Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 180.245...

Tài liệu NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 180.245

.PDF
59
628
100

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 180.245 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 180.245 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Vi sinh – sinh học HÀ NỘI – 2013 Lời cảm ơn Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Cao Văn Thu – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ , kỹ thuật viên đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp dược, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, khoa Hóa trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, thư viện Khoa học kỹ thuật đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy, cô giáo, cán bộ công nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do những hạn chế về thời gian, phương tiện và trình độ của bản thân, chắc chắn khóa luận này còn có nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội ngày18 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Minh Tâm Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC BỘ Y TẾ ....................................................................................................... 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI........................................................ 1 NGÔ THỊ MINH TÂM ................................................................................ 1 NGHIÊN CỨU LÊN MEN .......................................................................... 1 TỔNG HỢP KHÁNG SINH ........................................................................ 1 TỪ STREPTOMYCES 180.245 .................................................................... 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ .................................................... 1 HÀ NỘI – 2013 ............................................................................................. 1 BỘ Y TẾ ....................................................................................................... 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI........................................................ 2 NGÔ THỊ MINH TÂM ................................................................................ 2 NGHIÊN CỨU LÊN MEN .......................................................................... 2 TỔNG HỢP KHÁNG SINH ........................................................................ 2 TỪ STREPTOMYCES 180.245 .................................................................... 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ .................................................... 2 HÀ NỘI – 2013 ............................................................................................. 2 Lời cảm ơn..................................................................................................... 3 I. TỔNG QUAN............................................................................................ 2 1.1 Đại cương về kháng sinh..............................................................................2 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ..................................................................2 1.1.2 Phân loại kháng sinh .....................................................................2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh ...................................................3 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh.......................................................3 1.1.5 Giới thiệu về tính kháng kháng sinh ............................................4 1.2 Đại cương về xạ khuẩn.................................................................................4 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:................................................5 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces .....................................6 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh..................................................7 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn.......................................8 1.4.1 Mục đích ........................................................................................8 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên..................8 1.4.3 Đột biến cải tạo giống....................................................................9 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn [9,14 ] ..................................................9 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ...........................................................10 1.5.1 Khái niệm lên men ái khí ............................................................10 1.5.2 Các phương pháp lên men ..........................................................11 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men.......................11 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men...................................12 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ............................12 1.6.2 Các phương pháp chiết tách [1, 3, 9]..........................................12 1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh................................................13 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến ...............................................................13 1.7.2 Phổ hồng ngoại ............................................................................13 1.7.3 Khối phổ MS................................................................................13 1.8 Sử dụng tương tác giữa các loài để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp trong xạ khuẩn...................................................................................................14 1.9 Hoạt tính kháng khuẩn invitro của xạ khuẩn biển chống lại Staphylococcus aureus đa kháng thuốc.............................................................14 1.10 Sàng lọc, phân lập, phân loại và lên men sản xuất kháng sinh từ Streptomyces xinghaiensis có hoạt tính chống lại các chủng kháng linezolid ....15 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị.........................................................................15 2.1.1 Nguyên vật liệu ............................................................................15 2.1.2 Máy móc thiết bị..........................................................................19 2.2 Nội dung nghiên cứu .................................................................................19 2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180.245 ........................................19 2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống ........................................................................20 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu..............................................20 2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ..............20 2.3 Phương pháp thực nghiệm........................................................................20 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn..................................................20 2.3.2 Phân loại xạ khuẩn theo ISP.......................................................20 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21 2.3.4 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp ...................................22 2.3.5 Sàng lọc ngẫu nhiên.....................................................................22 2.3.6 Đột biến.......................................................................................23 2.3.7 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ...........................................24 2.3.8 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men.................25 2.3.9 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ.........25 2.3.10 Xác định độ bền của dịch chiết kháng sinh với ánh sáng ..................26 2.3.11 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng .....26 2.2.12 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ..........................27 2.3.13 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột........................................27 2.3.14 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được .............................27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT ............... 28 3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 180.245 ....................................28 3.2 Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp ..........................................28 3.3 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ........................................................................29 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.4 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1...................................................30 3.5 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2...................................................31 Tiếp tục đem chủng 8.27 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút. Tỷ lệ sống sót là 0,22%. Mang 33 biến chủng thu được thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính như sau :.....31 3.6 Kết quả đột biến hóa học ............................................................................31 3.7 Kết quả chọn môi trường lên men chìm..................................................32 3.8 Kết quả chọn chủng lên men.....................................................................33 3.9 Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt ...................................................33 3.10 Kết quả chọn dung môi và pH chiết...........................................................34 3.11 Kết quả thử độ bền của dịch chiết kháng sinh trong DM với ánh sáng ..................................................................................................................35 3.12 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi...........................................35 3.13 Kết quả sắc ký cột lần 1...........................................................................35 3.14 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi lần 2 : ....................................36 3.15 Kết quả sắc kí cột lần 2 ...........................................................................37 3.16 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết.......37 3.16.1 Nhiệt độ nóng chảy 180,5ºC. .............................................................37 3.16.3 Phổ hồng ngoại..................................................................................38 3.16.4 Phổ khối : ..........................................................................................38 VI. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 40 KẾT LUẬN.......................................................................................................40 KIẾN NGHỊ : ....................................................................................................41 Bảng phụ lục 1 : Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra .................... 45 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) B.subtilis Bacillus subtilis P. mirabilis Proteus mirabilis S.olivoverticillatus Streptomyces olivoverticillatus MDRSA Multi drug resistance Staphylococus aureus HTKS Hoạt tính kháng sinh MIC Minimum inhibitory concerntration ( nồng độ ức chế tối thiểu ) MT Môi trường MTidt Môi trường i dịch thể DM Dung môi ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vật MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên UV1 Đột biến UV lần 1 UV2 Đột biến UV lần 2 HH Đột biến hóa học vđ vừa đủ đvC đơn vị carbon Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định..................................................................15 Bảng 2: Các dung môi sử dụng...................................................................................17 Bảng 3: Các đặc điểm của Streptomyces 180.245 vàS. olivoverticillatus theo ISP ......28 Bảng 4: HTKS của Streptomyces 180.245 trên MT1,MT2, MT3, MT7.......................30 Bảng 5: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên.........................................................30 Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 1............................................................30 Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 2............................................................31 Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học ............................................................31 Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men chìm .........................................................32 Bảng 10: Kết quả chọn chủng lên men........................................................................32 Bảng 11: Kết quả thử độ bền pH.................................................................................33 Bảng 12: Kết quả thử độ bền nhiệt..............................................................................33 Bảng 13: Kết quả chọn dung môi và pH chiết ............................................................34 Bảng 14: Kết quả thử độ bền của dịch chiết với ánh sáng phòng ................................34 Bảng 15: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký lần 1 ..............................................35 Bảng 16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 ......................................................................35 Bảng 17: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký lần 2 ..............................................36 Bảng 18: Kết quả chạy sắc ký lần 2 ............................................................................36 Bảng phụ lục 1 : Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra Bảng phụ lục 2 : Thành phần các hệ dung môi sử dụng DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của một số họ kháng sinh chính ...................................3 Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn .........................................................................................5 Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn .................................................................................5 Hình 4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn..................................................................................6 Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh ..................................................7 Hình 6: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn ...........................................10 Hình 7:Phổ UV - VIS .................................................................................................37 Hình 8: Dự đoán thành phần phân tử dựa vào phổ khối ..............................................38 Hình 9: Dự đoán cấu trúc phân tử dựa theo kết qủa MS ( trích ) ................................38 Hình phụ lục 1 : Hình ảnh hiển vi chuỗi bào tử Hình phụ lục 2: Hình ảnh hiển vi bề mặt bào tử Hình phụ lục 3 : Nuôi cấy xạ khuẩn bề mặt Hình phụ lục 4 : Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Hình phụ lục 5 : Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hình phụ lục 6 : Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch Hình phụ lục 7 : Hiện hình VSV vết sắc kí lớp mỏng Hình phụ lục 8: Sắc kí cột tinh chế kháng sinh Hình phụ lục 9: Một số cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Hình phụ lục 10: Phổ IR Hình phụ lục 11 : Phổ khối Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát triển về vi sinh vật học , với bước ngoặt lịch sử là phát minh về penicilin đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng kháng sinh vào điều trị cho con ngườ i. Từ khi ra đời đến nay, kháng sinh luôn thể hiện được vai trò quan trọng trong y học, trở thành công cụ đắc lực trong phòng và chữa bệnh. Vì vậy, nhu cầu có các kháng sinh có hiệu quả cao, ít bị kháng và độc tính thấp là tất yếu đối với nền y tế của các quốc gia trong đó có Việt Nam chúng ta – một nước đang phát triển có tỉ lệ bệnh nhiễm trùng cũng như tỉ lệ kháng kháng sinh cao. Môi trường khí hậu đa dạng ở nước ta là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại vi sinh vật phát triển, trong số đó là xạ khuẩn. Rất nhiều xạ khuẩn, đặc biệt là xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và nhiều hoạt chất có giá trị trong y học khác. Với thực trạng nước ta hiện nay, hầu hết kháng sinh trên thị trường là nhập khẩu (dạng thành phẩm hoặc bán thành phẩm ), ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa phát triển, đây là một hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các thuốc mới, kháng sinh mới đưa vào sản xuất và điều trị. Do đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 180.245 ” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau : - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180.245, - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Xác định các điều kiện tối thích để lên men, chiết tách kháng sinh, - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được . 