Tài liệu Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây địa hoàng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào giai đoạn phòng thí nghiệm

1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ VŨ THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY ĐỊA HOÀNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO GIAI ĐOẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Khoa học Cây trồng Phú Thọ, 2017 2 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ VŨ THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY ĐỊA HOÀNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO GIAI ĐOẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Khoa học Cây trồng NGƢỜI HƢỚNG DẪN: 1. TS. PHẠM THANH LOAN 2. THS HÀ THỊ TÂM TIẾN Phú Thọ, 2017 i LỜI CẢM ƠN Đƣợc sự phân công của Khoa Nông - Lâm - Ngƣ, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng. Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo Khoa Nông - Lâm - Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Thanh Loan, Trƣởng khoa Nông - Lâm - Ngƣ, ThS Hà Thị Tâm Tiến, giảng viên khoa Nông - Lâm - Ngƣ, ngƣời đã hƣớng dẫn đề tài khóa luận, tận tình chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và viết khóa luận. Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và tạo động lực cho tôi để tôi có thể hoàn thành báo cáo này một cách tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Vũ Thị Huyền ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ Thí nghiệm, kết quả Thí nghiệm do chính tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu và kết quả trong báo cáo khóa luận này là trung thực và chƣa công bố trên bất kì công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin, tài liệu đƣợc trích dẫn trong báo cáo này đều đƣợc ghi nguồn gốc rõ ràng. Phú Thọ, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Vũ Thị Huyền iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................... v DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 3 3.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Tổng quan về cây Địa hoàng...................................................................... 4 1.1.1. Đặc điểm thực vật học............................................................................. 4 1.1.2. Điều kiện sinh thái ................................................................................... 4 1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào ..................... 8 1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào ........ 9 1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào ............................................................. 11 1.2.3. Các giai đoạn nuôi cấy ......................................................................... 12 1.2.4. Các điều kiện nuôi cấy in vitro ............................................................... 14 1.2.5. Chất điều hòa sinh trưởng .................................................................... 16 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .............................................. 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ......................................................... 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 20 Chƣơng 2. Đ I TƢ NG, PHẠM VI, N I DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 22 2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 22 iv 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................. 22 2.4.2. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng đến mẫu cấy ........................................................................................... 27 3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền nuôi cấy đến sự nảy chồi của lát cắt củ Địa hoàng................................................................................................................ 29 3.3. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự nhân chồi của Địa hoàng in vitro ........... 31 3.4. Ảnh hƣởng phối hợp của Kinetin và BAP đến sự nhân chồi của Địa hoàng in vitro .................................................................................................. 35 3.5. Ảnh hƣởng của IAA đến sự tạo rễ cây Địa hoàng in vitro ...................... 39 3.5.1. Ảnh hưởng của IAA đến tỷ lệ cây ra rễ ................................................. 39 3.5.2. Ảnh hưởng của IAA đến số rễ trung bình/cây và chiều dài rễ .............. 40 3.6. Ảnh hƣởng phối hợp của IAA và NAA đến sự tạo rễ của cây Địa hoàng in vitro ............................................................................................................. 42 3.6.1. Ảnh hưởng phối hợp của IAA và NAA đến tỷ lệ cây ra rễ .................... 42 3.6.2. Ảnh hưởng phối hợp của IAA và NAA đến số rễ trung bình/cây và chiều dài rễ................................................................................................................ 44 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 47 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 48 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Nội dung BAP Benzylaminopurine CT Công thức ĐC Đối chứng IAA Indole-3-acetic acid MS Murashige and Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid TB Trung bình VW Vaccin and Went vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp khử trùng đến sự tạo chồi Địa hoàng in vitro sau 2 tuần nuôi cấy ............................................................................. 27 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự nảy chồi của Địa hoàng in vitro ............................................................................................................. 30 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự nhân chồi của Địa hoàng in vitro . 32 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng phối hợp của Kinetin và BAP đến sự nhân chồi của Địa hoàng in vitro .................................................................................................. 36 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của IAA đến sự tạo rễ cây Địa hoàng in vitro ............ 39 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng phối hợp của IAA và NAA đến sự tạo rễ cây Địa hoàng in vitro ............................................................................................................. 42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Địa hoàng ................................................................................... 4 Hình 1.2. Hoa Địa hoàng ................................................................................... 4 Hình 1.3. Củ Địa hoàng ..................................................................................... 4 Hình 3.2. Mẫu Địa hoàng ................................................................................ 29 Hình 3.3. Sự nảy chồi của lát cắt Địa hoàng sau 2 tuần nuôi cấy ................... 30 Hình 3.4. Biểu đồ sự nảy chồi của mẫu Địa hoàng......................................... 31 Hình 3.5. Biểu đồ hệ số nhân chồi in vitro Địa hoàng .................................... 33 Hình 3.6. Sự nhân chồi Địa hoàng sau 4 tuần nuôi cấy .................................. 33 Hình 3.7. Biểu đồ chiều cao chồi Địa hoàng in vitro...................................... 34 Hình 3.8. Chiều cao chồi Địa hoàng in vitro sau 4 tuần nuôi cấy .................. 34 Hình 3.9. Hệ số nhân chồi in vitro Địa hoàng ................................................ 36 Hình 3.10. Sự nhân chồi của Địa hoàng trong các môi trƣờng ...................... 37 Hình 3.11. Biểu đồ chiều cao chồi Địa hoàng in vitro.................................... 37 Hình 3.12. Chiều cao chồi Địa hoàng in vitro ................................................ 38 Hình 3.13. Biểu đồ tỷ lệ cây Địa hoàng in vitro ra rễ ..................................... 40 Hình 3.14. Biểu đồ số rễ trung bình/cây Địa hoàng in vitro ........................... 40 Hình 3.15. Biểu đồ chiều dài rễ cây Địa hoàng in vitro ................................. 41 Hình 3.16. Sự ra rễ Địa hoàng sau 4 tuần nuôi cấy ........................................ 41 Hình 3.17. Biểu đồ tỷ lệ cây Địa hoàng in vitro ra rễ ..................................... 43 Hình 3.18. Biểu đồ số rễ trung bình/cây Địa hoàng in vitro ........................... 44 Hình 3.19. Biểu đồ chiều dài rễ cây Địa hoàng in vitro ................................. 44 Hình 3.20. Sự ra rễ của Địa hoàng in vitro ..................................................... 45 Hình 3.21. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng giai đoạn phòng thí nghiệm........................................................................................................ 46 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây thuốc có vai trò quan trọng trong công tác chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Theo các tài liệu cho thấy, có tới 80% dân số thế giới đang sử dụng các loại cây thuốc để chăm sóc sức khỏe ban đầu và gần 70 - 80% dân số ở các vùng nông thôn lấy cây thuốc làm nguồn chữa bệnh chủ yếu. Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới, thời tiết quanh năm nóng ẩm từ đó tạo nên nguồn tài nguyên dƣợc liệu vô cùng phong phú, đa dạng về thành phần và chủng loại. Trong lịch sử phát triển, ngƣời Việt Nam luôn nêu cao chân lý: “Thuốc nam chữa bệnh ngƣời nam”. Y tế phát triển, nhu cầu cây thuốc tạo nguyên liệu cho sản xuất thuốc và xuất khẩu ngày càng cao. Thuốc từ cây dƣợc liệu có nhiều triển vọng để phục vụ thị trƣờng hơn 90 triệu dân, để xuất khẩu và sử dụng làm mỹ phẩm. Để đáp ứng nhu cầu đó, ngành dƣợc liệu đã và đang tích cực nghiên cứu phát hiện dƣợc liệu mới, công dụng mới giúp điều trị và nâng cao sức khỏe cho cộng đồng. Do vậy, phát triển công tác nghiên cứu trồng cây thuốc là một yêu cầu cần thiết. Theo quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tƣớng Chính phủ về việc phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển dƣợc liệu đến năm 2020 và định hƣớng đến năm 2030, trong đó loài dƣợc liệu Địa hoàng đƣợc ƣu tiên phát triển tại vùng trung du miền núi Bắc Bộ và vùng đồng bằng sông Hồng với diện tích 200 ha. Căn cứ quyết định số 206/QĐ-BYT ngày 22/1/2015 của Bộ Y tế về việc ban hành danh mục 54 cây dƣợc liệu ƣu tiên phát triển giai đoạn 2015-2020, UBND tỉnh Phú Thọ đã ban bành quyết định số 621/QĐ-UBND, ngày 31/3/2015 về danh mục các loài cây dƣợc liệu ƣu tiên phát triển trên địa bàn Phú Thọ giai đoạn 2015-2020, đã xác định loài dƣợc liệu Địa hoàng (Rehmanmia glutinosa) là một trong 7 loài đƣợc ƣu tiên nghiên cứu và phát triển tại tỉnh Phú Thọ. 2 Cây Địa hoàng là một dƣợc liệu quý, đƣợc nhập nội từ Trung Quốc và trồng tại Việt Nam vào năm 1958; là loài ƣa ánh sáng và nhiệt độ ôn hòa từ 15-25oC; ƣa đất tơi xốp, thoát nƣớc. Cây sinh trƣởng trong thời gian từ 150160 ngày. Bộ phận khai thác là củ. Củ loài Địa hoàng có chứa các hợp chất nhóm: Iridoid glycosid, rehmainonosid, các axit amin… có tác dụng bổ âm, thanh nhiệt, bổ huyết, bổ thận, làm đen râu tóc, hạ đƣờng huyết, tăng cƣờng sức khỏe [1, 3]. Củ Địa hoàng là một loại thảo dƣợc cơ bản, đƣợc dùng để chế biến Sinh địa và Thục địa, là vị thuốc bắc đƣợc sử dụng nhiều trong y học cổ truyền. Nhu cầu của thị trƣờng đối với củ Địa hoàng từ 1.000-1.200 tấn khô/năm, nhƣng hầu hết là nhập khẩu từ Trung Quốc; năm 2014, Việt Nam mới tự sản xuất đƣợc khoảng 50 tấn (bằng 1/20 nhu cầu). Do vậy, nghiên cứu phát triển trồng dƣợc liệu Địa hoàng để đáp ứng nhu cầu dƣợc liệu trong nƣớc là cần thiết. Hiện nay, Địa hoàng chủ yếu đƣợc trồng tại một số huyện (Việt Yên, Yên Dũng) của tỉnh Bắc Giang, quy mô nhỏ, chỉ từ 5-10 ha/toàn tỉnh. Củ giống hay bị nhiễm bệnh thối nhũn củ, dẫn tới năng suất và chất lƣợng củ Địa hoàng thƣơng phẩm thấp. Do đó, nhằm góp phần sản xuất giống cây Địa hoàng có chất lƣợng cao và tăng số lƣợng giống. Tạo ra cây giống có ƣu thế về sinh trƣởng, phát triển, cho năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu cao hơn cây trồng bằng lát cắt rễ củ truyền thống chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây Địa hoàng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào giai đoạn phòng thí nghiệm. 3 2. Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện đƣợc quy trình nhân giống cây Địa hoàng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào giai đoạn phòng thí nghiệm, góp phần duy trì và phát triển nguồn giống Địa hoàng sạch bệnh, có chất lƣợng cao. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng nhân giống in vitro giống cây Địa hoàng các phƣơng pháp khử trùng mẫu sạch, phƣơng pháp nhân nhanh và phƣơng pháp tạo rễ cho cây Địa hoàng. Kết quả nghiên cứu cũng là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu, học tập về cây dƣợc liệu nói chung và cây Địa hoàng nói riêng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài có thể ứng dụng vào quá trình nhân giống in vitro giống cây Địa hoàng tại Khoa Nông - Lâm - Ngƣ, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, tỉnh Phú Thọ. Tạo ra giống cây Địa hoàng in vitro đồng đều về chất lƣợng, năng suất cao. Góp phần bảo tồn và phát triển nhân giống cây Địa hoàng trong thực tiễn. 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây Địa hoàng 1.1.1. Đặc điểm thực vật học Địa hoàng (Rehmannia glutinosa Libosch) thuộc họ Hoa mõm sói (Scrophulariaceae), chi Địa hoàng (Rehmannia). Địa hoàng là cây thân thảo, sống hàng năm, toàn thân cây có lông trắng mềm. Cây cao từ 30-35 cm. Lá mọc vòng ở gốc, phiến lá hình trứng ngƣợc đến bầu dục dài, đuôi lá tù, mép lá có răng cƣa không đều nhau, lá có nếp nhăn. Hoa tự chùm ở ngọn, đài hình chuông, bên trong nứt thành 5 cánh giống nhƣ hình môi, mặt ngoài màu tím đỏ, mặt trong màu vàng có vân tím. Cây trồng vụ nào cũng có hoa, nhƣng không kết hạt. Địa hoàng thuộc loại cây rễ củ, mỗi cây có 5-7 củ, củ có cuống dài, vỏ củ màu đỏ nhạt. Mùa hoa tháng 5-6 [3]. Hình 1.1. Cây Địa hoàng Hình 1.2. Hoa Địa hoàng Hình 1.3. Củ Địa hoàng 1.1.2. Điều kiện sinh thái Địa hoàng là cây thuốc nhập nội từ Trung Quốc. Từ năm 1958, cây Địa hoàng đƣợc nhập vào Việt Nam và đã đƣợc trồng ở nhiều vùng thuộc trung du, đồng bằng và miền núi. Địa hoàng ƣa đất tơi xốp, nhiều mùn, cao ráo, thoát nƣớc, nếu đƣợc trồng ở đất pha cát càng tốt. Địa hoàng không chịu đƣợc úng, hạn, rét quá hoặc nóng quá phát triển kém, thậm chí ngừng phát triển. Vì vậy, đối với các tỉnh miền núi cao hay nơi lạnh nhiều, mỗi năm chỉ trồng đƣợc một vụ vào cuối xuân (tháng 3-4). Nếu trồng vào mùa thu cây không phát triển đƣợc vào mùa lạnh. Còn đối với các tỉnh miền trung du và đồng bằng mỗi năm có thể trồng 2 vụ, một vụ trồng vào tháng 1-2, một vụ trồng vào tháng 7-8 [1]. 5 Giá trị làm thuốc Thành phần hóa học * Rễ của Địa hoàng chứa: - Iridoidglycosides: catalpol, ajugol, geniposide, 8-epiloganic acid, jioglutoside A, B, melittoside, rehmanniaoside A, B, C, D. - Iridoid aglycons: rehmanglutine A, B, C, D. - Terpenoids: 3-jononglucoside, rehmaionoside A, B, C, rehmapicroside. - Phenolic esterglycosides: verbascoside, acetylverbascoside, cistanoside, isoverbascoside, jionoside A1, B1, B2, C, D, E, leucosceptoside, martynoside, purpureaside C. - Carbohydrates: stachyose, D-fructose, D-galactose, manninotriose, raffinose, saccharose, verbascose, D-mannitol. - Các hợp chất khác: campesterol, β-sitosterol, stigmasterol, cerebroside. * Lá chứa các flavan chrysoeriol [3]. Công dụng: - Theo y học cổ truyền: + Địa hoàng có vị ngọt đắng, tính hàn, quy vào 4 kinh: Tâm, can, thận, tiểu trƣờng. Có tác dụng bổ âm, thanh nhiệt, sinh huyết, làm mát máu và cầm máu. + Thục địa có vị ngọt, mùi thơm, tính hơi ấm, quy vào 3 kinh: Tâm, can, thận. Có tác dụng dƣỡng huyết, bổ thận, làm đen râu tóc. + Địa hoàng chữa âm hƣ, phát nóng về chiều, khát nƣớc nhiều, đái tháo đƣờng, thiếu máu, suy nhƣợc cơ thể, tạng chảy máu, thổ huyết, băng huyết, chảy máu cam, kinh nguyệt không đều, động thai, ban chẩn, viêm họng, tân dịch khô, tâm thần không yên, phiền não mất ngủ. Ngày dùng 8-16 g, dạng thuốc sắc. + Thục địa dùng chữa âm hƣ, huyết suy, chứng nóng âm ỉ, cơ thể yếu mệt, ho khí suyễn, bệnh tiêu khát, kinh nguyệt không đều, làm sáng mắt, điều kinh, bổ huyết, sinh tinh, cơ thể tráng kiện, làm đen râu tóc. 6 + Trong y học cổ truyền Trung Quốc: Địa hoàng tƣơi dùng trị âm suy, với nhiệt trong, sốt có lƣỡi đỏ và tiêu khát, khạc máu, chảy máu cam, đau họng; thục địa chữa âm suy ở gan thận, đau nhức và yếu thắt lƣng, đầu gối, ra mồ hôi ban đêm, di tinh, mộng tinh, đái tháo đƣờng, thiếu máu, đánh trống ngực, rối loạn kinh nguyệt, chảy máu tử cung, chóng mặt, ù tai, bạc râu tóc sớm [3]. - Theo y học hiện đại, tác dụng dƣợc lý: + Trên hệ miễn dịch: Nƣớc sắc Địa hoàng làm tăng hoạt tính tạo phân bào của phorbol myristat acetat và phytohemaglutimin trên tế bào lách của chuột cống trắng. Nhƣng không có biểu hiện khi có các chất tạo phân bào trên. Điều đó chứng tỏ Địa hoàng có tác dụng kích thích và điều hòa miễn dịch. Địa hoàng thể hiện hoạt tính chặn miễn dịch trên invivo của các hoạt chất 2-phenyllethyl glycosid, các jionosid A1 và B1. Khi thử nghiệm kết hợp sử dụng Địa hoàng và glucocorticoid ở trên Thỏ, thấy Địa hoàng không làm mất tác dụng của corticoid, nhƣng hạn chế tác dụng không mong muốn của corticoid trên tuyến yên và thƣợng thận của Thỏ [3]. + Địa hoàng tác dụng hạ đƣờng huyết trên động vật đái tháo đƣờng với các thành phần hoạt chất là các iridoid glycozid A, B, C. Tiêm màng bụng phân đoạn các polysarcarid có cấu trúc tƣơng tự pectin chiết xuất từ Địa hoàng cho chuột nhắt trắng đã gây đái tháo đƣờng bằng steptozotocin nhận thấy: làm tăng hoạt tính glucokinase, G6DP (glucose - 6 - dehydrogenase phosphatase) và giảm hoạt tính của G6P (glucose - 6 - phosphatese), phosphofructokinase; làm tăng tiết insulin, giảm glycogen trong gan [3]. + Địa hoàng có tác dụng an thần và lợi tiểu trên động vật thí nghiệm và thể hiện hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro. + Trên chuột nhắt cái thiến, thử tác dụng của bài thuốc bổ tinh (thực địa, khởi tử), thấy gây động dục. + Áp dụng tiêm thuốc đƣợc bào chế từ Địa hoàng và Đan sâm cho 23 bệnh nhân đái tháo đƣờng có biến chứng thần kinh ngoại biên, các triệu chứng và dấu hiệu của bệnh giảm rõ rệt. 7 + Bệnh nhân chảy máu dạ dày, ruột đƣợc điều trị bằng bột Địa hoàng và Bạch cập hay thuốc sắc của Địa hoàng, Hoàng liên, Hoàng kỳ cho thấy giảm và ngừng hẳn chảy máu sau 4-5 ngày điều trị. + Địa hoàng có tác dụng hỗ trợ trong điều trị viêm thoái hóa hoàng điểm + Địa hoàng còn có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe, tăng cƣờng khả năng hoạt động tình dục, chất lƣợng sinh tinh của các bệnh nhân nam bị suy giảm chức năng sinh dục với bài bổ thận. Đồng thời cũng có tác dụng an thai với các phụ nữ mang thai hay bị sẩy thai với bài an thai [3]. * Một số bài thuốc dùng Sinh địa và Thục địa - Chế biến Địa hoàng thành Sinh địa và Thục địa + Chế biến Địa hoàng thành sinh địa: Sinh địa chế: Rễ củ khi đào, không bị sây xƣớc, rửa nhanh qua nƣớc (có nơi không rửa). Phân loại theo độ to nhỏ. Cho vào lò sấy, lúc đầu sấy nhẹ ở nhiệt độ 35 - 40 C (khoảng 24 giờ). Sau giữ nhiệt độ ở 50 - 60 C, hàng ngày đảo cho đều. Làm nhƣ vậy trong khoảng 6 - 7 ngày cho đến khi củ mềm dẻo, phần thịt đã chuyển sang màu đen. Cho ra khỏi lò sấy, rải ra sàn (khô ráo, thoáng sạch) phơi tự nhiên trong khoảng 6 - 7 ngày. Xếp củ dồn lại, dùng bao tải phủ lên và để 2 - 3 ngày khi thấy vỏ củ ngoài ngả màu xám, có mốc trắng, nếu bẻ củ thấy trong có tiết ra một chất dịch màu đen dính, chất củ mềm là đƣợc. Tiếp tục đƣa củ vào sấy ở nhiệt độ 40 - 50ºC đến khi thấy vỏ ngoài củ khô là đƣợc. Yêu cầu: Sinh địa có vỏ khô, màu xám đen, thịt đen, phần giữa củ còn hơi vàng. Bảo quản trong thùng kín. Nếu để chế thành Thục địa thì không cần bảo quản.  Sinh địa thán: Sinh địa thái lát, cho vào nồi rang nóng, sao đều tay cho đến khi bề mặt phiến có màu đen có những nốt nhỏ phổng lên. Phun ít nƣớc lã vào, để nguội. + Chế biến sinh địa thành thục địa: củ Địa hoàng rửa sạch, xếp vào thùng nhôm hoặc thép không gỉ. Xếp củ to ở dƣới, củ nhỏ ở trên, thêm rƣợu 40% (1lít cho 9 - 10kg củ Địa hoàng). Thêm nƣớc đủ ngập. Đun đến sôi, hạ lửa, 8 duy trì sôi nhẹ từ 6 - 8 giờ. Trong thời gian đun, thƣờng sau 1 giờ lại múc nƣớc dƣới nồi rƣới đều lớp củ phía trên. Có thể đun liên tục trong 72 giờ, tiếp nƣớc sôi liên tục khi đun, chú ý không để bị cháy. Đun tới cạn. Đổ ra phơi nắng tới độ ẩm 20% hoặc có thể sấy. Sau đó, đem nấu tiếp với nƣớc Sinh khƣơng (dùng 200g gừng tƣơi rửa sạch, giã nhỏ, vắt lấy nƣớc cho vào Địa hoàng đã phơi ở trên) tiếp tục đun trong 6 giờ. Phơi và sấy đến khi thu đƣợc Thục địa đen nhánh, sờ không dính tay. Một số bài thuốc dùng Sinh địa và Thục địa: - Chữa suy nhƣợc cơ thể, suy nhƣợc thần kinh, ỉa chảy mãn tính ở ngƣời cao tuổi - “Thận khí hoàn”: Thục địa 16g, Sơn thù, Hoài sơn mỗi vị 12 g, Trạch tả, Đan bì, Phục linh, Phụ tử chế mỗi vị 8g, Nhục quế 4g; sắc uống. - Chữa hen phế quản - “Hữu quy ẩm”: Thục địa 16g, Kỷ tử, Phụ tử chế mỗi vị 12g, Sơn thù, Hoài sơn, Phục linh mỗi vị 8g, Cam thảo, Nhục quế mỗi vị 6g: sắc uống. - Chữa tăng huyết áp: Thục địa 16g, Hoài sơn 12g, Sơn thù, Phục linh, Trạch tả, Đan bì, Đƣơng quy, Bạch thƣợc mỗi vị 8g: sắc uống. - Chữa đái tháo đƣờng: Sinh địa, Thạch cao mỗi vị 40g, Thổ hoàng liên 16g: sắc uống. - Chữa động thai ra máu nhỏ giọt - “Bảm âm tiễn”: Sinh địa, Thục địa, Hoài sơn, Tục đoạn mỗi vị 12g, Bạch thƣợc, Hoàng cầm, Hoàng bá mỗi vị 8g, Cam thảo 6g: sắc uống [3]. 1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Đây là phƣơng pháp nhân giống hiện đại đƣợc thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phƣơng pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm. Khác với các phƣơng pháp nhân giống truyền thống nhƣ giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phƣơng pháp nhân giống in vitro trong một thời gian ngắn có 9 thể tạo ra một số lƣợng cây lớn, đồng đều về chất lƣợng mà các phƣơng pháp nhân giống khác không thể làm đƣợc. Ngoài ra phƣơng pháp này còn không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. 