Tài liệu “nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn lactobacillus”.

LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn đồng nghiệp và các cơ quan. Trước hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Trần Liên Hà, PGS. TS. Nguyễn Thanh Hằng thuộc Bộ môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử và Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu. Nhân dịp này cho tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Học viện Hậu Cần, đoàn 871 và các bạn bè đồng nghiệp, đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thư ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận án nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Phí Thị Thanh Mai i LỜI CAM ĐOAN Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu. Hà Nội, ngày ii tháng năm 2017 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. viii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................ ixx DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................... x MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 1.1. Axit lactic. .................................................................................................................. 3 1.1.1. Đặc tính hóa học của axit lactic. ........................................................................ 3 1.1.2. Ứng dụng của axit lactic..................................................................................... 3 1.1.3. Các phương pháp sản xuất axit lactic. ................................................................ 5 1.1.3.1. Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học............................................... 5 1.1.3.2. Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men. ........................................... 5 1.2. Lignocellulose. ........................................................................................................... 6 1.2.1. Thành phần hóa học của lignocellulose. ............................................................ 8 1.2.1.1. Cellulose. ....................................................................................................... 8 1.2.1.2. Hemicellulose. ............................................................................................. 10 1.2.1.3. Lignin........................................................................................................... 11 1.2.2. Rơm rạ. ............................................................................................................. 12 1.3. Lên men axit lactic từ rơm rạ. ................................................................................ 13 1.3.1. Quá trình tiền xử lý . ........................................................................................ 13 1.3.1.1. Tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ. ............................................................ 15 1.3.1.2. Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm. ...................................................................... 15 1.3.2. Quá trình thủy phân. ......................................................................................... 15 1.3.3. Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic. ....................................................................................... 17 1.3.3.1. Nguồn cơ chất. ............................................................................................. 18 1.3.3.2. Chủng giống vi sinh vật. .............................................................................. 23 1.3.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men axit lactic. ............................ 29 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam. ................................................................................ 34 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 38 iii 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị. ................................................................................... 38 2.1.1. Vật liệu. ............................................................................................................ 38 2.1.2. Môi trường. ...................................................................................................... 38 2.1.3. Hóa chất và enzyme. ........................................................................................ 39 2.1.4. Thiết bị. ............................................................................................................ 39 2.2. Phương pháp nghiên cứu. ........................................................................................ 40 2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử. ....................................................... 40 2.2.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn sinh axit lactic từ đường xylose và cellobiose. ... 40 2.2.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh axit lactic. ............................................... 41 2.2.1.3. Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí và sinh hóa của chủng vi khuẩn được chọn. ......................................................................................................................... 41 2.2.1.4. Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử. ........................... 42 2.2.1.5. Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2. ............... 42 2.2.2. Phương pháp lên men. ...................................................................................... 42 2.2.3. Phương pháp hóa lí - sinh................................................................................. 43 2.2.3.1. Định lượng đường khử bằng DNS............................................................... 43 2.2.3.2. Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner. ............................................... 43 2.2.3.3. Xác định hàm lượng axit lactic, hàm lượng đường theo phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC). ................................................................................................. 43 2.2.3.4. Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín . ........................................................................................................................... 44 2.2.3.5. Phương pháp thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic® Htec2 . .......................................................................................... 44 2.2.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic của chủng vi khuẩn được lựa chọn. ........................................................................................... 