Tài liệu Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------- NGUYỄN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU ĐỨT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NGƯỜI BỆNH VÔ SINH DO KHÔNG CÓ TINH TRÙNG HOẶC ÍT TINH TRÙNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội- 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- NGUYỄN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU ĐỨT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NGƯỜI BỆNH VÔ SINH DO KHÔNG CÓ TINH TRÙNG HOẶC ÍT TINH TRÙNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS. TRẦN VĂN KHOA Hà Nội- 2012 MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 8 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10 1.1. Vấn đề vô sinh và vô sinh ở nam giới ....................................................... 10 1.2. Các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới................................................. 13 1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới ......................................... 13 1.2.2 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do rối loạn di truyền ở mức độ NST14 1.2.3 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do mất đoạn trên vùng AZF của NST Y. 16 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 23 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................ 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 23 2.2.1 Phương pháp lập hồ sơ bệnh án ............................................................. 24 2.2.2 Phương pháp phân tích NST và lập nhiễm sắc thể đồ ............................ 24 2.2.3 Phương pháp phát hiện những mất đoạn vùng AZF của NSTY ............. 25 2.2.4 Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê và tính tỷ lệ % ............... 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 26 3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu............................................................... 26 3.2. Phân tích NST, lập nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới .... 27 3.2.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới .............. 27 3.2.2 Phân bố bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc . 30 3.3. Kết quả phát hiện mất đoạn vùng AZF của NST Y ................................ 35 3.3.1 Hoàn thiện quy trình Multiplex PCR nhằm phát hiện mất đoạn vùng AZF ở bệnh nhân vô sinh. ........................................................................................... 35 3.3.2 Tỷ lệ và phân bố các mất đoạn vùng AZF ở bệnh nhân vô sinh nam giới.. 39 3.3.3. Tỷ lệ bệnh nhân bị mất đoạn theo từng phân vùng AZFa, AZFb, AZFc 41 3.3.4 Tỷ lệ bệnh nhân mất đoạn theo từng STS được nghiên cứu ................... 42 3.3.5 Một số kết quả điện di trong nghiên cứu ................................................ 44 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 49 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 50 PHỤ LỤC:…………………………………………………………………54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tiêu chuẩn xét nghiệm tinh dịch đồ theo WHO [66] ............................ 11 Bảng 1.2: Tỷ lệ bất thường NST khảo sát ở một số nghiên cứu ............................ 14 Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi ..................................... 26 Bảng 3.2: Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể đồ của một số tác giả ........................... 29 Bảng 3.3: Phân bố về bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc của bệnh nhân vô sinh nam giới. ..................................................................... 30 Bảng 3.4: Tỷ lệ bất thường NST thường và NST giới tính của một số tác giả .......... 31 Bảng 3.5: Phân bố các kiểu nhiễm sắc thể đồ bất thường ở bệnh nhân vô sinh nam giới: ......................................................................................................................... 32 Bảng 3.6: Trình tự 7 cặp mồi chạy Multiplex PCR [16] ........................................ 36 Bảng 3.7: Các thành phần phản ứng PCR .............................................................. 38 Bảng 3.8: Mất đoạn trên AZF ở một số nghiên cứu khác nhau ............................. 40 Bảng 3.9: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân vô sinh nam giới mất đoạn trên từng phân vùng AZF ......................................................................................................................... 41 Bảng 3.10: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân vô sinh nam giới mất đoạn theo từng STS nghiên cứu .......................................................................................................................... 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 : Mô hình cấu trúc NST Y [16] ............................................................... 18 Hình 1.2: Phân loại mất đoạn trên vùng AZF [28] ................................................. 19 Hình 3.1: Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới .............. 28 Hình 3.2: Chu trình nhiệt chạy Multiplex PCR ...................................................... 38 Hình 3.3: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân bị mất đoạn trên vùng AZF ............................. 40 Hình 3.4: Ảnh điện di của bệnh nhân không phát hiện mất đoạn ở các STS nghiên cứu ................................................................................................................................ 44 Hình 3.5: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY84 ......................... 45 Hình 3.6: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY84 và sY86 ............... 45 Hình 3.7: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY127 và sY134 ............. 46 Hình 3.8: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY153 ....................... 46 Hình 3.9: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY254 và sY153 ................. 47 Hình 3.10: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY84, sY134 và sY153 ................................................................................................................................ 47 Hình 3.11: Ảnh điện di đơn mồi sY84 của bệnh nhân bước đầu xác định mất đoạn ở sY84. ....................................................................................................................... 48 KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AZF : Azoospermia factor (Yếu tố gây vô tinh) BN : Bệnh nhân CS : Cộng sự ICSI : Intra Cytoplasmic sperm Injection (Phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) ITT : Ít tinh trùng KCTT : Không có tinh trùng NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SCOS : Sertoni cell only syndorome (Hội chứng chỉ có tế bào Sertoli) SRY : Sex determin region Y chromosome (Vùng xác định giới tính trên NST Y) STS : Sequence tagged site (Vị trí gắn trình tự) TESE : Testicular sperm extraction ( Phẫu thuật xẻ tinh hoàn) WHO : World Health Oganization (Tổ chức y tế thế giới) MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, vô sinh đã trở thành một trong những vấn đề sức khỏe sinh sản gây ảnh hưởng tới cuộc sống hạnh phúc của rất nhiều cặp vợ chồng và là một vấn đề lớn của toàn xã hội. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy khoảng 10%- 15% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh [25]. Theo một nghiên cứu đa trung tâm của Tổ chức y tế thế giới, gần 50% các trường hợp vô sinh có nguyên nhân do nam giới [25]. Trong các nguyên nhân vô sinh do nam thấy có khoảng 10%- 15% trường hợp không có tinh trùng (KCTT) và 5 % ít tinh trùng (ITT) là do bất thường về mặt di truyền [10]. Việc chẩn đoán nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới là một trong những yêu cầu bắt buộc trước khi tiến hành điều trị và hết sức cần thiết để thực hiện tư vấn di truyền. Các kỹ thuật xét nghiệm tinh dịch đồ đã giúp phát hiện những trường hợp vô sinh nam là do KCTT hoặc ITT. Tuy nhiên, nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền gây ra KCTT và ITT ở rất nhiều bệnh nhân vô sinh nam nhiều khi không được phát hiện để giải quyết định hướng điều trị và tư vấn di truyền. Trong những năm gần đây, di truyền học người là lĩnh vực phát triển mạnh và có rất nhiều thành tựu. Lĩnh vực di truyền y học nghiên cứu ở cả hai mức độ tế bào và phân tử đã giúp cho các thầy thuốc lâm sàng tìm hiểu thêm được những nguyên nhân KCTT hoặc ITT dẫn đến vô sinh nam giới. Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào và kỹ thuật nhuộm tiêu bản nhiễm sắc thể (NST), đặc biệt là kỹ thuật nhuộm băng ngày càng phát triển và cải biến không ngừng đã giúp cho các nhà di truyền học phát hiện được các biểu hiện rối loạn số lượng và cấu trúc NST. Với việc áp dụng phương pháp nhuộm NST đã giúp phát hiện hội chứng Klinefelter là nguyên nhân hàng đầu gây ra vô sinh ở nam giới [53]. Bên cạnh đó, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới do mất đoạn nhỏ (microdeletion) trên nhánh dài của NST Y đang trở nên phổ biến trên thế giới. Mất đoạn nhỏ trên NST Y chủ yếu xảy ra ở vùng AZF (azoospermia factor) trên nhánh dài của NST Y (Yq), là nơi có chứa nhiều gen liên quan tới quá trình sinh tinh, được coi là nguyên nhân bất thường di truyền thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh ở nam giới [53]. Phát hiện được những mất đoạn trên NST Y sẽ cung cấp thêm bằng chứng và sự hiểu biết đầy đủ về bất thường di truyền liên quan đến vô sinh nam giới [18]. Những hiểu biết này sẽ trợ giúp cho việc chẩn đoán chính xác và điều trị, đặc biệt tư vấn cho những bệnh nhân ITT áp dụng kỹ thuật vi tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI- Intra Cytoplasmic Sperm Injection), vì những bệnh nhân có mất đoạn NST Y nếu điều trị ICSI thành công vẫn có thể truyền những mất đoạn đó cho con trai của họ và làm tăng nguy cơ vô sinh cho thế hệ sau [44], [45]. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ mất đoạn nhỏ NST Y ở bệnh nhân nam không có hoặc ít tinh trùng là khác nhau tùy từng chủng tộc người, phân bố các loại đứt đoạn cũng khác nhau. Ở Việt Nam cho đến nay chưa có nghiên cứu sâu rộng về lĩnh vực này. Với mong muốn góp phần nhỏ vào công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản, đặc biệt trong tìm hiểu nguyên nhân vô sinh nam giới do rối loạn di truyền, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ NST Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng” Với mục tiêu: - Đánh giá tỷ lệ bất thường NST ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng. - Hoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn vùng AZF trên NST Y bằng kỹ thuật Multiplex PCR và phân bố mất đoạn vùng AZF trên NST Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vấn đề vô sinh và vô sinh ở nam giới Cho đến nay, có nhiều định nghĩa về vô sinh đã được đưa ra, trong đó định nghĩa của TCYTTG (WHO) được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới [52]: Vô sinh là hiện tượng không có khả năng có thai của cặp vợ chồng sau ít nhất mười hai tháng quan hệ tình dục mà không dùng bất kỳ biện pháp tránh thai nào. Định nghĩa của TCYTTG dựa trên nghiên cứu cho thấy khả năng có thai ở mỗi chu kỳ kinh của nữ là 20%, và trong một năm là 85- 90%. Có thể phân loại vô sinh dựa vào tình trạng đã từng có thai hay chưa của một cặp vợ chồng: -Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là vô sinh xảy ra ở các cặp vợ chồng chưa có thai lần nào. -Vô sinh thứ phát (vô sinh II) là vô sinh xảy ra ở các cặp vợ chồng đã có thai, nhưng nay không thể mang thai trở lại sau một năm chung sống, sinh hoạt tình dục không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào. Bên cạnh đó có nhiều nghiên cứu thống kê tỷ lệ vô sinh theo đối tượng gây vô sinh: vô sinh do nam giới, vô sinh do nữ giới, vô sinh do cả nam và nữ. Nội dung đề tài chỉ đề cập tới trường hợp vô sinh do nam giới. Vô sinh nam giới là trường hợp của một cặp vợ chồng vô sinh mà nguyên nhân do người chồng, người vợ hoàn toàn bình thường. Theo WHO (1999) trong các nguyên nhân gây vô sinh nam giới thì có đến 90% là do bất thường tinh trùng tức là có liên quan trực tiếp đến tinh dịch đồ [66]. Cho đến nay, phương pháp chính xác để chẩn đoán vô sinh nam giới thường dựa trên kết quả tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của WHO, bao gồm các chỉ số về thể tích tinh dịch, mật độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng di động, tỷ lệ tinh trùng bình thường... Tiêu chuẩn thực hiện và đánh giá của WHO hiện đang được áp dụng ở hầu hết các cơ sở xét nghiệm tinh dịch trên thế giới. Bảng 1.1: Tiêu chuẩn xét nghiệm tinh dịch đồ theo WHO [66] Chỉ số Giá trị bình thƣờng Thể tích tinh dịch ≥ 2.0 ml pH ≥ 7.2 Mật độ tinh trùng ≥20 x 106 tinh trùng/ ml Tổng số tinh trùng ≥ 40 x 106 tinh trùng/ một lần xuất tinh Di động ≥ 50% di động tịnh tiến hoặc ≥ 25% di động nhanh sau 60 phút Hình thái bình thƣờng ≥ 30% Khả năng sống ≥ 75% hoặc hơn Tế bào bạch cầu < 106/ ml Màu sắc Trắng sữa Thời gian hóa lỏng ≤ 30 phút Phản ứng kháng globulin hỗn hợp < 50% tinh trùng di động với hạt kết dính Xét nghiệm miễn dịch < 50% tinh trùng di động với hạt kết dính Bất thường số lượng tinh trùng thường gặp là các trường hợp vô sinh do không có tinh trùng (KCTT) hoặc ít tinh trùng (ITT). Theo WHO, vô sinh nam giới do KCTT (azoospermia) là tình trạng không tìm thấy tinh trùng trong tinh dịch khi xuất tinh, thường do tinh hoàn không sản xuất được tinh trùng. ITT (oligospermia) là tình trạng số lượng tinh trùng ít hơn 20 triệu tinh trùng/ml tinh dịch. ITT mức độ nặng (severe oligospermia): là tình trạng số lượng tinh trùng ít hơn 5– 6 triệu tinh trùng/ml tinh dịch. Dựa trên tiêu chuẩn của WHO (1999), nếu tinh dịch đồ bất thường phải xét nghiệm lại lần thứ hai cách lần thứ nhất ít nhất hai tuần và xa nhất dưới ba tháng. Tuy nhiên các chỉ số này có thể thay đổi tùy thời điểm lấy mẫu, kỹ thuật và tiêu chuẩn đánh giá. Ngoài ra có những trường hợp các chỉ số cơ bản của tinh dịch đồ nằm trong giới hạn bình thường nhưng người này vẫn vô sinh do suy giảm chức năng tinh trùng, hoặc có những trường hợp không bình thường nhưng bệnh nhân nam vẫn có con bình thường [66]. Vô sinh nam giới là một vấn đề sức khỏe sinh sản nghiêm trọng trên toàn thế giới, theo nghiên cứu ở các nước phương Tây thì vô sinh nam giới chiếm tới 20% [65]. Tại Pháp, tỷ lệ vô sinh chiếm 13,5% các cặp vợ chồng. Tại Mỹ (1995) có khoảng 10% số cặp vợ chồng vô sinh khi đang ở trong độ tuổi sinh đẻ [12]. Theo nghiên cứu của Ali Hellani, có khoảng 10- 15% cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân do nam giới chiếm 50% và khoảng 30-40% vô sinh nam giới không rõ nguyên nhân [15]. Ở một nghiên cứu khác, Krauz và cộng sự cho rằng nguyên nhân gây vô sinh nam giới chiếm khoảng 50%. Trong đó, khoảng 40-50% nam giới này vô sinh là do bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [33]. Theo nghiên cứu của D. Stewart Irvine (2002) thì vô sinh là một vấn đề phổ biến thế giới, chiếm 14%- 17% ở các cặp vợ chồng, trong đó vấn đề vô sinh ở nam giới khó được xác định [29] Nhìn chung, theo các tác giả ở tùy từng nước, tỷ lệ vô sinh dao động từ 10%20% trong tổng số các cặp vợ chồng trong tuổi sinh đẻ. Tại Việt Nam, theo một số công trình nghiên cứu thì tỷ lệ vô sinh có xu hướng tăng. Điều tra dân số năm 1980, tỷ lệ này chỉ ở mức 7%-10%, năm 1982, tỷ lệ vô sinh lên đến 13%, trong đó vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36%, và 10% vô sinh không rõ nguyên nhân [8]. Nghiên cứu của Nguyễn Khắc Liêu và cs tại Viện Bảo vệ bà mẹ và trẻ sơ sinh từ năm 1993- 1997 cho thấy vô sinh nữ giới chiếm 54,5%, vô sinh nam chiếm 35,6%, vô sinh không rõ nguyên nhân là 10% [7] Ngô Gia Hy (2000) đã nhận định rằng trong số các cặp vợ chồng bị vô sinh thì nguyên nhân do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai vợ chồng là 10% [6]. Theo Phan Văn Quyền (2000) tỷ lệ vô sinh từ 10- 15% [11] Năm 2002 theo nghiên cứu của Trần Thị Trung Chiến và các cộng sự tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng 15% trong đó vô sinh do nam giới chiếm đến 40.8% nguyên nhân gây vô sinh [3]. Theo báo cáo của Trần Thị Phương Mai (2001), vô sinh nguyên nhân do nữ giới thường chiếm khoảng 30- 40% các trường hợp. Vô sinh nam giới chiếm khoảng 30% các trường hợp. Khoảng 20% các trường hợp tìm thấy nguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng. Bên cạnh đó, có khoảng 20% các cặp vợ chồng chưa xác định nguyên nhân gây vô sinh [8]. Nhìn chung, theo thống kê của các tác giả nghiên cứu ở Việt Nam đều cho rằng nguyên nhân gây vô sinh do nam giới chiếm tỷ lệ gần bằng với vô sinh do nữ giới. Với các số liệu nêu trên, rõ ràng vô sinh nói chung và vô sinh nam giới nói riêng đang là một vấn đề lớn trong y học và xã hội ở Việt Nam. 1.2. Các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới 1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới Vô sinh nam giới có thể có rất nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết các nguyên nhân dẫn đến hậu quả là người nam giới KCTT, ITT mức độ nhẹ hoặc nặng, bất thường về hình thái tinh trùng... Theo de Kretser (1997) nguyên nhân của vô sinh nam giới có thể được chia thành ba nhóm: trước tinh hoàn, tại tinh hoàn và sau tinh hoàn [22]. -Trước tinh hoàn: do thiểu năng tuyến sinh dục, do rối loạn cương hoặc không xuất tinh được,... -Tại tinh hoàn: do bất thường NST, hội chứng tinh hoàn ẩn, do nhiễm trùng, do các tác nhân kháng tinh trùng, do miễn dịch, không rõ nguyên nhân,... -Sau tinh hoàn: do tắc nghẽn, do tinh trùng giảm vận động, nhiễm trùng tuyến phụ, do miễn dịch,... Theo WHO (1999) [66] các nhóm nguyên nhân gây vô sinh nam giới gồm: rối loạn về tình dục và phóng tinh, miễn dịch, bất thường tinh dịch, bệnh lí toàn thân, tổn thương tinh hoàn mắc phải, do tắc nghẽn, không rõ nguyên nhân. Dựa vào đặc điểm các nguyên nhân gây vô sinh ở nam có thể chia thành các nhóm nguyên nhân chính sau: -Nguyên nhân không di truyền: + Liên quan đến bất thường của cơ quan sinh dục: Giảm khả năng cung cấp tinh trùng, xuất tinh trào ngược bàng quang, nghẽn tắc ở mào hay ống dẫn tinh, xơ hóa nang, không thể xuất tinh, lỗ niệu đạo lạc chỗ, tinh trùng vận động kém, tinh trùng có cấu trúc không bình thường, ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh cho noãn, giãn tĩnh mạch, không có tinh hoàn, suy tuyến sinh dục, tinh hoàn lạc chỗ. + Không liên quan tới bất thường cơ quan sinh dục. Do bệnh tật: Ung thư đang được điều trị, tình trạng chấn thương, các bệnh tiểu đường, bệnh ở tuyến giáp trạng, HIV/AIDS, hội chứng Cushing, thiếu máu, nhồi máu cơ tim, suy gan, suy thận… đều ảnh hưởng xấu đến khả năng sinh sản, bệnh tự miễn dịch, nhiễm khuẩn, Stress, béo phì, nghiện rượu, ma túy, thuốc lá hay tác động xấu của các yếu tố môi trường như nhiệt độ, hóa chất... -Nguyên nhân di truyền: + Do rối loạn mức độ NST: hội chứng Klinefelter (47,XXY); 45,OY; nam giới 46,XX;... rối loạn cấu trúc NST do chuyển đoạn Robertson,... + Do rối loạn ở mức độ phân tử: mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST Y. + Do một số nguyên nhân chưa xác định. 1.2.2 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do rối loạn di truyền ở mức độ NST Bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riêng được coi là một trong những nguyên nhân gây ITT hoặc KCTT, đôi khi do không được chẩn đoán xác định nên thường được xếp vào nhóm KCTT không rõ nguyên nhân. Một loạt các bất thường về di truyền gây bất thường quá trình sinh tinh hậu quả làm suy giảm khả năng sinh sản của nam giới. Theo 9 cuộc khảo sát trên 9.448 trường hợp vô sinh nam không tinh trùng hoặc thiểu tinh cho thấy 5,75% trường hợp có bất thường nhiễm sắc thể. Trong các trường hợp bất thường nhiễm sắc thể này thì bất thường nhiễm sắc thể giới tính là nổi bật ở những bệnh nhân không tinh trùng và thiểu tinh nặng, chiếm tỉ lệ 4,2% trong khi bất thường về nhiễm sắc thề thường chỉ chiếm 1,5% trường hợp khảo sát (Bảng 1.2). Theo các dữ liệu được thu thập từ những cuộc khảo sát về di truyền trên bệnh nhân không tinh trùng và các cuộc nghiên cứu di truyền trên các trường hợp thiểu tinh (tức là mật độ tinh trùng <20 triệu/ml) cho thấy những trường hợp có bất thường về di truyền chiếm tỉ lệ là 13,7% ở nhóm bệnh nhân không tinh trùng và 4,6% ở nhóm thiểu tinh [60]. Trong đó hội chứng Klinefelter (47,XXY) và Klinefelter khảm (47,XXY/46,XX) là nổi bật hơn cả, chiếm tỉ lệ 10,8% bệnh nhân không tinh trùng, còn các trường hợp bất thường nhiễm sắc thể giới tính khác và bất thường nhiễm sắc thể thường chỉ chiếm tỉ lệ 1,8% và 1,1% trong nhóm bệnh nhân không tinh trùng. Trong nhóm thiểu tinh thì bất thường nhiễm sắc thể thường chiếm 3%, còn bất thường nhiễm sắc thể giới tính chỉ chiếm 1,6% [60] Bảng 1.2: Tỷ lệ bất thƣờng NST khảo sát ở một số nghiên cứu Các tác giả Số Số Số Tổng trƣờng hợp vô sinh nam Koulischer L [32] Chandley AC [21] Zuffardi O [68] trƣờng hợp bất thƣờng nst thƣờng (%) số các trƣờng hợp bất thƣờng nst (%) 1.00 27 (2,7) 6 (0,06) 33 (3,3) 2.37 33 (1,4) 18 (0,7) 51 (2,1) 24 (6,7) 10 (2,8) 34 ( 9,5) 175 (6,9) 40 (1,6) 215 (8,6) 4 10 (2,9) 0 2 Abyholm T [14] trƣờng hợp bất thƣờng nst giới tính (%) 356 2.54 2 Abramsson L [13] 342 Micic M [40] 820 45 (5,5) 9 (1,1) 54 (6,6) Retief AE [49] 496 25 (5,0) 10 (2,8) 35 (7,0) Bourrouillou G [20] 952 65 (6,8) 33 (3,4) 98 (10,3) Bonduelle M [60] 568 2 (0,35) 12 (2,1) 14 (2,4) 402 (4,25) 142 (1,5) 544 (5,76) Tổng số 9.44 8 6 (1,8) (1,2) Trong số các nguyên nhân do bất thường NST giới tính, hội chứng thường gặp nhất là Klinefelter và các biến thể của hội chứng này. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng này thường không đặc hiệu vào thời kì trẻ nhỏ, bởi vậy chẩn đoán hội chứng này thường trong thời kì niên thiếu và trưởng thành: nam giới có tinh hoàn teo nhỏ, dáng người giống nữ, chứng vú to, FSH tăng cao và thường vô sinh do không có KCTT. Theo nghiên cứu của Simpson thì hội chứng Klinefelter thường là vô sinh do KCTT hoặc ITT [36], tuy nhiên theo Fossa (1971), Krausz và Forti (2000) nhận xét rằng một số ít bệnh nhân Klinefelter thể khảm có thể sinh tinh được nên vẫn có khả năng sinh sản nhưng thường suy giảm tinh trùng mức độ nặng [36]. Trung Thị Hằng (2007) khi nghiên cứu đặc điểm nhiễm sắc thể đồ của những người nam KCTT đã phát hiện ra 9/37 bệnh nhân có nhiễm sắc thể đồ bất thường, chiếm tỷ lệ 24% [4]. Như vậy cùng với sự phát triển của y học, các kỹ thuật di truyền ngày càng được cải tiến và phát triển, đã góp phần vào tìm ra nguyên nhân gây vô sinh nam giới là do bất thường bộ NST. Theo các tác giả nghiên cứu về bất thường NST có liên quan đến vô sinh nam giới đều cho thấy bất thường NST ở những bệnh nhân này rất đa dạng. Trong đó có cả bất thường cả về số lượng và cấu trúc NST giới tính cũng như NST thường.Tuy nhiên có cả những trường hợp nam giới vô tính do KCTT hoặc ITT nhưng vẫn có nhiễm sắc thể đồ bình thường và không phát hiện được nguyên nhân nào khác thì cần được tiến hành nghiên cứu bất thường di truyền ở cấp độ phân tử. 1.2.3 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do mất đoạn trên vùng AZF của NST Y. Theo quan điểm của di truyền học thì sự sinh tinh chịu sự chi phối, điều khiển và phối hợp chính xác của khoảng 2.000 gen trong đó phần lớn trên NST thường và khoảng 30 gen trên NST giới tính Y [46]. NST Y nguyên vẹn là rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của hệ sinh sản ở nam giới. Gen SRY nằm trên nhánh ngắn của NST Y đóng vai trò quan trọng trong hình thành tuyến sinh dục thời kỳ phôi thai, bên cạnh đó NST Y còn chứa những vùng điều hòa sự sinh tinh. Nhánh dài của NST Y là một bộ phận đặc biệt trên NST Y mang gen có vai trò này. Quá trình sinh tinh là một quá trình phức tạp kéo dài khoảng 70 ngày bao gồm sự phát triển và biệt hóa liên tục của các tế bào dòng tinh. Trong giai đoạn đầu tiên, các tinh nguyên bào phân chia gián phân liên tục để tạo ra các tinh bào một. