến mất cân bằng giữa lượng nước hút vào và lượng nước thoát hơi, kết quả cây đậu tương bị héo. A B Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tƣơng bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) [118]