45 2.2.3.7. Ảnh hưởng của duy trì pH trong quá trình lên men..................................... 47 2.2.3.8. Xác định dạng D, L axit lactic trong dịch lên men từ dịch thủy phân rơm rạ. .................................................................................................................................. 48 2.2.4. Phương pháp toán học. ..................................................................................... 49 2.2.4.1. Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6 và từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2. .................................................. 49 2.2.4.2. Phương pháp thống kê. ................................................................................ 52 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 53 3.1. Lên men axit lactic từ xylose. .................................................................................. 53 iv 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose. ............................................................................................... 53 3.1.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose. .................................................................................................................................. 53 3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose. ....................................................................................................................... 54 3.1.1.3. Định tên chủng vi khuẩn Y6. ....................................................................... 59 3.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. .......................................................................... 61 3.1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6..................................................................................... 61 3.1.2.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. ........................................................................ 62 3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. ........................................................................ 63 3.1.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. ........................................................................ 64 3.1.3. Tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. .............................................................................................................................. 65 3.1.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc và duy trì pH ban đầu trong điều kiện tối ưu. ........ 68 3.1.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. ..................................................................................... 69 3.1.4.2. Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6. ..................................................................................... 70 3.2. Lên men axit lactic từ cellobiose. ............................................................................ 73 3.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose. ......................................................................................... 73 3.2.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose. ................................................................................................................. 73 3.2.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ cellobiose. 74 3.2.1.3. Định tên chủng vi khuẩn HC2. .................................................................... 77 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường và tỉ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 từ đường cellobiose. ................................................................................................................. 80 v 3.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 80 3.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 81 3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 82 3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ................................................................. 82 3.2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2. ......................................................................................... 83 3.2.3. Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ........................................................................................................................... 84 3.2.4. Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2............................................................................................ 87 3.3. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ. ......................................................... 90 3.3.1. Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín và thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng hỗn hợp enzyme Ctec2 và Htec2. .................................... 90 3.3.2. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng đơn hoặc hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6........................................................... 91 3.3.2.1. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L. plantarum HC2. .................................................................................................................................. 92 3.3.2.2. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L. fermentum Y6. 93 3.3.2.3. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6. ....................................................................... 93 3.3.3. Nghiên cứu động học của quá trình lên men axit lactic bởi hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ. ............................. 101 3.3.4. Xác định dạng D, L axit lactic........................................................................ 102 3.3.4.1. Thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men thu được từ quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2. ...................................................................................................... 102 3.3.4.2. Phân tích sản phẩm axit lactic bằng sắc kí lỏng cao áp HPLC. ................. 102 3.3.4.3. Phân tích so sánh xác định thành phần D, L lactic và độ quay phân cực của axit lactic................................................................................................................. 103 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 105 vi DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN................................ 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 108 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 122 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chú thích 16SF Mồi xuôi (Forward primer) 16SR Mồi ngược (Reverse primer) ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate CBHS Cellobiohydrolases CFU Colony-forming unit DNA Deoxyribonucleic acid DNS Dinitrosalisylic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGS Endoglucanase EtOH Ethanol EMP Embden - Meyerhof pathway GAP Glyceraldehyde 3 - Phosphate HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) LAB Vi khuẩn lactic (Lactic acid Bacteria) MRS De Man Rogosa Sharpe PEP Phosphoenolpyruvate PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction) PLA Polylactic axit PP Pentose phosphate pathway PK Phosphoketolase pathway RNA Ribonucleic axit SDS Sodium dodecyl sulfate SSF Simultaneously saccharification and fermentation SHF Separate hydrolysis and fermentation TAE Tris-acetate- Ethylenediaminetetraacetic acid TE Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid YE The mineral salts solution Detector RI Đầu dò chiết xuất RI (Reflective index detector) viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose ........................................... 8 Bảng 1.2. Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose .............................. 24 Bảng 1.3. Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ cellobiose .................................... 26 Bảng 2.1. Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme.................................................................... 39 Bảng 2.2. Máy, thiết bị ........................................................................................................ 40 Bảng 2.3. Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose của chủng ......... L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 50 Bảng 2.4. Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose của chủng .... L. plantarum HC2 ................................................................................................................ 50 Bảng 2.5. Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ xylose ............................ 51 Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ cellobiose ...................... 51 Bảng 3.1. Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường xylose ................................... 53 Bảng 3.2. Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit ........................................................ 57 Bảng 3.3. Hàm lượng axit lactic tạo thành của 2 chủng bằng phương pháp HPLC ............ 58 Bảng 3.4. Đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng Y6........................................................... 59 Bảng 3.5. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với ba yếu tố và hàm lượng axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ............................................................................... 66 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX 7.1.5 ........... 66 Bảng 3.7. Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose ............................. 73 Bảng 3.8. Đặc điểm của các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit ........................................................ 76 Bảng 3.9. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với 3 yếu tố và hàm lượng axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ............................................................................... 84 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 .......... 85 Bảng 3.11. Thành phần đường trong dịch thủy phân rơm rạ............................................... 91 Bảng 3.12. Tỉ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học trong sản phẩm lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L. plantarum HC2 và chủng L. fermentum Y6. ....... 103 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đồng phân quang học của axit lactic .................................................................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc của lignocellulose ................................................................................... 7 Hình 1.3. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose .......................................................................... 9 Hình 1.4. Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose................................................. 10 Hình 1.5. Các dạng của đường xylose ................................................................................ 11 Hình 1.6. Các đơn vị cơ bản của lignin .............................................................................. 12 Hình 1.7. Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ .................................................................... 14 Hình 1.8. Cơ chế thủy phân của cellulose .......................................................................... 16 Hình 1.9. Cơ chế thủy phân của hemicellulose .................................................................. 17 Hình 1. 10. Cơ chế lên men axit lactic từ đường xylose ................................................... 20 Hình 1. 11. Cơ chế lên men axit lactic từ đường cellobiose .............................................. 21 Hình 2.1. Sơ đồ qui trình tiền xử lý và thủy phân rơm rạ.................................................... 45 Hình 2.2. Sơ đồ qui trình thu hồi axit lactic ........................................................................ 48 Hình 3.1. Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose ........................................................................... 55 Hình 3.2. Hình ảnh cấy chấm điểm của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose ................................................................................................................................... 55 Hình 3.3. Hình ảnh đục lỗ thạch của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose ................................................................................................................................... 56 Hình 3.4. Hàm lượng axit tạo thành của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose .............................................................................................................................. 56 Hình 3.5. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5 ............... 58 Hình 3.6. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6 ............... 58 Hình 3.7. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng Y6 ....................................................... 59 Hình 3.8. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối chủng Y6 ............................... 60 Hình 3.9. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng Y6 ............................................................................................................................. 60 Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Y6 với các loài có quan hệ họ hàng gần ................. 61 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6 ...................................................................................................... 62 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6................................................................................................ 63 x Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ đường xylose đến quá trình lên men axit lactic của chủng L. fermentum Y6....................................................................................................... 64 Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6................................................................................................ 64 Hình 3.15. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH ban đầu ............................................ 67 Hình 3.16. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và nồng độ đường ...................................... 67 Hình 3.17. Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nồng độ đường................................ 67 Hình 3.18. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ xylose của chủng ..... L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 68 Hình 3.19. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L. fermentum Y6 ...................................................................................................... 69 Hình 3.20. Ảnh hưởng của việc duy trì pH và không duy trì đến mức độ sử dụng đường trong lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6 ......................................... 70 Hình 3.21. Ảnh hưởng của duy trì và không duy trì pH đến sự hình thành axit và sử dụng đường khi kết thúc quá trình lên men .................................................................................. 70 Hình 3.22. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng……………. L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 71 Hình 3.23. Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose ...................................................................... 75 Hình 3.24. Hình ảnh cấy chấm điểm của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose ............................................................................................................. 75 Hình 3.25. Hình ảnh đục lỗ thạch của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose .................................................................................................................. 76 Hình 3.26. Hàm lượng axit tạo thành của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose ............................................................................................................. 76 Hình 3.27. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ cellobiose của chủng HC2 ..... 77 Hình 3.28. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng HC2 .................................................. 78 Hình 3.29. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối của chủng HC2 .................... 78 Hình 3.30. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng HC2 ........................................................................................................................... 78 Hình 3.31. Vị trí phân loại của chủng HC2 với các loài có quan hệ họ hàng gần............... 79 Hình 3.32. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng L. plantarum HC2. ............................................................................ 80 xi Hình 3.33. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................................. 81 Hình 3.34. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường cellobiose đến khả năng lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 .............................................................................. 82 Hình 3.35. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................................. 83 Hình 3.36. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................................ 83 Hình 3.37. Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................... 85 Hình 3.38. Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ............................................................... 86 Hình 3.39. Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và pH ban đầu quá trình đến lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ....................................................... 86 Hình 3.40. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ cellobiose .............. 87 Hình 3.41. Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2 ..................................................................................................... 87 Hình 3.42. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng ...... L. plantarum HC2 ................................................................................................................ 88 Hình 3.43. Sắc kí đồ HPLC của dịch đường thủy phân rơm rạ với các điều kiện tối ưu .... 90 Hình 3.44. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L. plantarum HC2 ... 92 Hình 3.45. Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L. fermentum Y6 ..... 92 Hình 3.46. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ........................................... 94 Hình 3.47. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ...................................................... 95 Hình 3.48. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 .................................................................... 96 Hình 3.49. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ............................................................................... 97 Hình 3.50. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và L. fermentum Y6 ............................................................................... 98 Hình 3.51. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men bởi hỗn hợp chủng L. plantarum HC2 và… L. fermentum Y6 .................................................................................................................. 99 xii Hình 3.52. Động thái quá trình lên men axit của 2 chủng L. plantarum HC2 và………… L. fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ ....................................................................... 101 Hình 3.53. Qui trình thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men ................................ 102 Hình 3.54. Phổ HPLC mẫu axit lactic của sản phẩm lên men........................................... 103 Hình 3.55. Phổ HPLC mẫu L- axit lactic chuẩn ................................................................ 103 xiii MỞ ĐẦU Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm và công nghiệp hóa học. Trong đó, hơn 70% axit sản xuất ra được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có liên quan đến thực phẩm. Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn. Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường là sản phẩm từ cây lương thực như tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì,... Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này có giá thành cao và cạnh tranh với nguồn nguyên liệu của thực phẩm. Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ nguồn nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm như biomass đã được tập trung nghiên cứu. Ngoài ra, axit lactic được xác nhận là một trong số 30 chất hóa học có khả năng được sản xuất từ biomass. Trong số các nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp. Tuy nhiên, cellulose và hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp được sử dụng bởi vi khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic vì cấu trúc phức tạp của lignocellulose và thiếu các enzyme cellulolytic trong LAB. Dịch thủy phân của lignocellulose sau khi tiền xử lý và thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn hợp đường glucose, cellobiose, xylose và arabinose. Như vậy, dẫn xuất đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose và cellobiose. Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là một hướng nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà còn tăng hiệu quả của quá trình sản xuất axit lactic từ vật liệu lignocellulose. Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất lớn. Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom. Ước tính, mỗi năm có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ. Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt bỏ trên đồng ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những bước tiếp cận, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose thủy phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết được các nguồn đường khác như cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose). Do đó, đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân 1 rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến hành nhằm khai thác những thế mạnh của nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu rơm rạ- nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose. - Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose. - Khảo sát và tối ưu các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ xylose và cellobiose bởi các chủng được chọn. - Khảo sát các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic tạo thành. Những đóng góp mới của đề tài - Luận án phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam: L. fermentum Y6 có khả năng lên men axit lactic từ xylose và chủng L. plantarum HC2 có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose - Luận án nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình lên men sinh axit lactic từ xylose và cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi khuẩn, tối ưu hóa các điều kiện lên men axit lactic) và lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi 2 chủng đã được lựa chọn. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Axit lactic. 1.1.1. Đặc tính hóa học của axit lactic. Axit lactic (2-hydroxypropanoic, CH3CHCOOH) là một axit hydroxycacboxylic xuất hiện rộng rãi nhất trong tự nhiên và được phát hiện bởi nhà hóa học Thụy điển Scheele vào năm 1780 [31]. - Công thức hoá học: C3H6O3 - Công thức tổng quát: CH3–CHOH–COOH - Khối lượng phân tử: 90,08 g/mol - Axit lactic không màu ở dạng lỏng, ở dạng bột hoặc chất rắn có màu từ màu trắng đến màu vàng. Ở dạng lỏng, axit tan được trong nước và etanol. Ở dạng rắn, axit ít hòa tan trong nước nhưng tan được trong acetone. Axit lactic có pKa = 3,86 ở 25oC, điểm sôi: 52,7 - 52,8oC đối với dạng tinh khiết L hoặc D - axit lactic và 16,4oC đối với hỗn hợp racemic DL - axit lactic có chứa 50% của mỗi đồng phân [51]. Axit lactic được sản xuất trong cơ thể người, động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - axit lactic và L - axit lactic. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải (D - axit lactic) và một sang trái (L - axit lactic). Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau. Đồng phân dạng D - axit lactic có hại cho cơ thể con người nhưng đồng phân dạng L lại thích hợp trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm bởi vì cơ thể con người chỉ hấp thụ loại đồng phân này [32]. L - axit lactic D - axit lactic Hình 1.1. Đồng phân quang học của axit lactic [51] 1.1.2. Ứng dụng của axit lactic. Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm, và ngành nông nghiệp,… [31, 43, 3 83]. Trong đó, ứng dụng chính của axit lactic vẫn là thực phẩm và các ngành liên quan đến thực phẩm (chiếm tới 85%) [103]. - Ứng dụng trong thực phẩm bao gồm [126]. + Kiểm soát pH: Kiểm soát độ pH của sản phẩm có thể kéo dài thời hạn sử dụng. Ngoài ra, axit lactic được sử dụng trong món salat và nước sốt để làm tăng tính axit của sản phẩm. + Tạo mùi: Tăng cường và bảo vệ hương vị thịt. Tạo hương vị chua nhẹ trong bánh kẹo, nước giải khát, bia, súp, các sản phẩm sữa,… + Tác dụng kháng khuẩn: Kiểm soát vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes trong thực phẩm. + Tác nhân trong các sản phẩm muối: Ô-liu xanh, dưa chuột và những sản phẩm khác thường đóng gói trong dung dịch muối, axit lactic và nước. Axit lactic đóng vai trò như một chất bảo quản và cải thiện độ trong của dung dịch ngâm muối và hương vị của sản phẩm. Hỗn hợp của axit axetic và axit lactic trong các sản phẩm muối chua: dưa chuột bao tử, hành muối,… tạo ra mùi và vị nhẹ hơn, cải thiện sự ổn định của vi sinh vật. Muối canxi lactate được ghi nhận là muối có tác dụng làm săn chắc sản phẩm, đã được sử dụng cho các loại trái cây và rau đóng hộp. + Tác nhân tạo nhũ tương: Este của axit lactic và axit béo mạch dài có tác dụng tạo hệ nhũ tương đặc biệt trong các sản phẩm bánh qui. - Ứng dụng trong y học. Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng loại vật liệu là purasord, được sử dụng như những đinh ghim, gắn các phần xương lại với nhau, khi xương định hình purasord sẽ tự tiêu hủy. Axit lactic có khả năng trùng hợp thành polymer là polylactic axit (PLA). PLA được dùng làm chỉ tự tiêu, nó cũng được dùng làm thiết bị cố định các vết gãy xương nhỏ và sau đó nó tự phân hủy. Nhờ khả năng này của PLA mà chúng đang được nghiên cứu để có thể thay thế các polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ [126]. - Ứng dụng làm mỹ phẩm. Các muối lactat kim loại (như lactat natri) được sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [126]. - Ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa học. Trong những năm gần đây, axit lactic thu hút được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu do nó là nguyên liệu cho sản xuất polylactic axit (PLA). PLA là một polyeste nhiệt dẻo, nó có thể quay để tạo thành sợi, tạo màng cứng, màng bao gói chịu nhiệt và cho 4 vào khuôn đúc. PLA là thành phần chính trong bao bì thực phẩm ( bao bì đựng salat, bao bì gói kẹo, chai,…). Năm 2008, khối lượng PLA đạt 0,26 triệu tấn/năm, ước tính vào năm 2020 sẽ đạt 15 triệu tấn [53]. Trong công nghiệp nhẹ: Axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm, thuộc da,… 1.1.3. Các phƣơng pháp sản xuất axit lactic. 1.1.3.1. Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học. Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học dựa trên lactonitrile, bao gồm các bước sau [22]: - Bổ sung hydrogen cyanide (HCN) vào dung dịch acetaldehyde (trong môi trường kiềm) để tạo ra lactonitrile. Phản ứng này xảy ra trong pha lỏng ở áp suất cao. Lactonitrile thô được thu lại và tinh sạch bởi quá trình chưng cất. CH3COONa + Acetaldehit HCN CH3CHOHCN Hydrogencianua Lactonitrile - Thủy phân lactonitrile bằng HCl hoặc H2SO4 tạo ra axit lactic cùng với muối amonium. CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4 Lactonitrile CH3CHOHCOOH + 1/2(NH4)2SO4O Axit sulphuric Axit lactic Muối ammonium - Este hóa axit lactic với methanol để tạo ra methyl lactate. Methyl lactate được thu và tinh sạch bằng chưng cất. CH3CHOHCOOH + Axit lactic CH3OH CH3CHOHCOOCH3 Methanol + H2O Methyl lactate - Thủy phân methyl lactate bằng nước dưới xúc tác của axit để tạo ra axit lactic và methanol. Methanol được tạo ra từ quá trình trên lại được quay vòng cho quá trình tiếp sau. CH3CHOCOCH3 + H2O CH3CHOHCOOH Methyl lactate Axit lactic + CH3OH Methanol Sản xuất axit lactic theo phương pháp tổng hợp hóa học xuất phát từ nguồn nhiên liệu dầu mỏ, tuy nhiên nguồn nguyên liệu này đang ngày một cạn kiệt. Ngoài ra, sản xuất axit lactic bằng phương pháp hóa học tạo ra hỗn hợp racemix DL - axit lactic, quá trình phân tách hai đồng phân đòi hỏi chi phí lớn [43]. 1.1.3.2. Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men. Lên men lactic là quá trình ôxy hóa- khử sinh học nhờ vi khuẩn lactic. Qua quá trình lên men này, một lượng đáng kể axit lactic được tích tụ trong môi trường làm giảm mạnh pH của môi trường, tạo ra hiệu ứng ức chế mạnh mẽ các vi sinh vật khác. Vì vậy, lên 5 men bởi vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi như một phương pháp để bảo quản thực phẩm và quá trình này thường không có hoặc cần ít nhiệt [22]. Nguồn carbon cho sản xuất axit lactic theo phương pháp lên men có thể là đường ở dạng tinh khiết như glucose, saccarose, lactose,… hoặc các vật liệu chứa đường như rỉ đường, bã mía, bã sắn, tinh bột và nguyên liệu giàu tinh bột từ khoai tây, khoai mì, lúa mì, lúa mạch, cà rốt [14, 88]. Lên men sản xuất axit lactic là một phương pháp thân thiện với môi trường và axit tạo ra có độ tinh khiết cao [37]. Tuy nhiên, các loại nguyên liệu tinh bột và các loại đường tinh khiết lại có giá thành cao, điều đó làm tăng giá thành sản xuất axit, đây chính là một trong những hạn chế khi so sánh sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men với phương pháp tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học [32]. Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu giá rẻ là hướng đi cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Gần đây, quá trình lên men axit lactic từ nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm, chẳng hạn như sinh khối tái tạo đã được tập trung nghiên cứu, do chúng không có bất kì tác động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người và giá thành thấp. 1.2. Lignocellulose. Biomass là nguồn nguyên liệu tái tạo, bao gồm tất cả các vật liệu có nguồn gốc sinh học như vật liệu thực vật, cây trồng nông nghiệp và thậm chí cả phế thải động vật. Biomass là một nguồn nguyên liệu không đồng nhất, có thành phần hóa học phức tạp. Do có đặc tính phong phú về tự nhiên, phát triển bền vững và giá thành thấp nên biomass là nguồn thay thế đầy tiềm năng cho các nguồn nguyên liệu không có khả năng tái tạo (nguồn vật liệu hóa thạch) được sử dụng trong sản xuất các chất hóa học [21]. Trái đất là một kho sinh khối khổng lồ bao gồm 1800 × 109 tấn ở trên mặt đất và 4 × 109 tấn ở dưới đại dương [136]. Vì vậy, biomass có tiềm năng to lớn cho sản xuất các chất hóa học trong đó có axit lactic. Lignocellulose là dạng vật liệu hữu cơ có nguồn gốc sinh học, đại diện cho nguồn nguyên liệu phong phú nhất trong biomass nhưng vẫn chưa được sử dụng rộng rãi. Lignocellulose chiếm hơn 90% sinh khối thực vật trên trái đất. Hàng năm, ước tính 200 × 109 tấn sinh khối thực vật được tạo ra, trong đó 8 - 20× 109 tấn có khả năng sử dụng [66]. Lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp và nguồn rừng đại diện cho nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo, giá thành thấp và có nguồn carbohydrate sẵn có với hàm lượng polysaccharide cao [104, 133]. Thành phần hóa học của lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp bao gồm khoảng 10% - 25% lignin, 20% - 30% hemicellulose và 40% - 50% cellulose [102]. 6 Hemicellulose và cellulose là những phân đoạn giàu đường và những đường này có thế lên men tạo ra các sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, các chất hóa học, enzyme,…[21]. Hình 1.2. Cấu trúc của lignocellulose [21] Nói chung, tỉ lệ các thành phần hóa học của lignocellulose cao hay thấp phụ thuộc vào loại thực vật, điều kiện canh tác,…. Lignocellulose có một cấu trúc bên trong phức tạp và bao gồm số lượng lớn các thành phần chính cũng có cấu trúc phức tạp. Bảng 1.1 cho thấy phần trăm các thành phần hóa học trong các nguyên liệu lignocellulose khác nhau. 7