Tài liệu Nghiên cứu phơi nhiễm asen trước sinh và những biến đổi nhiễm sắc thể, đa hình một số gen trên trẻ sơ sinh ở Hà Nam

VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẠ THỊ BÌNH NGHIÊN CỨU PHƠI NHIỄM ASEN TRƯỚC SINH VÀ NHỮNG BIẾN ĐỔI NHIỄM SẮC THỂ, ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN TRÊN TRẺ SƠ SINH Ở HÀ NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2017 Công trình được hoàn thành tại Viện Sức khỏe nghề nghiệp và Môi trường, Bộ Y tế Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học-Công nghệ Việt Nam Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học-Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Nguyễn Khắc Hải Viện Sức khỏe nghề nghiệp và Môi trường 2. PGS. TS Nguyễn Huy Hoàng Viện Nghiên cứu Hệ gen, VAST Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ phiên chính thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi ….. ngày … tháng … năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại:  Thư viện Quốc gia Việt Nam  Viện Công nghệ sinh học  Trang web của Bộ GDĐT 1 MỞ ĐẦU Ô nhiễm asen (As) trong nước giếng khoan, nguồn nước tự nhiên, gây ra vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng trên quy mô toàn cầu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển nơi mà thiếu nước mặt an toàn sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt. Những năm gần đây, người ta ước tính rằng, trên thế giới có khoảng 150 triệu người có nguy cơ phơi nhiễm với asen qua nước ngầm. Ở những khu vực này, hàm lượng asen vượt quá khuyến cáo của WHO (10 µg/L) cho nước ăn uống sinh hoạt (Ravenscroft, 2009). Việt Nam là một trong những nước nằm trong bản đồ ô nhiễm asen trong nước ngầm trên thế giới (Andrew, 2003). Asen được cho là một trong các hóa chất gây ung thư ở người. Các tổn thương liên quan đến sử dụng nước ô nhiễm asen để ăn uống chủ yếu là: biến đổi sắc tố da, dày sừng, ung thư da, ung thư bàng quang, các bệnh về thần kinh, thai sản…Các tổn thương bệnh lý này xuất hiện sớm hay muộn phụ thuộc chủ yếu vào lượng asen vào cơ thể hàng ngày. Các bà mẹ có thai và trẻ em được xem như là những nhóm người dễ bị tổn thương nhất. Khi bà mẹ phơi nhiễm asen vô cơ, dù với một lượng rất nhỏ, chất hóa học này nhanh chóng được đưa đến bào thai qua đường nhau thai làm tăng nguy cơ xảy thai, sinh non hoă ăc tử vong sơ sinh hoă ăc gây giảm cân ở trẻ sơ sinh (Concha, 1998; Hopenhayn, 2003; Rahman, 2009). Gần đây, những nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng có sự khác biệt lớn có tính chất cá thể trong nhiễm độc asen (Pierce, 2012). Điều này cho thấy, yếu tố di truyền có vai trò tạo ra sự khác biệt trong đáp ứng nhiễm độc asen. Một số nghiên cứu cho thấy vai trò của đa hình di truyền đến nhiễm độc asen liên quan đến các gen mã hóa enzyme chuyển hóa asen và khử độc bao gồm enzyme AS3MT (asen (III) methyltransferase), GST (glutathione S-transferase) và MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase) (Schlawicke, 2007; Chung, 2009; Valenzuela, 2009). Những kết quả này chỉ ra rằng, đa hình di truyền trên gen AS3MT, GST có liên quan đến khả năng methyl hóa, chuyển hóa asen tạo ra sự khác biệt về thành phần asen trong cơ thể và có thể liên quan tình hình bệnh tật, qua đó có thể dự báo được khả năng phát sinh bệnh liên quan đến asen sau này. Những dấu hiệu sớm do ảnh hưởng của phơi nhiễm asen ở bào thai và trẻ sơ sinh bao gồm những thay đổi về gen và nhiễm sắc thể như biến đổi DNA, gây lệch bội, hình thành vi nhân, tổn thương nhiễm sắc thể, đột biến mất đoạn, trao đổi nhiễm sắc tử chị em và gây liên kết chéo DNA-protein. Những thay đổi vật chất di truyền này, nếu nặng có thể gây suy thai, dị tật… nếu nhẹ có thể ảnh hưởng tới sự phát triển về thể chất và tâm thần trong quá trình lớn lên của trẻ. Do vậy, phơi nhiễm asen ở bà mẹ, trẻ em và đặc biệt là ở trẻ sơ sinh là một yếu tố có thể gây suy thoái cả một thế hệ sau này. 2 Cho đến nay những nghiên cứu về tình trạng sức khỏe người dân sử dụng nguồn nước ngầm ô nhiễm asen ở Việt Nam chủ yếu là khảo sát tình trạng ô nhiễm asen và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc asen. Gần đây, Agusa và cộng sự năm 2009, 2010 có nghiên cứu đánh giá đa hình trên gen AS3MT và GST ở cộng đồng người Việt Nam sinh sống tại đồng bằng sông Hồng. Đây là những nghiên cứu đầu tiên về sự kết hợp các yếu tố di truyền với quá trình trao đổi chất asen ở người Việt Nam. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đánh giá về khả năng phơi nhiễm asen trước sinh và tác hại của việc phơi nhiễm asen lên vật chất di truyền của trẻ sơ sinh cũng như mối liên quan giữa yếu tố di truyền ở trẻ sơ sinh với phơi nhiễm asen trước sinh. Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài “Nghiên cứu phơi nhiễm asen trước sinh và những biến đổi nhiễm sắc thể, đa hình một số gen trên trẻ sơ sinh ở Hà Nam” nhằm đánh giá thực trạng phơi nhiễm asen trước sinh và mối liên quan giữa đa hình gen, một số biến đổi nhiễm sắc thể là hết sức cần thiết. Mục tiêu của đề tài: 1. Đánh giá thực trạng phơi nhiễm asen ở phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh ở tỉnh Hà Nam. 2. Xác định đa hình trên gen AS3MT, GSTO1, biển đổi trên gen CXCL1, tổn thương nhiễm sắc thể ở trẻ sơ sinh và mối liên quan với chỉ số phơi nhiễm asen trước sinh. Đóng góp mới của đề tài: 1. Đây là nghiên cứu đầu tiên về đánh giá phơi nhiễm asen từ nguồn nước ăn uống sinh hoạt của phụ nữ trong quá trình mang thai và khả năng phơi nhiễm asen trước sinh của trẻ sơ sinh tại Việt Nam. 2. Lần đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu xác định các đa hình gen ở trẻ sơ sinh liên quan đến chuyển hóa asen vô cơ, một số biến đổi nhiễm sắc thể trong tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm asen trước sinh và mối liên quan với các chỉ số phơi nhiễm asen. 3. Các số liệu, kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo cùng lĩnh vực và có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo cho công tác đào tạo, giảng dạy. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 142 trang được chia thành các phần: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 15 trang; Chương 3: Kết quả 34 trang; Chương 4: Thảo luận 25 trang; Kết luận và kiến nghị: 2 trang; Các công trình công bố của tác giả 1 trang; Tài liệu tham khảo 22 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh 5 trang; Phụ lục 25 trang. Luận án có 30 bảng số liệu, 22 hình và 181 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. 3 NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ô nhiễm asen trong nguồn nước tại Việt Nam Ô nhiễm asen trong nước ngầm hiện là mối quan tâm lớn ở nhiều nước trên thế giới. Hàng triệu người đang bị phơi nhiễm với asen thông qua nguồn nước bị ô nhiễm asen. Việt Nam cũng là một trong những nước nằm trong vùng có ô nhiễm asen nguồn nước ngầm trên bản đồ thế giới. Cho đến nay đã có khá nhiều các nghiên cứu đánh giá mức độ ô nhiễm asen nguồn nước ngầm ở Việt Nam, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng. Trầm trọng nhất là các tỉnh: Hà Nam, Nam Định, Hà Tây (cũ), An Giang, Đồng Tháp. Ở Hà Nam có tới 110/111 xã có trên 10% giếng có nồng độ asen vượt tiêu chuẩn cho phép (TCCP), trong đó 77 xã có trên 10% giếng có nồng độ As >50g/L, đặc biệt có 50 xã có trên 10% giếng có nồng độ As >100g/L, điển hình là các xã của huyện Bình Lục, Lý Nhân, Duy Tiên (UNICEF, 2004). 1.2. Chuyển hóa của asen trong cơ thể Các dạng asen vô cơ hòa tan trong nước được được hấp thụ qua đường tiêu hóa và phân phối đến các mô. Asen vô cơ vào máu chỉ vài giờ sau hấp thụ qua nước uống và được đưa đến trước hết là gan, thận, tụy, phổi, ruột và da. Vì cấu trúc tương tự như glycerol, AsIII có thể di chuyển vào tế bào thông qua cầu nối glycerol vận chuyển các hợp chất hữu cơ nhỏ như glycerol và ure. As V tồn tại giống như gốc phosphate mang oxy âm như H 2AsO2- và HAsO2- ở pH 5 -7 hoàn toàn có thể vào tế bào thông qua sự vận chuyển phosphat. Tại gan asen vô cơ (iAs) được chuyển hóa thành monomethylated arsenic (MMA) và tiếp tục thành dimethylated arsenic (DMA) thông qua quá trình methyl hóa khử liên tục và được đào thải ra nước tiểu ở dạng methyl asen hóa trị 5, một phần được tích lũy trong mô giàu keratin như tóc, móng (Maki-Paakkanen, 1998). Asen đào thải chủ yếu qua nước tiểu với thời gian bán hủy khoảng 4 ngày đối với người (WHO, 2000; NRC, 2001). Sự phức tạp trong chuyển hóa asen là hạn chế chính trong hiểu biết một cách khoa học về độc tính của asen. Ở người, asen được xác định trong mẫu sinh học, đặc biệt là nước tiểu ở các dạng As III, AsV, MMAV, DMAV, dạng monomethylated arsonous (MMAIII) cũng tìm thấy trong nước tiểu. Cơ chế gây độc của asen rất phức tạp và nó liên quan đến 5 chất chuyển hóa và tất cả các chất này đều có khả năng gây độc (AsIII, AsV, MMAV, MMAIII, DMAV). 4 1.3. Ảnh hưởng của ô nhiễm As trong nguồn nước lên sức khỏe và tổn thương vật chất di truyền ở người bị phơi nhiễm 1.3.1. Tác động của asen đối với vật chất di truyền Nhiều quan sát thực nghiệm cho rằng độc tính gây đột biến của asen chủ yếu liên quan đến tạo gốc tự do (Reactive Oxygen Species-ROS) trong quá trình chuyển hóa sinh học. Sản phẩm ROS có khả năng làm đứt gãy DNA, liên kết chéo và tổn thương nhiễm sắc thể. Cơ chế chính của tổn thường di truyền do asen thông qua cơ chế oxy hóa (Hình 1.1). Ức chế quá trình sửa chữa DNA cũng được coi là một trong những cơ chế chính gây độc đối với gen của asen. Hình 1.1. Sơ đồ tác động gây độc với vật chất di truyền của asen 1.3.2. Nghiên cứu biến đổi NST liên quan đến phơi nhiễm asen Asen, một chất gây ung thư, được coi là một trong những hóa chất nguy hiểm nhất thế giới. Phơi nhiễm lâu dài (như 5-10 năm) với asen từ nước uống và thức ăn có thể dẫn đến nhiễm độc asen, các bệnh liên quan bao gồm rối loạn sắc tố da, ung thư da, ung thư bàng quang, thận và phổi, bệnh về mạch máu ở chân và bàn chân, có thể mắc bệnh tiểu đường, tăng huyết áp, ảnh hưởng đến sinh sản (WHO, 2001; Santra, 2013). Trong nửa thế kỷ qua, người ta đã nhận thấy phơi nhiễm asen tác động đến sức khỏe con người phức tạp hơn nhiều so với dự đoán ban đầu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các bằng chứng tổn thương di truyền tế bào ở người phơi nhiễm với asen. Đánh giá sự tổn thương DNA trong tế bào lympho máu ngoại vi của những cá thể nhạy cảm với độc tính của asen đã được tiến hành bằng sử dụng kỹ thuật phân tích tổn thương nhiễm sắc thể. Karen Harrington và cs (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của phơi nhiễm asen lên nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu máu ngoại vi của những người làm việc tại Antofagasta, Chile. Kết quả cho thấy ở những người làm việc lâu năm bị phơi nhiễm asen cao có tần số biến đổi nhiễm sắc thể lớn hơn có ý nghĩa so với những người mới làm việc bị phơi nhiễm asen thấp (p<0,05) (Harrington, 1999). Mahata và cs 2003 tại tây Bengal, Ấn độ sử dụng kỹ thuật nhuộm đặc giemsa nhiễm sắc thể, thấy tần số bất thường nhiễm sắc thể ở nhóm phơi nhiễm asen (8,08%), cao hơn có ý nghĩa thống kê so nhóm chứng (1,96%) (Mahata, 2003). Pritha Ghosh và cs cho thấy bất thường 5 nhiễm sắc thể có thể được sử dụng làm chỉ thị đánh giá nguy cơ ung thư ở những người bị nhiễm asen (Ghosh, 2007). 1.4. Nghiên cứu đa hình gen và mối liên quan đến phơi nhiễm asen trong nguồn nước Những nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng có sự khác biệt lớn giữa các cá thể trong nhiễm độc asen. Điều này cho thấy, yếu tố di truyền có vai trò tạo ra sự khác biệt trong đáp ứng nhiễm độc asen. Một số nghiên cứu cho thấy vai trò của đa hình di truyền đến nhiễm độc asen liên quan đến các gen mã hóa enzyme chuyển hóa asen và khử độc, bao gồm các enzyme AS3MT (asen(III) methyltransferase), GST (glutathioneS-transferase) và MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase). Ngoài ra, một số đa hình nucleotid đơn có tính đặc hiệu ở các gen tham gia mã hóa yếu tố sửa chữa DNA được chứng minh là giảm khả năng sửa chữa do các tổn thương oxy hóa gây ra bởi asen. Các phân tích về SNP của các gen mã hóa các enzyme xúc tác quá trình methyl hóa được nghiên cứu để đánh giá sự khác biệt trong trao đổi chất hay độc tính của asen ở cấp độ cá thể và quần thể. Những kết quả này chỉ ra rằng đa hình di truyền của gen GSTO1 và AS3MT có liên quan đến sự methyl hoá asen trong nhiều động vật bao gồm cả con người và có thể là yếu tố liên quan đến sự khác biệt về thành phần asen trong nước tiểu. Hiệu quả của quá trình methyl hoá asen có thể bị ảnh hưởng bởi đa hình gen. Nghiên cứu gần đây trên ở những đứa trẻ sơ sinh từ các bà mẹ bị phơi nhiễm asen của Mahidol, Thái Lan cho thấy asen liên quan đến dấu hiệu biểu hiện của gen, trong đó đã phát hiện được 11 gen liên quan tới phơi nhiễm asen trong đó có CXCL1 (Fry, 2007). CXCL có thể xem như là biomarker trong phơi nhiễm asen trước sinh. 1.5. Nghiên cứu về ảnh hưởng của asen đến trẻ sơ sinh và mối liên quan đến phơi nhiễm trước sinh Phơi nhiễm với asen trong nước uống là vấn đề toàn cầu nhưng vẫn còn nhiều chưa biết về sự nhạy cảm trong cộng đồng, đặc biệt là trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh. Các nghiên cứu dịch tễ học và nghiên cứu trên các mô hình động vật đã cho thấy phơi nhiễm với asen từ lúc mang thai ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của thai nhi. Tuy nhiên các cơ chế phân tử vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Một số nghiên cứu khác đề cập đến biểu hiện các protein và ảnh hưởng miễn dịch khi phơi nhiễm với asen. Nghiên cứu thuần tập trên 200 cặp mẹ con ở Gomez Palacio, Mexico phơi nhiễm với iAs qua nguồn nước (0,5-236 µg/L) cho thấy hàm lượng MMA trong nước tiểu mẹ có mối liên quan nghịch với cân nặng của trẻ và tuổi thai. Hàm 6 lượng iAs trong nước tiểu mẹ có mối liên quan đến tuổi thai và chiều dài trẻ sơ sinh (Laine, 2015). Phơi nhiễm với asen từ những thời gian đầu đời có mối liên quan đến sức khỏe của trẻ sơ sinh, trẻ em và đến khi trưởng thành. Nghiên cứu thuần tập 130 phụ nữ mang thai tại Bangladesh cho thấy phơi nhiễm với asen trước sinh có liên quan đến giảm chức năng tuyến ức thông qua cảm ứng oxi hóa stress và chết theo chu trình tế bào, điều này gợi ý cho thấy những đứa trẻ đã bị ức chế miễn dịch từ thơ ấu (Ahmed, 2012). Những phân tích phản ứng của toàn bộ hệ gen với phơi nhiễm asen từ trong bào thai đã chỉ ra sự kích hoạt mạnh mẽ của một mạng lưới tích hợp của các con đường liên quan đến NF- kB, phản ứng viêm, sự tăng sinh tế bào, stress và chết theo chu kỳ tế bào. Mười một gen được cho là những gen quan trọng liên quan đến đáp ứng trước sinh của trẻ với asen và có thể là biomarker tiềm năng cho phơi nhiễm asen: CXCL1, DUSP1, EGR-1, IER2, JUNB, MIRN21, OSM, PTGS2, RNF149, SFRS5 và SOC3. Có mối liên quan về chức năng phân tử của 11 gen này gồm đáp ứng stress và điều hòa chu kỳ tế bào. Hiện nay ở Việt Nam, những nghiên cứu về tình trạng sức khỏe người dân sử dụng nguồn nước ngầm ô nhiễm asen đa số là khảo sát tình trạng ô nhiễm asen và biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhiễm độc asen. Một vài nghiên cứu của Agusa và cộng sự (2009, 2010, 2011) gần đây đánh giá mối liên quan đa hình trên gen AS3MT và GST với chuyển hóa asen ở cộng đồng người Việt Nam sinh sống tại đồng bằng sông Hồng. Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào đánh giá về thực trạng phơi nhiễm asen ở phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh cũng như xác định đa hình gen, một số biến đổi nhiễm sắc thể ở trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh và mối liên quan. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích so sánh, phối hợp với điều tra dịch tễ học. 2.2. Đối tượng và các chỉ số nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Huyện Lý Nhân, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam. Đối tượng nghiên cứu: - Nhóm đối chứng (asen trong nước ăn uống ≤10µg/L, hàm lượng asen niệu ≤ 60 µg/L): 50 bà mẹ và trẻ sơ sinh của họ - Nhóm nghiên cứu (asen trong nước ăn uống >10µg/L, hàm lượng asen niệu >60 µg/L): 100 bà mẹ và trẻ sơ sinh của họ Thời gian nghiên cứu: tháng 12/2012- 6/2014 Cỡ mẫu nghiên cứu: theo công thức tính cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang 7 n Z 2 α 1−  2 . p  1− p d2  Các chỉ số nghiên cứu - Nồng độ asen trong nước dùng sinh hoạt, ăn uống của từng gia đình các bà mẹ (nước giếng khoan sau lọc bằng bể cát sỏi) - Hàm lượng asen toàn phần trong nước tiểu mẹ - Hàm lượng asen thành phần trong nước tiểu mẹ (AsV, AsIII , MMA, DMA, AB) - Hàm lượng asen toàn phần trong tóc mẹ - Hàm lượng asen toàn phần trong máu cuống rốn (máu con) - Hàm lượng asen toàn phần trong tóc con - Hàm lượng creatinine niệu - Mối liên quan giữa phơi nhiễm asen ở mẹ và ô nhiễm asen trong nguồn nước sử dụng - Mối liên quan giữa phơi nhiễm asen ở trẻ sơ sinh với phơi nhiễm asen ở mẹ - Biến đổi NST và mối liên quan với phơi nhiễm asen - Đa hình gen AS3MT, GSTO1, đột biến trên gen CXCL1 và mối liên quan đến phơi nhiễm asen 2.3. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu Hóa chất - Các loại axit HNO3, H2SO4, HClO4, HCl đặc, H2O2, NaOH, NaBH4, KI, Amonioxxalat, axit ascorbic, dung dịch chuẩn As (Merck) dùng cho phân tích. - Các hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử thuộc các hãng Sigma, Merck, Fermentas, New England Biolabs. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu Mẫu nước: Các mẫu nước giếng sau lọc được chứa trong chai nhựa 500 ml để phân tích asen. Các mẫu nước sẽ được bảo quản ở 4-8oC cho đến khi phân tích. Mẫu tóc: Cắt 0,5 -1g từ chân tóc của các bà mẹ mang thai. Tóc của trẻ sơ sinh được lấy ngay khi sinh hoặc sau sinh 1- 3 tháng. Bảo quản trong các túi có khóa kéo ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Mẫu nước tiểu: 1 ml nước tiểu lấy vào tuýp có chứa sẵn 8µmol DDDC để xác định các chất chuyển hóa trong nước tiểu. 30ml nước tiểu để phân tích hàm lượng asen tổng số. Bảo quản lạnh khi vận chuyển và lưu mẫu ở tủ -20oC. Mẫu máu cuống rốn: Lấy mẫu máu cuống rốn sau khi đã chuyển trẻ mới sinh đi và trước khi sổ nhau trong vòng 2 – 3 phút. 8 Kỹ thuật phân tích - Kỹ thuật phân tích asen tổng số trong nước, asen tổng số trong nước tiểu, asen trong tóc (mẹ, con) bằng Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) - Kỹ thuật phân tích asen thành phần trong nước tiểu bằng hệ thống Khối phổ plasma cảm ứng kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (ICP/MS-HPLC) - Kỹ thuật phân tích asen trong máu cuống rốn bằng hệ thống Khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) - Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể bằng phương pháp nhuộm giemsa tế bào máu - Kỹ thuật xác định đa hình gen bằng Đa hình độ dài đoạn giới hạn (PCR-RFLP) - Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen 2.4. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu - Nhập số liệu bằng phần mềm EpiData. - Xử lý, phân tích số liệu trên phần mềm SPSS. - Các giá trị thống kê: Trung bình, độ lệch chuẩn, trung vị, tỷ lệ phần trăm. - Các kiểm định thống kê: Test khi bình phương, t- test, One way ANOVA, so sánh nhiều giá trị trung bình, phân tích hồi quy đơn biến. - Kết quả đọc trình tự được phân tích và so sánh với trình tự gen trong ngân hàng gen (ENSEMBL: ENSG00000160882) bằng phần mềm BioEdit4.7. 2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu - Tất cả đối tượng được giải thích rõ mục đích, ý nghĩa của nghiên cứu. - Tất cả các đối tượng nghiên cứu đều có bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu, đồng ý để con cái của họ tham gia nghiên cứu và họ có thể rút lui khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào họ muốn. - Nghiên cứu được sự chấp thuận của lãnh đạo địa phương, trung tâm y tế dự phòng tỉnh, các huyện, trạm y tế các xã được chọn vào nghiên cứu. - Thông tin thu được của các đối tượng nghiên cứu được giữ bí mật và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu. 9 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Phơi nhiễm asen của các bà mẹ đang mang thai Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy: Hàm lượng asen trung bình trong nước tiểu của bà mẹ nhóm nghiên cứu là 94,25 ± 33,96 µg/L, trung vị là 86,73 µg/L, cao hơn mức thâm nhiễm (60- 80µg/L) và cũng cao hơn hẳn hàm lượng asen trung bình trong nước tiểu của bà mẹ nhóm đối chứng là 22,27µg/L ± 10,74, trung vị là 20,06 µg/L. Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Bảng 3.1. Hàm lượng asen tổng số trong tóc, nước tiểu mẹ và asen thành phần Các chỉ số Hàm lượng As tóc (µg/g) Hàm lượng As niệu (µg/L) Hàm lượng As niệu (µg/g creatinin) AB trong nước tiểu (%) DMA trong nước tiểu (%) MMA trong nước tiểu (%) iAs (AsV+AsIII) trong nước tiểu (%) DMA/MMA trong nước tiểu (n=98) MMA/iAs trong nước tiểu (n=89) Nhóm ĐC (n=50) Trung Trung SD vị bình Nhóm NC (n=100) Trun Trung SD g vị bình 0,24 0,33 0,26 0,30 0,40 0,28 20,06 22,27 10,74 86,73 94,25 33,96 32,66 36,18 13,26 99,69 120,79 74,06 - 4,70 12,19 - 9,07 14,14 >0,05 - 68,71 17,53 - 71,62 16,15 >0,05 - 14,24 11,03 - 12,25 8,14 >0,05 - 12,34 13,85 - 7,05 9,40 <0,01 - 4,46 2,55 - 7,93 4,39 <0,00 1 - 1,54 1,34 - 6,30 17,95 >0,05 p >0,05 <0,00 1 <0,00 1 Hàm lượng asen trung bình trong tóc bà mẹ nhóm nghiên cứu là 0,4 ± 0,28 µg/g cao hơn hàm lượng asen trung bình trong tóc mẹ nhóm đối chứng là 0,33 µg/g ± 0,26. Tuy nhiên sự khác biệt giữa 2 nhóm chưa có ý nghĩa thống kê (p >0,05). Kết quả phân tích asen thành phần trong nước tiểu cho thấy tỷ lệ trung bình DMA, MMA nhóm đối chứng là 68,71%, 14,24% nhóm nghiên cứu là 71,62%, 12,25% sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê với p>0,05; Sự methyl hóa thứ cấp từ MMA thành DMA thể hiện ở tỷ lệ DMA/MMA. Kết quả cho thấy tỷ lệ trung bình DMA/MMA của nhóm đối chứng (4,46 ± 2,55) thấp hơn nhóm nghiên cứu (7,93 ± 4,39), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,001. 10 Bảng 3.2. Hàm lượng asen trong nước tiểu, tóc mẹ theo mức độ ô nhiễm asen trong nước Mức độ ô  10 μg/L (1) > 10 -  50 μg/L (2) nhiễm As n M SD n M SD trong nước As nước 22,2 10,7 92,8 30,9 tiểu mẹ 50 78 7 4 0 7 (μg/L) As tóc mẹ 50 0,33 0,26 78 0,37 0,13 (μg/g) n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn >50 μg/L (3) P n M SD 22 99,4 2 43,38 P1-2<0,001 P1-3<0,001 22 0,50 0,38 P 1-3<0,01 P2-3<0,05 Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng asen trong nước tiểu bà mẹ nhóm phơi nhiễm asen trong nước từ >10-  50 μg/L và > 50 μg/L cao hơn có ý nghĩa với p<0,001 so với nhóm đối chứng. Hàm lượng asen trong tóc bà mẹ ở nhóm phơi nhiễm asen trong nước >50 μg/L cao hơn có ý nghĩa với p<0,01 so với nhóm đối chứng và với p<0,05 so với nhóm phơi nhiễm với asen trong nước  50 μg/L. Bảng 3.3. Hàm lượng asen trong tóc mẹ theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ Nhóm đối chứng Nhóm NC1 (<60) (1) (60-86,73) (2) n M SD n M SD Asen tóc mẹ 0,2 0,3 0,2 50 0,33 50 (μg/g) 6 7 5 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Nhóm asen nước tiểu mẹ (μg/L) Nhóm NC2 (>86,73) (3) n M SD 0,4 50 0,30 3 P P1-3<0,05 P2-3>0,05 Hàm lượng asen trung bình trong tóc nhóm NC1 là 0,37 ± 0,25 μg/g thấp hơn so với nhóm NC2 là 0,43 ± 0,30 μg/g. Như vậy, hàm lượng asen trong tóc có xu hướng tăng dần theo mức độ hàm lượng asen trong nước tiểu, tuy nhiên chỉ có sự khác biệt giữa nhóm NC2 với nhóm ĐC là có ý nghĩa thống kê với p<0,05. 3.2. Phơi nhiễm asen trước sinh của trẻ sơ sinh Bảng 3.4. Hàm lượng asen tổng số trong máu cuống rốn và tóc của trẻ sơ sinh Các chỉ số As tóc con (µg/g) n 100 Nhóm nghiên cứu Trung M vị 0,40 0,51 SD n 0,43 50 As máu cuống 100 7,12 6,81 2,54 50 rốn (µg/L) n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Nhóm đối chứng Trung M SD vị P 0,19 0,30 0,34 <0,01 3,28 3,62 1,88 <0,001 Hàm lượng As trung bình trong tóc trẻ nhóm nghiên cứu cao hơn hẳn nhóm đối chứng (0,51 µg/g và 0,3 µg/g). Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống 11 kê với p<0,01. Hàm lượng As tổng số trung bình trong máu cuống rốn của con nhóm nghiên cứu là 6,81 ± 2,54 µg/L, trung vị là 7,12 µg/L, cao hơn hẳn hàm lượng As tổng số trung bình trong máu cuống rốn của con nhóm đối chứng là 3,62 ± 1,88 µg/L, trung vị là 3,28 µg/L. Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p< 0,001. Bảng 3.5. Hàm lượng asen trong máu cuống rốn và tóc trẻ sơ sinh phân bố theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước của bà mẹ nhóm nghiên cứu Mức độ phơi nhiễm As nước n As tóc con (μg/g) 78 ≤ 50,0 µg/L M SD 0,51 0,44 n > 50,0 µg/L M SD P 22 0,52 0,43 >0,05 As máu con (µg/L) 78 7,06 2,55 22 n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn 5,92 2,37 >0,05 Kết quả cho thấy hàm lượng asen trung bình trong tóc và máu cuống rốn con giữa hai nhóm phơi nhiễm không có sự khác biệt. Bảng 3.6. Hàm lượng asen trong máu cuống rốn và tóc trẻ sơ sinh phân bố theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ Chỉ số As trong tóc con (μg/g) As trong máu con (µg/L) Nhóm nước tiểu n M SD Độ tin cậy 95% a Nhóm chứng 50 0,30 0,34 0,20 - 0,39 Nhóm NC1 50 0,54b 0,49 0,40 - 0,68 Nhóm NC2 50 0,48 0,37 0,38 - 0,59 Tổng 150 0,44 0,42 0,37-0,51 Nhóm chứng 50 3,62a 1,88 3,08 - 4,15 Nhóm NC1 50 6,61b 2,53 5,89 - 7,33 Nhóm NC2 50 7,01c 2,56 6,28 - 7,73 P <0,01 (a,b) <0,001 (a,b) <0,001 (a,c) Tổng 150 5,74 2,78 5,29 - 6,19 a,b,c là ký hiệu của hàm lượng asen trung bình của nhóm khác nhau có ý nghĩa thống kê; n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Hàm lượng asen trung bình trong tóc trẻ sơ sinh nhóm NC1 (0,54 μg/g) và nhóm NC2 (0,48 μg/g) cao hơn nhóm đối chứng (0,3 μg/g). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm đối chứng và nhóm NC1 với p<0,01. Hàm lượng asen trung bình trong máu cuống rốn nhóm NC2 (7,01 μg/L) lớn hơn không có ý nghĩa so với nhóm NC1 (6,61 μg/L) nhưng hàm lượng asen trong máu cuống rốn trẻ sơ sinh ở cả hai nhóm đều lớn hơn nhóm đối chứng (3,62 μg/L) với p<0,001. Hàm lượng asen trong máu cuống rốn trẻ sơ sinh tăng theo mức độ phơi nhiễm asen trong nước tiểu mẹ. 12 3.3. Một số biến đổi về nhiễm sắc thể ở tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh và mối liên quan với phơi nhiễm asen trước sinh Bảng 3.7. Tần số tổn thương nhiễm sắc thể ở nhóm NC và nhóm ĐC Chỉ số NC Số tế bào Lệch bội Bất thường cấu trúc kiểu NStử Gap Isogap Đứt Trao đổi NStử Tổng số Mất đoạn Gãy không tâm Bất thường Minus cấu trúc kiểu Dic NST Tri R Tổng số bất thường Tỉ lệ (%) Nhóm ĐC(n) 4500 17 (0,38%) 1 11 4 0 Nhóm NC(n) 8700 72 (0,83%) 73 4 11 0 16 (0,36%) 88 (1,01%) 0 0 0 0 0 0 33 0,73 1 1 1 0 0 0 163 1,87 P <0,001 <0,0001 >0,05 >0,05 p<0,05 p<0,0001 Tần số tổng các loại tổn thương nhiễm sắc thể tính trên 100 tế bào ở nhóm trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh (1,87%) cao gấp 2,56 lần nhóm đối chứng (0,73%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,0001. Tỷ lệ lệch bội ở nhóm phơi nhiễm (0,83%) cao gấp 2,18 lần nhóm đối chứng (0,38%). Sự khác biệt này cũng có ý nghĩa thống kê với p< 0,001. Tỷ lệ tổng bất thường kiểu nhiễm sắc tử ở nhóm phơi nhiễm (1,01%) cao gấp 2,83 lần nhóm đối chứng (0,36%). Sự khác biệt này cũng có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể giữa hai nhóm nghiên cứu và nhóm đối chứng. Hình 3.1. Hình ảnh bộ nhiễm sắc lệch bội (n=45) ở mẫu NT41 13 Hình 3.2. Hình ảnh minus ở mẫu HT22 Bảng 3.8. Tỷ lệ đối tượng có bất thường nhiễm sắc thể ở hai nhóm có phơi nhiễm (nhóm NC) và không phơi nhiễm (nhóm ĐC) Có Nhóm NC n % 51 58,6 Nhóm ĐC n % 15 33,3 Không 36 41,4 30 66,7 Có Không Có 28 59 41 32,2 67,8 47,1 9 36 10 20,0 80,0 22,2 Không 46 52,9 35 77,8 Có Không Không 1 BT 2 BT 3 BT 3 84 36 32 17 2 3,4 96,6 41,4 36,8 19,5 2,3 0 45 30 11 4 0 0,0 100,0 66,7 24,4 8,9 0,0 Chỉ số nghiên cứu Bất thường NST Bất thường lượng NST số Bất thường cấu trúc NStử Bất thường cấu trúc NST Số lượng các bất thường p; OR(CI 95%) p<0,01; OR= 2,83 (CI 95%: 1,34-6,01) >0,05 p<0,01; OR= 3,12 (CI 95%: 1,38-7,08) *p>0,05 p<0,05 * Fisher's exact test Kết quả tỷ lệ đối tượng có bất thường nhiễm sắc thể ở hai nhóm có phơi nhiễm và đối chứng cho thấy: Nhóm NC có tỷ lệ số đối tượng có bất thường NST là 58,6% cao hơn so với nhóm đối chứng là 33,3% với OR=2,83, p<0,01. Bất thường cấu trúc NStử ở nhóm NC chiếm tỷ lệ 47,1% cao hơn so với nhóm ĐC (22,2%) với OR=3,12, p<0,01. Không phát hiện thấy sự khác biệt về tỷ lệ đối tượng có bất thường về số lượng nhiễm sắc thể, bất thường cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể. Bảng 3.9. Hàm lượng asen nước tiểu mẹ, tóc con, máu cuống rốn ở các đối tượng có và không có bất thường NST trong nhóm nghiên cứu Nhóm có bất BT NST Nhóm không có BT NST n M SD n M SD As nước tiểu mẹ (µg/L) 51 95,05 33,84 36 93,87 34,31 As tóc con (µg/g) 51 0,45 0,38 36 0,61 0,48 Asmáucuốngrốn(µg/L) 51 7,66 2,26 36 6,31 2,35 n: số đối tượng; M:trung bình; SD: độ lệch chuẩn Chỉ số nghiên cứu p >0,05 >0,05 <0,01 14 So sánh bất thường NST trong nhóm NC cho thấy: Hàm lượng asen máu cuống rốn ở nhóm trẻ sơ sinh có bất thường NST là 7,66 ± 2,26 µg/L cao hơn nhóm không có bất thường NST 6,31±2,35 có ý nghĩa với p<0,01. Không thấy có sự khác biệt về hàm lượng asen trong nước tiểu mẹ, asen trong tóc trẻ sơ sinh giữa hai nhóm. 3.4. Kết quả xác định đa hình gen, đột biến gen ở tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh và mối liên quan với phơi nhiễm asen trước sinh Nhân các đoạn gen AS3MT, GSTO1 Hình 3.3. Một số hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen AS3MT bằng cặp mồi E9 M: Marker- thang DNA chuẩn 100 bp; 1: NS19, 2:OL15, 3: NS22, 4: HT49, 5: HT68, 6: HT69, 7: 71, 8: BS09, 9: CL71, 10: CL76 Để tiến hành nhân các đoạn gen AS3MT và GSTO1 bằng kỹ thuật PCR, 6 cặp mồi đặc hiệu Up, I3, E9, G1, G4, G5 đã được sử dụng. Sản phẩm PCR được tiến hành kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR thu được đặc hiệu, các băng rõ ràng, không bị đứt gãy. Nhân gen CXCL1 Sản phẩm PCR của gen CXCL1 sử dụng hai cặp mồi C3 và C4 được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Đoạn CXCL1-3 có kích thước khoảng 0,75 kb; Đoạn CXCL1-4 có kích thước khoảng 0,85 kb. Kết quả điện di cho thấy các băng thu được có kích thước tương đương với kích thước theo tính toán lý thuyết và sản phẩm không có băng phụ. A B Hình 3.4. Kết quả nhân gen CXCL1 A: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CXCL1-3. B: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen CXCL1-4. M: Marker 100 bp; 1B: VL07, 2B: VL18, 3B: VL28, 4B: CL11, 5B: Cl37, 6B: Cl54, 7B: CL60, 8B: HT31, 9B: HT38, 1C: VL07, 2C: VL18, 3C: VL28, 4C: CL11, 5C: Cl37, 6C: Cl54, 7C: CL60, 8C: HT31, 9C: HT38, 10C: HT03, 11C: HT08, 12C: HT09, 13C: HT12, 14C: HT27. 15 Sản phẩm PCR của gen CXCL1 sau đó được tiến hành tinh sạch qua cột tinh sạch của hãng Fermantas để loại bỏ những thành phần còn dư lại trong quá trình chạy PCR như mồi hay dNTP. Sản phẩm tinh sạch được đo quang phổ để xác định nồng độ và độ tinh sạch cho giải trình tự gen. Hình 3.5. Ảnh điện di đại diện một số sản phẩm PCR cắt bằng enzyme giới hạn Cac8I M: marker 100bp, 1: BS09, 2: CL100, 3: NS08, 4: NS17, 5:TS04, 6: NT102, 7: TS11, 8: NT68, 9: NS25, 10: VL18, 11: VL07 Bảng 3.10. Tần xuất xuất hiện các kiểu gen tại các điểm đa hình nghiên cứu trên gen AS3MT và GSTO1 Gen AS3MT Điểm đa hình E9 (rs11191439) 14458 UP (rs7085104) 4602 Kiểu gen % TC 14 9,46 TT 134 90,54 CC 0 0 Tổng 148 100 AA 21 14,19 AG 77 52,03 Gen GSTO1 Điểm đa hình G5 (rs11509439) Kiểu gen n % CC 146 97,99 TT 3 2,01 TC 0 0 149 150 100 100 TT 0 0 TC 0 0 Tổng CC G4 (rs15032) GG 50 33,78 Tổng 148 100 Tổng 150 100 3 2,00 AA 17 11,64 TC 28 18,67 AC 28 19,18 TT 119 79,33 CC 101 69,18 Tổng 150 100 Tổng 146 100 CC I3 (rs 4917989) 5913 n G1 (rs4925) Với điểm đa hình rs11191439 trên gen AS3MT, kiểu gen TT chiếm chủ yếu (90,54%), còn lại là kiểu gen TC (9,46%), không có kiểu gen CC trên các mẫu nghiên cứu và đối chứng. Xét về allele, allele T chiếm 95,27%, allele C chỉ chiếm 4,73%. Điểm đa hình rs4917989 trên gen AS3MT cũng đa phần xuất hiện kiểu gen TT (79,33%), kiểu gen CC chỉ xuất hiện ở 3 mẫu chiếm 2%, còn lại kiểu gen dị hợp tử TC chiếm 18,67%. Xét về allele, allele C chiếm 11,33% trong khi allele T chiếm 88,67%. Điểm đa hình AS3MT rs7085104 có kiểu gen đồng hợp 16 tử AA và GG lần lượt chiếm 14,19% và 33,78% trong khi dị hợp tử AG chiếm 52,03%. Allele A và G có tần xuất xuất hiện tương đối đồng đều hơn 2 điểm đa hình trên, allele A chiếm 40,20%, allele G chiếm 59,80%. Điểm đa hình GSTO1 rs15032 chỉ xuất hiện duy nhất 1 kiểu gen CC ở tất cả 150 mẫu trong nghiên cứu (100%). Điểm đa hình GSTO1 rs11509439 cũng đa phần là kiểu gen CC (97,99%), tương ứng allele C chiếm 97,99% còn kiểu gen TT chiếm 2,01% tương ứng allele T cũng chiếm 2,01%, không xuất hiện dị hợp tử ở đa hình này. Điểm đa hình GSTO1 rs4925 có tần xuất xuất hiện kiểu gen đồng hợp tử AA chiếm 11,64%, đồng hợp tử CC chiếm 69,18%, dị hợp tử AC chiếm 19,18%. Xét về allele, allele A chiếm 21,23% và allele C chiếm 78,77%. Phân tích trình tự gen CXCL1 Kết quả giải trình tự gen CXCL1 được phân tích bằng phần mềm tin học BioEdit4.7. Trên phần mềm này, chúng tôi so sánh trình tự DNA đã được đọc với trình tự gen CXCL1 chuẩn trên ngân hàng gen người Hình 3.6. Kết quả giải trình tự gen CXCL1 ở một số mẫu Kết quả phân tích trình tự cho thấy có 3 vị trí có sự sai khác về kiểu gen . Các vị trí này được xác định thuộc các điểm đa hình rs2071425, rs765355 và rs4074 của gen CXCL1. Bảng 3.11. Tần xuất kiểu gen của các điểm đa hình trên gen CXCL1 Điểm đa hình rs2071425 rs765355 rs4074 Kiểu gen AA AG GG Tổng CG GG Tổng AA AG GG Tổng n 7 18 5 30 8 22 30 5 19 6 30 % 23,3 60,0 16,7 100 26,7 73,3 100 16,7 63,3 20,0 100 Với điểm đa hình CXCL1 rs2071425, kiểu gen AG chiếm 60%, kiểu AA chiếm 23,3% và GG chiếm 16,7% trên toàn bộ 30 đối tượng được phân tích trình tự. Xét về allele, allele A chiếm 53,3% cao hơn so với allele G (chiếm 46,7%). Điểm đa hình CXCL1 rs765355 xuất hiện 2 kiểu gen GG (73,3%) và CG (26,7%). Allele G chiếm ưu thế với tỷ lệ 86,65%, allele C chiếm 13,33%. Điểm 17 đa hình CXCL1 rs4074 có kiểu gen dị hợp tử AG chiếm ưu thế (63,3%), sau đó là 2 dạng đồng hợp tử AA và GG lần lượt chiếm 16,7% và 20,0%. Allele A và G có tần xuất xuất hiện tương đối đồng đều 48,35% và 51,65% tương ứng Mối liên quan giữa từng điểm đa hình gen AS3MT, GSTO1 và CXCL1 với phơi nhiễm trước sinh Trên gen GSTO1, tại cả 3 điểm đa hình chúng tôi chưa tìm thấy mối liên quan giữa hàm lượng asen trung bình trong máu cuống rốn và asen trong tóc con với các kiểu gen. Trên gen CXCL1, tại 2 điểm đa hình rs765355 và rs4074 chưa tìm thấy sự khác biệt về hàm lượng asen trong máu cuống rốn và tóc con. Tại điểm đa hình rs2071425 chưa tìm thấy sự khác biệt giữa các điểm đa hình và hàm lượng asen trong máu con, nhưng có sự khác biệt giữa kiểu gen với hàm lượng asen trong tóc con: Trẻ mang đồng hợp tử AA có hàm lượng asen trung bình trong tóc (0,61 µg/g) cao hơn dạng đồng hợp tử GG (0,43 µg/g) và cao hơn hẳn dạng dị hợp tử AG (0,32 µg/g) có ý nghĩa với p <0,05. Bảng 3.12. Mối liên quan giữa hàm lượng asen trong tóc, máu con với các vị trí đa hình ở nhóm nghiên cứu AS3MT 14458 (rs11191439) TT n M 9 0,5 As tóc con (µg/g) 0 2 9 6,7 As máu con (µg/L) 0 1 AS3MT 4602 (rs7085104) GG Chỉ số n M 3 0,4 As tóc con (µg/g) 5 6 3 7,6 As máu con (µg/L) 5 7 AS3MT 5913 (rs 4917989) TT Chỉ số n M 7 0,5 As tóc con (µg/g) 5 4 7 6,7 As máu con (µg/L) 5 7 GSTO132630 (G5) (rs11509439) CC Chỉ số n M 9 0,5 As tóc con (µg/g) 7 1 9 6,7 As máu con (µg/L) 7 4 GSTO128279 (G1) (rs4925) Chỉ số CC Chỉ số SD 0,4 5 2,5 7 N 1 0 1 0 TC M 0,4 0 7,7 0 SD 0,2 7 2,1 9 N SD 0,3 5 2,4 9 N 5 1 5 1 AG M 0,5 1 6,6 3 SD 0,4 4 2,5 4 N 1 2 1 2 SD 0,4 8 2,5 6 n 2 3 2 3 TC M 0,4 6 7,0 8 SD 0,2 2 2,5 6 N SD 0,4 3 2,5 4 n TT M 0.6 1 8.8 9 SD 0,7 2 2,0 5 N 3 3 AC CC M SD Tổn g 0 100 0 100 2 2 AA M 0,6 9 5,5 2 SD 0,5 9 1,9 7 CC M 0,2 0 4,9 4 SD 0,1 3 1,4 7 TC M SD Tổn g 98 98 Tổn g 100 100 Tổn g 0 100 0 100 AA P >0,0 5 >0,0 5 P >0,0 5 <0,0 5 P >0,0 5 >0,0 5 P >0,0 5 >0,0 5 P