Tài liệu Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cho loài lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) trong giai đoạn vườn ươm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- LỤC MINH CHÂU Tên đề tài: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CHO LOÀI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) TRONG GIAI ĐOẠN VƢỜN ƢƠM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Lâm Nghiệp Khoa : Lâm Nghiệp Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- LỤC MINH CHÂU Tên đề tài: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CHO LOÀI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) TRONG GIAI ĐOẠN VƢỜN ƢƠM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Lâm Nghiệp Lớp : K44-LN Khoa : Lâm Nghiệp Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Trần Thị Thu Hà Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không sao chép. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Một lần nữa, tôi xin khẳng định về sự trung thực của lời cam kết trên. Thái Nguyên, tháng 06 năm 2016 Xác nhận của giáo viên hƣớng dẫn Ngƣời viết cam đoan Đồng ý cho bảo vệ kết quả trƣớc Hội đồng khoa học PGS TS. Trần Thị Thu Hà Lục Minh Châu Xác nhận của giáo viên chấm phản biện Giáo viên chấm phản biện xác nhận sinh viên đã sửa sai sót sau khi hội đồng chấm yêu cầu. (ký, ghi rõ họ tên) ii LỜI CẢM ƠN Đƣợc sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trƣờng, Ban chủ nhiệm khoa Lâm Nghiệp em đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cho loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) trong giai đoạn vườn ươm’’. Qua thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu và Phát triển Lâm Nghiêp đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, Ban chủ nhiệm khoa Lâm Nghiệp cùng với các thầy cô trong khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giảng viên PGS.TS. Trần Thị Thu Hà đã tận tình hƣớng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ qúy báu của cán bộ Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên và giúp đỡ tạo điều kiện về mặt vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Mặc dù bản thân đã rất cố gắng nhƣng đề tài của em không thể tránh những thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc sự đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em đƣợc hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn. Thái Nguyên, ngày…… tháng…… năm…2016. Sinh viên thực hiện Lục Minh Châu iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii MỤC LỤC .................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ................................................................... vii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ..................................................... viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1 1.2.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................ 2 1.3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài.................................................................................... 3 1.4.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học ..................................... 3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................. 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 2.1. Giới thiệu chung về cây Lan kim tuyến ................................................... 4 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại ......................................................................... 4 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài cây Lan kim tuyến ............................... 5 2.1.3. Đặc điểm phân bố ................................................................................. 6 2.1.4. Tình hình nghiên cứu về cây Lan kim tuyến trong nƣớc và trên thế giới ....................................................................................................... 7 2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật .............. 11 2.2.1. Khái niệm ........................................................................................... 11 2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 11 2.2.3. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy ....................................................... 13 2.3. Phƣơng pháp nhân giống in vitro cây Lan kim tuyến ............................. 14 iv 2.3.1. Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy ....................................................... 14 2.3.2. Tái sinh mẫu ....................................................................................... 14 2.3.3. Nhân giống ........................................................................................ 14 2.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh in vitro ............................................................... 15 2.3.5. Chuyển cây ra vƣờn ƣơm.................................................................... 15 2.4. Giá thể cho cây con giai đoạn sau in vitro ............................................. 15 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG , NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................. 17 3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 17 3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 17 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 17 3. 2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .......................................... 17 3.3. Trang thiết bị, dụng cụ ........................................................................... 17 3.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 17 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 18 3.5.1. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 18 3.5.2. Phƣơng pháp xử lý giá thể .................................................................. 20 3.5.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 21 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 22 4.1. Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng sau giai đoạn in vitro........................................................ 22 4.2. Ảnh hƣởng giá thể đối với tỷ lệ sống và khả năng sinh trƣởng của cây con sau giai đoạn in vitro ............................................................. 24 4.3. Ảnh hƣởng của chế độ dinh dƣỡng và chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro.............................................. 28 4.3.1.Ảnh hƣởng của phân bón đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây sau giai đoạn in vitro .............................................................. 29 v 4.3.2. Ảnh hƣởng của chế độ bón phân đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây sau giai đoạn in vitro .............................................. 31 4.4. Nghiên cứu cƣờng độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vƣờn ƣơm............................................................................ 32 4.5. Ảnh hƣởng sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến giai đoạn vƣờn ƣơm .................................................................................................... 34 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................... 36 5.1. Kết luận ................................................................................................. 36 5.2. Đề nghị .................................................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1. Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng sau giai đoạn in vitro ........................................... 22 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hƣởng của giá thể đến tỉ lệ cây sống của cây sau trồng 60 ngày .............................................................................. 24 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hƣởng của giá thể đến sinh trƣởng và phát triển của cây sau trồng 60 ngày ........................................................... 26 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của chế độ dinh dƣỡng đến sinh trƣởng cây con trên các giá thể khác nhau sau in vitro (sau 30 ngày) .................. 29 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro (sau 30 ngày) ................................... 31 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu cƣờng độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vƣờn ƣơm (sau 30 ngày) ...................... 33 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu một số sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến trên các giá thể giai đoạn vƣờn ƣơm.................................. 34 Comment [N1]: Xem lai tên các bảng biểu đầy đủ vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 4.1. Biểu đồ ảnh hƣởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng sau giai đoạn in vitro ................................. 23 Hình 4.2. Cây Lan kim tuyến giai đoạn cảm ứng ánh sáng 14 ngày .............. 24 Hình 4.3. Lan kim tuyến trồng trên giá thể đất ............................................. 27 Hình 4.4. Lan kim tuyến trồng trên giá thể xơ dừa ....................................... 27 Hình 4.5. Lan kim tuyến trồng trên giá thể xở dừa+than củi+đất .................. 28 Hình 4.6. Lan kim tuyến trồng trên giá thể xơ dừa+bột dớn+đất .................. 28 Hình 4.7. Ảnh cây Lan kim tuyến trồng trên giá thể đất + phân ủ hoai + mùn cƣa ủ hoai ............................................................................. 28 Hình 4.8. Biểu đồ ảnh hƣởng của chế độ dinh dƣỡng đến sinh trƣởng cây con trên các giá thể khác nhau sau in vitro ............................. 29 Hình 4.9. Cây Lan kim tuyến không phun dinh dƣỡng ................................. 30 Hình 4.10. Cây Lan kim tuyến phun phân đầu trâu 501 ............................... 30 Hình 4.11. Cây Lan kim tuyến phun phân NPK............................................ 30 Hình 4.12. Cây Lan kim tuyến phun dung dịch MS/2 ................................... 30 Hình 4.13. Biểu đồ kết quả nghiên cứu chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro .............................................. 31 Hình 4.14. Ảnh cây Lan Kim tuyến chu kỳ bón phân 7 ngày và 28 ngày...... 32 Hình 4.15. Biểu đồ Kết quả nghiên cứu cƣờng độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vƣờn ƣơm ................................. 33 Hình 4.16. Cây Lan kim tuyến bị bệnh nấm và thối thân .............................. 34 viii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic NAA : α – Naphlene axetic acid CT : Công thức NL : Nhắc lại SN : Số nhánh H : Chiều cao MS : Murashige and Skoong’s 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), phân bố ở một số tỉnh miền núi Phía Bắc Việt Nam, Phía nam Trung Quốc và quần đảo Nam Thái Bình Dƣơng dƣới các tán rừng ẩm với độ cao 500 – 1.600 m. Lan kim tuyến đƣợc biết đến nhƣ một thảo dƣợc quý có thể chữa đƣợc nhiều bệnh và còn tăng cƣờng sức khỏe con ngƣời. Theo y học cổ truyền Trung Hoa, Lan kim tuyến đƣợc dùng để điều trị bệnh tiểu đƣờng, làm tan khối u, giảm lipase trong máu và chữa viêm gan. Nghiên cứu về Trung y tuyên bố năm 1924: toàn thân cây thuốc đƣợc dùng để tăng cƣờng sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thƣơng do rắn cắn; ngoài ra Lan kim tuyến còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt [12]. Ngày nay, Y học hiện đại đã phân tích và xác định đƣợc Lan kim tuyến chứa các thành phần hoạt chất có dƣợc tính cực kì quan trọng bao gồm: Flavonoid, steroid, trierpenoids, acid amin và các loại khoáng đa vi lƣợng khác..có thể chữa các bệnh nhƣ: trị lao phổi, ho do viêm phế quản, chấn thƣơng, viêm dạ dày mãn tính, suy nhƣợc thần kinh, làm khí huyết lƣu thông, kháng khuẩn, đau bụng, đau ngực, viêm thận, sốt cao, đắp vết thƣơng do bị rắn cắn… [12], [17]. Lan kim tuyến không chỉ là nguồn thảo dƣợc quý mà còn có giá kinh tế cao. Vì vậy loài cây này đã bị khai thác quá mức và đang có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên. Hiện nay, Lan kim tuyến đƣợc đƣa vào danh mục các loài đang nguy cấp thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thƣơng mại và đƣợc xếp vào nhóm thực vật rừng đang nguy cấp (EN A1 a,c,d) trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [2], [3]. 2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã nghiên cứu thành công nhân giống in vitro Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Để hoàn thiện đƣợc quy trình nhân giống cây Lan kim tuyến thì vấn đề chọn giá thể cho cây con sinh trƣởng và phát triển tốt giai đoạn sau nuôi cấy in vitro là rất quan trọng. Trên cơ sở đó tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cho loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) trong giai đoạn vườn ươm’’.tại Viện Nghiên cứu và Phát triển lâm nghiêp – Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên. 1.2. Mục đích và mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục đích nghiên cứu Xác định đƣợc ảnh hƣởng của giá thể, liều lƣợng dinh dƣỡng, cƣờng độ ánh sáng, một số sâu bệnh hại cho cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) giai đoạn sau in vitro để hoàn thiện quy trình nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào góp phầ n bảo tồn và phát triển loài Lan kim tuyến. 1.3. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đảm bảo cây có tỷ lệ sống cao và sinh trƣởng tốt sau giai đoạn in vitro. - Xác định đƣợc giá thể thích hợp cho cây con sau giai đoạn in vitro với tỉ lệ cây sống cao, sinh trƣởng tốt và phát triển tốt. - Xác định chế độ dinh dƣỡng và chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro. - Xác định cƣờng độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vƣờn ƣơm. - Xác định ảnh hƣởng của một số sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến trong quá trình sinh trƣởng và phát triển giai đoạn vƣờn ƣơm. 3 1.4. Ý nghĩa của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp hoàn thiện đƣợc quy trình nhân giống Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Giúp sinh viên củng cố lại những kiến thức đã học , có điều kiện ứng dụng các kiến thức đã học vào thực tiễn sản xuất . Tƣ̀ đó giúp sinh viên trau dồ i, tích lũy đƣợc kiến thức thông qua thực tiễn. - Biết đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài bƣớc đầu đã đề xuất đƣợc một số kỹ thuật trồng và chăm sóc cây Lan kim tuyến trong giai đoạn vƣờn ƣơm góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây lan kim tuyến. Lựa chọn đƣợc giá thể thích hợp sẽ rút ngắn thời gian sản xuất cây giống trong giai đoạn vƣờn ƣơm, giảm chi phí, hạ giá thành cây giống. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Lan kim tuyến 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1. Nguồn gốc Lan (Orchidologia) bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp cổ đại. Theo Phrastus (370-285 trƣớc công nguyên) là ngƣời đầu tiên dùng danh từ orchis trong tác phẩn “Nghiên cứu về thực vật” để chỉ một loài lan [11]. Lobelius (1539-1616) trong nghiên cứu về thực vật và đã nêu ra những nhận xét về cây cỏ và xếp thành các họ đơn giản trong đó có họ lan [11]. Đến năm 1753, Linnaeus đã dùng danh từ orchis trong cuốn thảo mộc Specles Platarum để chỉ các loài lan. Năm 1836, John Lindely dùng danh từ orchis dịch danh chung cho các loài lan. Còn chữ orchis dùng để chỉ một loài địa lan ở Châu Âu [11]. Ngày nay, các loài lan đã đƣợc xếp thành một họ trong hệ thống phân loại chung gọi là Orchidaceae, lan rừng đã xác định đƣợc khoảng 750 giống và hơn 25.000 loài và có hơn 30.000 loài lan lai (Phan Thúc Huân), 2005, [5]. 2.1.1.2. Phân loại Theo hệ thống thực vật lan Kim Tuyến đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới (regnum) : Plantae Ngành (Phylum) : Magnoliophyta Lớp (Class) : Liliospida Bộ (ordo) : Asparagales Họ (Family) : Orchidaceae Chi (genus) : Anoectochilus Loài (species) : roxburghii 5 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài cây Lan kim tuyến 2.1.2.1. Đặc điểm nhận dạng Lan kim tuyến thuộc cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài trên mặt đất mọng nƣớc và có nhiều long mềm, mang 2-4 lá mọc xòe sát mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và mũi ngắn, cỡ 3-4 x 2-3cm, có màu khác nhau với dạng gân thƣờng nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu đỏ với màu gân màu vàng lục hay hông) cuống lá dài 23cm [2]. 2.1.2.2. Đặc điểm thân rễ Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12cm, trung bình là 7,87cm. Đƣờng kính thân rễ từ 3-4mm, trung bình là 3,17mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6cm, trung bình là 1,99cm. Thân rễ thƣờng có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thƣờng nhẵn, không phủ lông [6]. 2.1.2.3. Đặc điểm của rễ Rễ đƣợc mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng đƣợc hình thành từ thân khí sinh. Rễ thƣờng đâm thẳng xuống đất. Thông thƣờng mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng đƣợc hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lƣợng và kích thƣớc rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thƣờng từ 3-10 rễ, trung bình là 5,4 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-8cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82cm [6]. 2.1.2.4. Đặc điểm của lá Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thƣờng dài từ 3-4cm, trung bình là 4,03cm và rộng từ 2-3cm, trung bình là 3,12cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên 6 và phủ lông mịn nhƣ nhung. Hệ gân lá mạng lƣới lông chim, thƣờng có 5 gân gốc. Các gân này thƣờng có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dƣới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dƣới không rõ. Cuống lá dài 0,6-1,2cm, thƣờng nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2-6, thông thƣờng có 4 lá. Kích thƣớc của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thƣờng có kích thƣớc khác nhau rõ rệt [6]. 2.1.2.5. Đặc điểm của hoa Cụm hoa dài 10-15cm, mang 4-10 hoa mọc thƣa. Lá bắc hình trứng, hoa thƣờng màu trắng, dài 2,5-3cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm, môi dài 1,5cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7mm, bầu dài 1,3cm màu lục có nhiều lông mềm [2], [6]. 2.1.3. Đặc điểm phân bố Lan kim tuyến thƣờng mọc ở dƣới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm thƣờng xanh, nhiệt đới, trên sƣờn núi đá granit, riclit, phiến sét, ở độ cao 500-1600m rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm rất giàu mùn và lá cây rụng [2]. Ở Việt Nam, Lan kim kuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm: Lào Cai (Sa Pa, Liêm Phá), Hà Tĩnh, Quảng Trị, Kom Tum, Lâm Đồng, Đắk Lăk. Trên thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan, Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [2]. Chi lan Anoectochilus có khoảng 30-40 loài phổ biến rộng khắp các vùng nhiệt đới từ Ấn Độ thông qua dãy Hymalaya tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và một số đảo ở Thái Bình Dƣơng bao gồm cả Đài Loan [2]. 7 2.1.4. Tình hình nghiên cứu về cây Lan kim tuyến trong nước và trên thế giới 2.1.4.1. Tình hình nghiên cứu về cây Lan kim tuyến trong nước Hiện nay, việc áp dụng Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong công tác nhân giống cây trồng nông - lâm nghiệp, cây dƣợc liệu, cây cảnh ngày càng rộng rãi và đã thành công ở một số loài. Đối với các loài cây thuốc, cây cảnh thuộc họ Lan việc áp dụng công nghệ nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào nhằm tạo ra số lƣợng cây lớn có đặc điểm di truyền tốt đang đƣợc các nhà nghiên cứu và sản xuất quan tâm. Sau đây là một số công trình nghiên cứu đã đƣợc công bố: Năm 2003, tác giả Nguyễn Quang Thạch và cộng sự ở trƣờng Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) cho thấy: Môi trƣờng thích hợp tạo vật liệu khởi đầu từ cơ quan sinh dƣỡng là VW + 100 ml/l ND + 2 mg/l IBA + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đƣờng, môi trƣờng thích hợp tạo nguồn vật liệu khởi đầu từ hạt là VW + 100 ml/l ND+ 1g/l pepton + 10g/l đƣờng + dịch nghiền khoai tây/cà rốt, môi trƣờng tốt nhất cho phát sinh protocorm từ lát mỏng tế bào là VW + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đƣờng, còn môi trƣờng VW + 100 ml/l ND + 1g/l pepton + 10 g/l đƣờng + 30g khoai tây+ 30g cà rốt là môi trƣờng tốt nhất để nhân nhanh chồi và giá thể rong biển là loại giá thể thích hợp cho việc tạo ra cây và nuôi trồng lan Hồ Điệp [9]. Năm 2005, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật sau In vitro cho cây địa lan kết quả nghiên cứu cho thấy: để đảm bảo cho cây sinh trƣởng phát triển tốt ngoài vƣờn ƣơm, cây địa lan in vitro phải đạt đƣợc khối lƣợng ≥ 1,0 gam, giá thể dớn biển thích hợp nhất để ra cây in vitro, sau 3 tháng trồng ở vƣờn ƣơm cấp I chuyển cây sang trồng ở vƣờn ƣơm cấp II với giá thể thích hợp nhất là dƣơng xỉ. 8 Tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp đã tiến hành đề tài nghiên cứu nhân giống hoa phong lan và địa lan bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Trung tâm đã xây dựng đƣợc quy trình nhân giống phong lan và địa lan, cây con đƣợc tạo ra có chất lƣợng tốt (cây mập, khoẻ, rễ phát triển rất tốt, tỷ lệ sống khi đƣa cây ra tự nhiên là 90%) [9]. Năm 2007, Nguyễn Thị Hồng Gấm và các cộng sự đã tiến hành Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea) bằng phƣơng pháp nuôi cấy trong ống nghiệm đạt kết quả tốt. Khử trùng quả lan trong 3 phút bởi cồn 70% + 5phút HgCl2 0,1%. Tỷ lệ mẫu sạch là 90%. Môi trƣờng gieo hạt tốt nhất: Knudson + 30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa +7 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin. Tỷ lệ phôi hạt nảy mầm: 100%. Môi trƣờng nhân nhanh thể chồi: Knudson + 30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA. Hệ số nhân chồi: 4,25. Thể chồi có chất lƣợng tốt, có khả năng tái sinh thành chồi tốt. Môi trƣờng tái sinh chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA. Tỷ lệ thể chồi tái sinh thành chồi: 91,67 %. Chồi có chất lƣợng tốt. Môi trƣờng kéo dài chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đƣờng + 100 g/l khoai tây + 100 ml/l nƣớc dừa + 7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA + 0,2mg/l GA3. Môi trƣờng ra rễ: Knudson cải tiến + 30g/l đƣờng +100g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa + 7 g/l agar + 0,1 mg/l NAA. Tỷ 5 lệ cây ra rễ: 93,3%. Rễ dài nhất (0,79cm sau 4 tuần và 1,43 cm sau 8 tuần) [7]. Cách huấn luyện cây: Để bình cây ở nhà kính huấn luyện trong 2 tuần, rửa sạch cây, để cây ở chỗ ẩm mát trong 5 ngày rồi mới trồng lên giá thể. Tỷ lệ cây sống: 90% sau 4 tuần, 80% sau 8 và 10 tuần trồng. Cách chăm sóc cây con sau khi trồng lên giá thể phù hợp nhất: Chậu cây con đƣợc che bằng lƣới đen giảm cƣờng độ chiếu sáng còn 20%, mỗi ngày tƣới phun sƣơng 1lần [7]. 9 Năm 2009, Phùng Văn Phê và cộng sự đã đƣa ra kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và phân bố của loài lan kim tuyến Anoectochilus setaceus ở vƣờn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc. Về hình thái, Lan kim tuyến là cây thân cỏ, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nƣớc mang 2-6 lá mọc cách. Thân khí sinh và thân rễ thƣờng nhẵn, không phủ lông, màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ. Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 1020 cm, thƣờng phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa. Mùa hoa nở tháng 10-12. Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau. Về phân bố, Lan kim tuyến tập trung ở kiểu rừng kín lá rộng thƣờng xanh, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí. Có thể gặp Lan kim tuyến ở ven các khe suối, dƣới tán rừng nơi ẩm ƣớt. Tại Vƣờn quốc gia Tam Đảo, Lan kim tuyến đƣợc phát hiện có khu phân bố hẹp và số lƣợng đang bị suy giảm rất nghiêm trọng [7]. Năm 2010, Phùng Văn Phê và cs đã chứng minh rằng thể chồi loài Lan kim tuyến - Anoectochilus roxborghii 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trƣờng Knud bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + ND 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + sucrose 20g/l + agar 7g/l + AC 0,5g/l [7]. Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs đã nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh in vitro loài Lan kim tuyến - Anoectochilus setaceus. Môi trƣờng thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là môi trƣờng Knud + BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + αNAA 0,3mg/l + sucrose 20g/l + than hoạt tính 0,5g/l + agar 7g/l cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3-4cm đƣợc sử dụng để ra rễ in vitro. Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trƣờng có bổ sung 1mg/l αNAA [9]. 10 2.1.4.2. Tình hình nghiên cứu về cây lan Kim tuyến trên thế giới Ngày nay, nghiên cứu nhân giống hữu tính các loài họ Lan bằng gieo hạt đã nhiễm nấm cộng sinh trên môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc thực hiện thành công ở nhiều nƣớc nhƣ Trung Quốc, Mỹ, Pháp. Nghiên cứu nhân giống In vitro cây họ Lan phải nói đến Knudson ngƣời Mỹ công bố năm 1946, đã mở ra công nghệ sinh học môi trƣờng Lan. Nhờ vậy đã tạo ra đƣợc khối lƣợng cây lớn đồng nhất trong thời gian ngắn. Ngày nay, nhân giống vô tính In vitro đã thành công đối với nhiều chi thuộc họ Lan (Orchidaceae) nhƣ Kiếm lan (Cymbidium), Hoàng thảo (Dendrobium), Kiều lan (Calanthe), v.v. Đối với loài Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) đƣợc tác giả Nguyễn Văn Kiệt thực hiện nghiên cứu nhân giống In vitro thành công tại Trƣờng Đại học tổng hợp Quốc gia Hàn Quốc. Đối với loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) đã đƣợc nghiên cứu chủ yếu tại Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, sinh thái, công dụng, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hoá học và tác dụng sinh học [16]. Năm 2001, Yih-Juh Shiau và cs đã tối ƣu hóa một phƣơng pháp bảo tồn Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách tiến hành thụ phấn chéo và nuôi cấy hạt nảy mầm. Thành công của thụ phấn và đậu quả đƣợc tìm thấy là phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây đực và cây cái. Số quả đậu đƣợc sau thụ phấn đạt 86,7%. Những hạt 7 tuần tuổi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng1/2 MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8% chuối trong 4 tháng. Cây nảy mầm đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng ½ MS chứa BA 2mg/l trong bình nón 125ml trong thời gian 2 tháng. Trƣớc khi tiến hành thụ phấn trong ống nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng 1/2 MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2mg/l và NAA 0,5mg/l [21].