2 I. TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh,…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [10,16] Cần phân biệt một số chất cũng do VSV tạo ra nhưng không được gọi là kháng sinh (ethanol, các acid hữu cơ,…) vì chúng tác dụng lên VSV khác không chọn lọc và ở nồng độ cao.[16] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng ,…[10,17] Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học rất quan trọng vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác. [7] Sau đây là một số nhóm kháng sinh phân loại theo cấu trúc hoá học : [7,10] - Các kháng sinh β-lactam ( các penicillin, cephalosporin) - Các kháng sinh cloramphenicol ( cloramphenicol,...) - Các kháng sinh aminoglycosid (streptomycin, gentamicin,…) - Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin , minocyclin…) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…) - Các kháng sinh lincosamid ( clindamycin , lincomycin ,…) - Các kháng sinh ansamycin ( rifamycin, rifampicin ) - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…) - Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin) - Các kháng sinh nhóm actinomycin (dactinomycin D). - Các kháng sinh nhóm quinolon ( ciprofloxacin , ofloxacin ,…) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3 - Các kháng sinh sulfonamid (sulfamethoxazol ) 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào VSV, làm biến đổi các phản ứng đó[10,17]. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau ở vi khuẩn. Có 6 kiểu chủ yếu [17]: - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào, - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất, - Tác dụng lên sự tổng hợp AND, - Tác dụng lên sự tổng hợp protein, - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp, - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian. Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 4 Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như : - Trong chăn nuôi: dùng kháng sinh trong thú y để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt. [11] - Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa .[11] - Trong công nghiệp thực phẩm: bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt VSV trong thực phẩm: Subtilin (do B.subtilis tạo ra) [11] 1.1.5 Giới thiệu về tính kháng kháng sinh Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu.[10,16] Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận[16,17]. Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi VSV nhất định đối với một số kháng sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận (tham khảo Hình phụ lục 9) có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng.[16] 1.2 Đại cương về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C trên 55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[5,6,12,16,19] Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 5 Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 55-60 % là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[12,16] 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: - Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi. Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[16] Hình 2 : Khuẩn lạc xạ khuẩn - Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen đỏ, nâu, trắng, vàng, xám…[19] 6 Actinomycetes Actinomycetales Actinoplanaceae Streptoverticulum Streptomycetaceae Streptomyces VSV giống xạ khuẩn … Actinomycetaceae Themostreptomyces … Hình 3 : Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces.[10,16] (Tham khảo Bảng phụ lục 1 ) - Đặc điểm hình thái: Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh : + Khuẩn ty cơ chất : mọc sâu vào MT nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra MT một số loại sắc tố, có loại tan trong nước, có loại chỉ tan trong DM hữu cơ.[19] + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. + Chuỗi bào tử (sợi bào tử) khuẩn ty khí sinh sau một thời gian phát triển trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, uốn cong, móc câu, xoắn; phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc .[5,16,19] Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 7 `Hình 4 : Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn - Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[16,19] - Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.[19] 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh 8 Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [13] 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 Mục đích Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp[14]. Do đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[10,14] 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 9 Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có HTKS tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác. Cần phải chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [16] Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[11,16] 1.4.3 Đột biến cải tạo giống Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến : [11,13,16] - Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), dimethylsulphat, hydroxylamin ,… - Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia α hay β. Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ. - Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon,… Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ (đột biến dương). [13,14] Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.[14] 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn [9,14 ] Bảo quản giữ giống VSV rất cần thiết với mục đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ. [9,14] Thông thường, có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:[14] 10 - Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang ống (hoặc lọ) MT mới. - Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng) - Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh) - Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2 oC và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần. 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men ái khí Lên men ái khí là các quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcarbon trong điều kiện ái khí. Hiểu theo nghĩa rộng, lên men ái khí bao gồm tất cả những quá trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp, trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh, một số vitamin…, là những sản phẩm có ứng dụng quan trọng trong Y Dược học. [16] Tất cả các quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh là các quá trình lên men ái khí. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của VSV, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng. [11,16] Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 11 Hình 6 : Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn[11,16] 1.5.2 Các phương pháp lên men - Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[4,11] - Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn. Có 4 kiểu lên men chìm như sau:[4] + Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm. + Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm MT dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng cao hiệu quả sử dụng bình lên men. + Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình. + Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định. 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men - pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp.[14]
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan