Tài liệu Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu bombyx mori

Luận văn thạc sĩ ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA TẰM DÂU BOMBYX MORI L. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2013 Nguyễn Thị Lan 1 Luận văn thạc sĩ ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA TẰM DÂU BOMBYX MORI L. Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình 2. TS. Đinh Nho Thái Hà Nội – Năm 2013 Nguyễn Thị Lan 2 Luận văn thạc sĩ Lời cảm ơn Trong suố t quá trình học tập và hoàn thành luận văn này , tôi đã nhận được sự hướng dẫn t ận tình, giúp đỡ quý báu của các thầy cô , các anh chị , các em, các bạn và gia đình . Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lới cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, nghiên cứu viên chính phòng Công nghệ Gen Động vật - Viện Công nghệ Sinh học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc tại phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em phòng Công nghệ Gen Động vật - Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, động viên tôi trong thời gian tôi thực tập tại đây. Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Đinh Nho Thái và các thầy cô của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã nhiệt tình giảng dạy và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thân, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc. Hà nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Lan Nguyễn Thị Lan 3 Luận văn thạc sĩ MỤC LUC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................13 1.1. Một số nét khái quát về tằm dâu .....................................................................13 1.1.1. Vị trí phân loại ..........................................................................................13 1.1.2. Nguồn gốc ................................................................................................13 1.1.3. Một số đặc điểm sinh học .........................................................................14 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất và khả năng chống chịu nóng ẩm của tằm dâu ...............................................................................................................19 1.2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa kinh tế của tằm dâu ..........................................21 1.2.1. Ý nghĩa khoa học......................................................................................21 1.2.2. Ý nghĩa kinh tế .........................................................................................21 1.3. Phương pháp truyền thống đánh giá sức sống, năng suất chất lượng tơ kén của giống tằm .........................................................................................................23 1.4. Một số kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa hình ...........................23 1.4.1. Kỹ thuật PCR............................................................................................24 1.4.2. Kỹ thuật RAPD ........................................................................................25 1.4.3. Kỹ thuật RFLP..........................................................................................26 1.4.4. Kỹ thuật AFLP .........................................................................................27 1.4.5. Kỹ thuật SSR ............................................................................................29 1.4.6. Kỹ thuật ISSR ...........................................................................................30 1.4.7. Phần mềm NTSYSpc ...............................................................................31 1.5. Tình hình nghiên cứu đa hình phân tử tằm dâu trên thế giới và ở Việt Nam .33 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...........................................................33 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .............................................................35 Nguyễn Thị Lan 4 Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................39 2.1. Vật liệu............................................................................................................39 2.1.1. Các giống tằm ...........................................................................................39 2.1.2. Mồi sử dụng..............................................................................................41 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ...................................................................41 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................43 2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số .......................................................43 2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế ......................................................45 2.2.3. Điện di trên gel Agarose ...........................................................................46 2.2.4. Phương pháp PCR – ISSR ........................................................................47 2.2.5. Xử lý số liệu ............................................................................................48 2.2.6. Phương pháp thôi gel................................................................................49 2.2.7. Tạo plasmid tách dòng .............................................................................50 2.2.8. Biến nạp sản phẩm vào E.coli DH5α .......................................................50 2.2.9. Chọn lọc và nuôi dòng tế bào có khả năng mang đoạn gen biến nạp ......51 2.2.10. Phương pháp tách chiết DNA plasmid ...................................................51 2.2.11. Cắt plasmid bằng enzym giới hạn ..........................................................52 2.2.12. Tinh sạch plasmid ...................................................................................53 2.2.13. Phương pháp xác định trình tự gen ........................................................53 2.2.14. Phương pháp thiết kế mồi.......................................................................54 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................55 3.1. Phân tích đa hình phân tử............................................................................55 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số .......................................................55 3.1.2. Phân tích đa hình phân tử của các giống tằm ...........................................57 Nguyễn Thị Lan 5 Luận văn thạc sĩ 3.1.3. Phân tích quan hệ di truyền giữa các giống tằm ......................................59 3.1.4. Xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm ............................60 3.2. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của giống ..................................................................................61 3.2.1. Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao.......................................................................................................................61 3.2.2. Khuếch đại và dòng hóa phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và độ ẩm cao .......................................................................................................62 3.2.3. Xác định trình tự liên quan tới khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao......65 3.2.4. So sánh trên ngân hàng gen và bản đồ genome tằm ................................66 3.2.5. Thiết kế mồi, tối ưu điều kiện khuếch đại phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nóng ẩm cao của tằm .........................................................................70 3.2.6. So sánh tần số khuếch đại và khảo sát mồi đặc hiệu ................................73 KẾT LUẬN ..............................................................................................................76 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................77 PHỤ LỤC Nguyễn Thị Lan 6 Luận văn thạc sĩ DANH MỤC BẢNG STT Chú thích Bảng Trang 1 Bảng 1 Ký hiệu các mẫu giống tằm trong nghiên cứu đa hình 29 2 Bảng 2 Tên và kí hiệu các giống tằm trong nghiên cứu phát 30 triển chỉ thị 3 Bảng 3 Trình tự các mồi ISSR 31 4 Bảng 4 Các trang thiết bị và dụng cụ sử dụng 32 5 Bảng 5 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 33 6 Bảng 6 Thành phần của phản ứng PCR – ISSR 37 7 Bảng 7 Chu trình PCR-ISSR 38 8 Bảng 8 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pJET 1.2 40 9 Bảng 9 Phản ứng cắt hạn chế plasmid tái tổ hợp 42 10 Bảng 10 Nồng độ và độ sạch DNA của các mẫu nghiên cứu 46 11 Bảng 11 Số phân đoạn, tỷ lệ đa hình và hệ số PIC 47 12 Bảng 12 Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống tằm 49 13 Bảng 13 Trình tự một số cặp mồi được thiết kế 61 14 Bảng 14 Thành phần của phản ứng PCR – ISSR đặc hiệu 62 15 Bảng 15 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR – ISSR đặc hiệu 62 16 Bảng 16 So sánh tần số khuếch đại của phân đoạn 1500bp khi 63 sử dụng hai loại mồi (%) 17 Bảng 17 Nguyễn Thị Lan Tần số suất hiện phân đoạn 1500bp trên các dòng tằm 7 64 Luận văn thạc sĩ DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Hình 1 Hình 1 Trứng tằm 5 2 Hình 2 Tằm dâu 6 3 Hình 3 Nhộng tằm 6 4 Hình 4 Con ngài 7 5 Hình 5 Sơ đồ phản ứng ISSR 20 6 Hình 6 7 Hình 7 Ảnh điện di sản phẩm PCR 48 8 Hình 8 Ảnh điện di sản phẩm PCR 48 9 Hình 9 Ảnh điện di sản phẩm PCR 48 10 Hình 10 Ảnh điện di sản phẩm PCR 48 11 Hình 11 Ảnh điện di sản phẩm PCR 49 12 Hình 12 Ảnh điện di sản phẩm PCR 49 13 Hình 13 Sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm 51 14 Hình 14 Ảnh điện di sản phẩm PCR 52 15 Hình 15 16 Hình 16 Ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid 53 17 Hình 17 Ảnh điện di kiểm tra kết quả biến nạp 54 Nguyễn Thị Lan Chú thích Kết quả điện di DNA tổng số của một số giống tằm dâu Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bài E.coli DH5α 8 Trang 45 53 Luận văn thạc sĩ 18 Hình 18 Ảnh điện di kết quả tinh sạch Plsamid 55 19 Hình 19 Trình tự phân đoạn 1500bp 56 20 Hình 20 So sánh trình tự phân đoạn 1500bp trên ngân hàng 57 gen 21 Hình 21 Vị trí của phân đoạn 1500 trên bản đồ Genome tằm - 60 GBrowse (chromosome) Vị trí của phân đoạn 1500 trên bản đồ Genome tằm 22 Hình 22 23 Hình 23 Ảnh điện di sản phẩm PCR 64 24 Hình 24 Ảnh điện di sản phẩm PCR 65 Nguyễn Thị Lan – Pgmap 9 60 Luận văn thạc sĩ BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT (Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành) Từ viết tắt Tiếng Anh AFLP Amplified Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn DNA được Polymorphism DNA khuyếch đại Base pair Cặp bazo Bp Tiếng Việt Chỉ thị phân tử CTPT DNA Axit đeoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid HSTĐDT Hệ số tương đồng di truyền Inter simple sequence repeat Trình tự các đoạn lặp lại đơn giản Kb Kilo base 1000 cặp bazơ LB Luria-Bertani OD Optical Density Giá trị mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ ISSR polymerase PĐ, PDĐH RAPD RFLP Phân đoạn, Phân đoạn đa hình Random Amplified Đa hình các đoạn DNA được khuếch đại Polymorphism DNA ngẫu nhiên Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt Polymorphism DNA ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic SSRs Simple Sequence Repeats Khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản TLĐH Tỷ lệ đa hình TSPĐ Tổng số PĐ được nhân lên với mồi đó TAE Tris - Acetic acid - Ethylen Diamin Tetra Acetic Nguyễn Thị Lan 10 Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Trồng dâu nuôi tằm, ươm tơ dệt lụa là một trong những nghề được duy trì và phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Theo một số tài liệu, nghề trồng dâu nuôi tằm xuất hiện sớm nhất ở Trung Quốc, sau đó mới được phát triển và lan rộng đến các vùng khác như Nhật, Nga, Hàn Quốc, Ấn Độ... Ở Việt Nam, nghề nuôi tằm được du nhập vào từ khoảng 1200 năm trước và cho đến nay vẫn được duy trì, phát triển tại nhiều địa phương. Đây là một trong những nghề có thể giúp để xoá đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho người lao động ở vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa nên đã được quan tâm đầu tư. Bên cạnh sản phẩm chính là tơ lụa có nhiều đặc tính quý mà không một loại sợi nào có thể sánh được thì những giá trị và lợi ích từ tằm ngày càng được con người phát hiện và sử dụng nhiều hơn. Nhu cầu của thị trường về các sản phẩm tơ tằm không ngừng tăng lên đòi hỏi ngành dâu tằm phải có các biện pháp để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm [21], [44]. Tuy nhiên cho đến nay, vấn đề giống tằm năng suất chất lượng tơ kén tốt, có khả năng chống chịu với nhiệt độ và ẩm độ cao đang rất cấp thiết do việc chọn tạo giống tằm trong nước chủ yếu vẫn thực hiện theo phương pháp truyền thống, việc đánh giá giống, lựa chọn bố mẹ trong cặp lai mới chỉ dựa vào kiểu hình và đặc điểm sinh học nên tốn nhiều thời gian mà kết quả đạt được chưa như mong đợi. Trứng giống tằm trong nước đang bị cạnh tranh mạnh với loại trứng nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm các kỹ thuật hỗ trợ để đánh giá nhanh và chính xác giống theo các chỉ tiêu kinh tế đang rất được quan tâm. Trong những năm gần đây, sử dụng chỉ thị phân tử DNA để phân tích di truyền các giống vật nuôi, cây trồng đã trở thành một hướng nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phục vụ đời sống con người. Trong tạo giống, người ta đã tiến hành chọn lọc dưới sự trợ giúp của chỉ thị phân tử. Các kỹ thuật này ngày càng trở thành công cụ đắc lực hỗ trợ phương pháp truyền thống trong việc chọn tạo giống, cho phép các nhà tạo giống nhận dạng chính xác các gen quan tâm từ bất cứ bộ phận nào của vật nuôi và cây trồng ở giai đoạn sớm mà ít bị ảnh hưởng bởi điều kiện tự nhiên và thời gian lại rút ngắn nên tiết kiệm kinh phí. Đã có những giống vật nuôi và cây trồng được chọn tạo bằng phương pháp này . Nguyễn Thị Lan 11 Luận văn thạc sĩ Ở một số nước có ngành dâu tằm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Liên Xô cũ, Hàn Quốc...đã có những công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền phân tử giống tằm. Các thông tin di truyền phân tử đã trợ giúp cho công tác giống để phát triển tập đoàn dòng thuần, tìm hiểu ưu thế lai, xác định các cặp lai ưu tú [52]. Sử dụng chỉ thị phân tử để phân loại, nhận dạng và chọn lọc giống theo các tính trạng kinh tế. Bản đồ gen tằm đã được các nhà khoa học Nhật Bản, Trung Quốc… xây dựng và một số gen liên quan đến năng suất, chất lượng tơ kén đã được nghiên cứu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu còn hướng vào việc tìm kiếm các chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng kinh tế của giống để phát triển thành markers phân tử đánh giá giống. Những công trình này đã góp phần đáng kể cho công tác tạo giống tằm và có những thành công hơn so với các phương pháp truyền thống. Ở nước ta, trong thời gian qua hướng nghiên cứu này đang ở giai đoạn khởi đầu và là vấn đề cấp thiết. Các công bố hiện tập trung vào nghiên cứu đa dạng phân tử giống tằm Việt Nam, xác định quan hệ di truyền, tìm hiểu ưu thế lai. Việc phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến việc đánh giá giống nhằm nâng cao hiệu quả chọn tạo giống tằm cao sản và có khả năng chịu nóng ẩm cao đang mang tính thời sự. Từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu Bombyx mori L.”. Công trình được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học. Mục tiêu: Tìm kiếm chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu Bombyx mori L. Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu đa hình phân tử của các giống tằm.  Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu. Nguyễn Thị Lan 12 Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số nét khái quát về tằm dâu 1.1.1. Vị trí phân loại Ban đầu, tằm dâu có tên là Phalaena mori. Đến năm 1758 Linnaeus xếp loài tằm này vào bảng hệ thống phân loại với tên khoa học là Bombyx mori L. Hệ thống phân loại của tằm dâu như sau [12]: Giới: Aminalia Ngành: Arthropoda Phân ngành: Hexapodas Lớp: Insecta Bộ: Lepidoptera Bộ phụ: Heterocera Họ: Bombycidae Giống: Bombyx Loài: mori 1.1.2. Nguồn gốc Tằm dâu vốn là một trong những loài côn trùng hoang dại , được con người nuôi dưỡng, khai thác và thuầ n hoá từ rấ t sớm . Theo những nghiên cứu phát sinh chủng loại dựa trên cơ sở sự lai khác loài và so sánh cấu trúc gen đã cho thấy tằm nhà ngày nay có quan hệ gần gũi với tằm dại (Bombyx mandarina). Nghiên cứu tế bào học trên những con lai khác loài giữa Bombyx mandarina và Bombyx mori L thì thấy sự hình thành thể tam trị, điều này chỉ ra rằng có thể 1 nhiễm sắc thể của Bombyx mandarina đã bị tách làm đôi trong quá trình thuần hoá tằm dại thành tằm nhà với nhiều đặc tính tốt hơn, quý hơn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người về năng suất và chất lượng tơ kén [44]. Nguyễn Thị Lan 13 Luận văn thạc sĩ 1.1.3. Một số đặc điểm sinh học Vòng đời của tằm dâu: Tằm dâu là loài côn trùng biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn phát dục: Trứng, tằm, nhộng, ngài [12]. Vòng đời có thể biến động dài, ngắn phụ thuộc vào điều kiện sống và kỹ thuật chăm sóc. Thời gian của một vòn dâu như sau [21]: Các thời kỳ Giống lưỡng hệ (ngày) Giống đa hệ (ngày) Trứng 10-11 9-10 Tằm 25-26 20-22 Nhộng (kén) 10-11 9-10 Ngài 5-8 3-6 Tổng số 50-56 41-48 Giai đoạn trứng: Trứng tằm có hình elip, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng là 1,2-1,3 (Hình 1). Kích thước và trọng lượng trứng thay đổi tuỳ thuộc vào giống tằm, điều kiện nuôi dưỡng, điều kiện bảo quản nhộng, ngài và thứ tự ngày đẻ trứng. Trứng tằm độc hệ lớn nhất, sau đến là trứng lưỡng hệ, trứng tằm đa hệ là bé nhất. Nhìn chung, trọng lượng 1000 trứng của một số giống tằm như sau [12]: - Giống độc hệ châu Âu: 0,75-0,85g. - Giống lưỡng hệ Trung Quốc, Nhật Bản: 0,6-0,75g. - Giống đa hệ Việt Nam, Ấn Độ: 0,4-0,45g. Trên mặt trứng có nhiều lỗ khí. Màu sắc trứng thay đổi theo giống tằm và thời gian phát dục. Đối với trứng tằm đa hệ thì sau khi con cái đẻ trứng 8-10 ngày, ở 25°C trứng sẽ nở thành tằm con. Đối với trứng tằm lưỡng hệ và độc hệ thì sau khi đẻ trứng sẽ đi vào trạng thái ngủ nghỉ và bắt buộc trứng phải qua lạnh, đây là đặc tính di truyền của tằm lưỡng hệ và độc hệ được hình thành trong điều kiện giá lạnh của Nguyễn Thị Lan 14 Luận văn thạc sĩ vùng ôn đới. Sau 4-5 tháng lạnh của mùa đông thì trạng thái ngủ nghỉ (hay còn được gọi là hưu miên) bị phá vỡ và trứng được nở ra tằm con. Người ta đã lợi dụng đặc tính này của trứng tằm để bảo quản trứng lâu dài, đi với nó là các phương pháp đánh thức ngủ nghỉ bằng các biện pháp nhân tạo [12]. Hình 1. Trứng tằm Giai đoạn tằm: Là giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng, con tằm ăn lá dâu và lớn lên với tốc độ nhanh, tằm sắp chín (đủ dinh dưỡng) lớn gấp 8.000-10.000 lần so với tằm mới nở [21]. Tằm mới nở có màu nâu đậm hoặc màu đen, toàn thân phủ một lớp lông gai nhỏ và mịn. Sau lần lột xác thứ nhất, lớp lông gai được trút bỏ, từ tuổi 2 da tằm trở nên trơn và màu sắc nhạt dần (Hình 2). Toàn bộ cơ thể tằm có hình trụ thuôn dài, chia làm 3 phần: Đầu, ngực và bụng. Phần ngực với 3 đốt ngực và 3 đôi chân ngực, phần bụng gồm 10 đốt với 4 đôi chân bụng và 1 đôi chân đuôi. Dọc 2 bên sườn của các đốt bụng và ngực, mỗi đốt có một đôi lỗ thở [12]. Nguyễn Thị Lan 15 Luận văn thạc sĩ Hình 2. Tằm dâu Giai đoạn nhộng: Nhộng tằm dâu thuộc loại nhộng màng. Nhộng có hình bầu dục dài, hơi thuôn về phía đuôi. Khi mới hoá nhộng có màu trắng, sau chuyển dần sang màu vàng nhạt, vàng sẫm và nâu xám (Hình 3). Khi nhộng có màu nâu xám là lúc sắp vũ hoá thành ngài. Hình 3. Nhộng tằm Giữa nhộng đực và nhộng cái có sự khác biệt tương đối rõ rệt về hình thái. Nhộng đực nhỏ hơn nhộng cái, đuôi nhọn và các đốt đuôi sít nhau. Ở giữa mặt bụng của đốt bụng thứ 9 có một chấm nhỏ. Nhộng cái lớn hơn, đuôi tù, các đốt bụng lớn, khoảng cách giữa các đốt dài, ở mặt bụng của đốt bụng thứ 8 có một ngấn hình chữ X [12]. Tằm nhả tơ kết kén xong thì hoá nhộng. Thời gian từ tằm chín - nhộng ngài thông thường 9 - 12 ngày. Nhộng già thì hoá thành ngài và cắn vỏ kén chui ra ngoài [21]. Nguyễn Thị Lan 16 Luận văn thạc sĩ Giai đoạn ngài: Ngài tằm dâu vũ hoá từ nhộng nhưng không có khả năng bay vì đã được thuần hoá. Toàn bộ cơ thể ngài chia làm 3 phần (Hình 4): Đầu, ngực và bụng. Đầu có mắt kép và râu đầu, râu đầu ngài tằm có dạng kép lông chim. Ngực có 3 đốt với 3 đôi chân ngực và 2 đôi cánh. Trừ màng ngăn giữa các đốt còn lại toàn bộ bề mặt cơ thể ngài và cánh ngài được phủ những phiến vảy [12]. Giai đoạn ngài thường kéo dài khoảng 5 – 7 ngày, ngài đực và ngài cái tìm nhau để giao phối. Sau khi kết đôi, ngài cái sẽ đẻ khoảng 300 – 700 trứng tuỳ thuộc vào giống tằm. Ngài là giai đoạn kết thúc một thế hệ tằm dâu. Hình 4. Con ngài Hệ tính và tính ngủ Hai đặc tính này thể hiện rõ sự thích nghi của tằm đối với môi trường. * Hệ tính (voltinism): Là khái niệm chỉ số thế hệ trải qua trong một năm của một giống tằm. Hệ tính phụ thuộc vào giống tằm và các điều kiện môi trường như ánh sáng, độ ẩm, độ thoáng khí… đặc biệt là nhiệt độ [12]. Theo cách phân loại này người ta chia tằm dâu ra làm 3 loại: Tằm độc hệ, tằm lưỡng hệ, tằm đa hệ. + Giống tằm độc hệ (univoltine): Là những giống tằm chỉ sinh ra một thế hệ trong một năm. Trứng thường nở vào mùa xuân. Sau khi nuôi tằm kết thúc đời thứ nhất, sinh ra trứng đời 2 thì trứng này đi vào nghỉ đông đến mùa xuân năm sau mới Nguyễn Thị Lan 17 Luận văn thạc sĩ nở [12]. Giố ng tằ m này đư ợc nuôi phổ biế n ở vùng ôn đới giá la ̣nh , ẩm độ thấp : Châu Âu, Bắ c Trung Quố c…cho năng suấ t kén cao , trọng lượng bình quân kén từ 1,8-2g, chiề u dài sơ ̣i tơ trung bình 1000-1500m, tỉ lệ vỏ kén trên 30% [44]. + Giống lƣỡng hệ (bivoltine): Là những giống tằm trải qua 2 thế hệ trong một năm. Trứng đời thứ nhất nở vào mùa xuân, sau khi nuôi tằm kết thúc đời thứ nhất đẻ ra trứng đời 2 thì trứng này không nghỉ đông mà nở bình thường. Sau 10 – 12 ngày trứng nở, tiếp tục nuôi tằm kết thúc đời thứ 2, sinh ra trứng đời thứ 3 thì trứng này có nghỉ đông và chỉ nở vào mùa xuân năm sau [12]. Thời gian ngủ nghỉ 120 ngày, chiều dài tơ đơn 800 - 1000m, trọng lượng trung bình của kén 1,4 - 1,6g. Tằm lưỡng hệ có phạm vi thích ứng, sức sống tốt và khả năng chịu nóng cao hơn tằm độc hệ nhưng không bằng tằm đa hệ [44]. + Giống đa hệ (multivoltine): Là những giống tằm sinh ra nhiều hơn 2 thế hệ trong một năm. Trứng không nghỉ đông, đời này phát triển kế tiếp đời kia liên tục, một năm có thể trải qua 7- 8 thế hệ. Tằm đa hệ được nuôi chủ yếu ở vùng nhiệt đới như Việt Nam, Lào, Trung Quốc... [12]. Tằm đa hệ cho năng suấ t kén thấ p , chiều dài tơ đơn ngắn 400 - 500 m, trọng lượng bình quân của kén 1,0g - 1,2g [44]. * Tính ngủ (Diapause): Trong pha tằm, từ khi nở ra đến lúc nhả tơ kết kén, tằm trải qua một số lần lột xác. Ở mỗi tuổi tằm, sau khi đã đồng hoá thức ăn và đạt được sự tăng trưởng tối đa của tuổi đó, lúc này da tằm đã căng hết cỡ và không còn khả năng lớn thêm về thể tích, tằm mất dần sự thèm ăn, lượng dâu ăn ít dần rồi tiến đến ngừng ăn, chuẩn bị cho quá trình lột xác gọi là tằm ngủ. Tằm thường trải qua 4 lần ngủ ứng với 5 tuổi. Nhưng cũng có một số giống ngủ 3 lần và một số giống ngủ 5 lần [12]. Tằm chuẩn bị ngủ, da dần căng bóng, ăn ít lá dâu. Tằm ngủ, ngừng ăn, ít động đậy, đầu ngẩng cao, sau 20-24 giờ tuỳ theo mùa, tằm lột xác chuyển sang tuổi sau gọi là tằm dậy. Thời gian ngủ ở các tuổi từ 15-30 giờ tuỳ theo giống tằm và điều kiện sinh thái. Thời gian ngủ tuổi 2 là ngắn nhất sau đó đến tuổi 1, tuổi 3 và tuổi 4 [12]. Nguyễn Thị Lan 18 Luận văn thạc sĩ Tằm chín: Ở tuổi 5, khi tằm đạt được sự tăng trưởng tối đa, trọng lượng cơ thể tằm tăng 9000-10.000 lần so với lúc tằm mới nở. Tằm ngừng ăn dâu và chuẩn bị cho quá trình nhả tơ kết kén gọi là tằm chín. Thời gian tuổi 5 kéo dài 5-6 ngày đối với giống đa hệ và 7-9 ngày đối với giống lưỡng hệ và độc hệ. Biểu hiện của tằm chín là: Tằm ngừng ăn lá dâu, thải phân mềm, ướt, thân tằm căng bóng (như lúc ngủ ở các tuổi trước) và trở nên trong suốt, có màu trắng trong đối với giống kén trắng và màu vàng ươm đối với giống kén vàng. Đầu tằm ngẩng cao, lắc qua lắc lại bên phải bên trái theo động tác nhả tơ, tằm thường có xu hướng bò tản ra xung quanh để tìm vị trí nhả tơ [12]. Thức ăn của tằm dâu Thức ăn chủ yếu của tằm dâu là lá dâu có tên khoa học là Morus alba. Tuy nhiên chúng cũng có thể ăn lá của bất kỳ cây nào thuộc chi dâu tằm (như Morus rubra hay Morus negra) [12], [8]. Protein trong lá dâu là nguồn vật chất để con tằm tổng hợp nên sợi tơ, gần 70% protein trong thành phần sợi tơ được tổng hợp trực tiếp từ protein trong lá dâu [12]. Ngoài ra, trong lá dâu có chứa chất dẫn dụ có thể lôi cuốn tằm, chất vị giác kích thích hành vi nhai của tằm, chất nuốt trôi giúp tằm nuốt lá dâu. Chất dẫn dụ này có mùi vị đặc trưng riêng biệt, lôi cuốn tằm đến ăn. Do vậy mà loài côn trùng này không ăn những lá cây khác [8]. 1.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng chịu nóng ẩm của tằm dâu  Nhiệt độ Tằm dâu là loài côn trùng biến nhiệt vì vậy nhiệt độ tác động trực tiếp tới mọi hoạt động sinh lý của tằm. Tằm có thể phát dục được trong khoảng nhiệt độ 7,5 – 370C. Trong đó nhiệt độ thích hợp nhất cho phát dục của tằm là 20 – 300C. Trong phạm vi nhiệt độ này, khi nhiệt độ càng tăng thì quá trình sinh trưởng phát dục của tằm càng tăng [12]. Đảm bảo nhiệt độ thích hợp tương đối cho tằm là biện pháp quan trọng để có lứa tằm năng suất chất lượng cao [21]. Nguyễn Thị Lan 19 Luận văn thạc sĩ Khả năng thích nghi với điều kiện nhiệt độ thay đổi tuỳ thuộc vào giống tằm, tuổi tằm và điều kiện nuôi dưỡng. Các giống tằm đa hệ thích hợp với nhiệt độ cao hơn các giống lưỡng hệ và độc hệ, giống tằm lai thích hợp với nhiệt độ cao hơn giống nguyên 10C-20C. Tằm con thích hợp với nhiệt độ cao hơn tằm lớn. Nuôi tằm ở điều kiện ẩm độ cao, thông gió cần nhiệt độ thấp hơn [12].  Độ ẩm Độ ẩm tác động tới sinh trưởng, phát dục của tằm thông qua tác động trực tiếp và tác động gián tiếp [12]. - Tác động trực tiếp: Ẩm độ ảnh hưởng tới mọi hoạt động sinh lý của tằm như tiêu hoá, tuần hoàn, trao đổi chất … [12] - Tác động gián tiếp: Ẩm độ quá cao là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển, tăng nguy cơ phát sinh bệnh cho tằm. Ẩm độ quá thấp sẽ làm lá dâu chóng héo, tằm ăn đói, cơ thể thoát hơi nước nhiều dẫn đến chóng suy nhược là môi trường thuận lợi cho bệnh vi khuẩn phát triển [21].  Không khí Cũng như các động vật khác, tằm cần có không khí trong lành để thực hiện các chức năng sinh lý. Trong phòng nuôi tằm, ngoài các thành phần khí O2 và CO2 còn tồn tại thêm một số loại khí khác như CO, NH3, SO2… sản sinh ra do quá trình đốt than tăng nhiệt trong phòng tằm hay do sự lên men của phân tằm... Những khí này không có lợi cho quá trình sinh trưởng phát dục của tằm. Do vậy yêu cầu không khí trong phòng tằm thường phải đảm bảo: CO2≤1,5%; CO ≤0,5%; SO2 ≤0,02% [12].  Gió Gió có tác dụng 2 mặt đối với tằm: + Tác dụng tốt: Phát tán hơi nước điều hoà thân nhiệt cho tằm, bài trừ khí độc ra khỏi phòng tằm, điều hoà nhiệt, ẩm độ trong phòng tằm. Nguyễn Thị Lan 20