1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào Kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào đã đƣợc phát triển trên những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật. * Tính toàn năng của tế bào Cuối thế kỉ XIX đầu thế kỉ XX, nhà sinh lí thực vật ngƣời Đức Haberlandt (1902) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm sinh học hiện đại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Đó chính là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đã nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con ngƣời đã hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. * Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. “Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể”. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hoá tế bào, ngƣợc lại với sự phân hoá tế bào. 10 Về bản chất, sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen: Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể, có một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đó nó bị ức chế) để cho tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này đã đƣợc mã hóa trong bộ gen của từng loài thực vật. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào xét cho đến cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng) một cách định hƣớng dựa và sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào trong môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật đó là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hai nhóm chất này trong môi trƣờng sẽ kéo theo sự phát sinh hình thái khác nhau của thực vật [4]. * Sự trẻ hóa Vào thế kỉ XVII, XVIII ngƣời ta cho rằng các dòng vô tính bị thoái hóa đi theo tuổi và chỉ có thể trẻ hóa thông qua sinh sản bằng hạt. Song thực tế cho thấy rằng đời sống một dòng vô tính là vô hạn nếu nó sống trong một môi trƣờng thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh trƣởng sinh dƣỡng. Nguyên nhân thoái hóa chủ yếu là do tác hại của virus. Trong nuôi cấy mô tế bào, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu: các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới đƣợc hình thành, sinh trƣởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn. Vì vậy việc trẻ hoá là một biện pháp quan trọng nhất trong nhân giống sinh dƣỡng [4]. 11 1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào *Thành phần hóa học của môi trường Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhƣng mục đích nuôi cấy khác nhau thì môi trƣờng nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản. Môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhƣng môi trƣờng nuôi cấy đều gồm các thành phần sau: - Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lƣợng và vi lƣợng) đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. - Thành phần hữu cơ:Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol, thành phần hữu cơ phức hợp, dịch chiết hoa quả, củ, nƣớc ép cà chua, nƣớc ép cam, nƣớc ép chuối xanh, nƣớc dừa. - Các chất điều hoà sinh trƣởng: Các chất điều hoà sinh trƣởng là thành phần không thể thiếu đƣợc trong môi trƣờng nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trƣởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng sử dụng trong nuôi cấy. - Nguồn cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp nhƣng ở cƣờng độ rất thấp. Vì vậy phải đƣa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trƣờng nuôi cấy. Loại hydratcacbon đƣợc sử dụng phổ biến là đƣờng saccarozơ với hàm lƣợng từ 2 6% (w/v). Những loại đƣờng khác nhƣ fructose, glucose, maltose, sorbitol... rất ít dùng. Hàm lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngƣợc lại hàm lƣợng đƣờng cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi. - Các thành phần khác: + Tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy. Chất tạo gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar (thạch). Hàm lƣợng agar sử dụng từ 0,5-10% (w/v) tuỳ theo chất lƣợng của chúng và môi trƣờng sử dụng. Khi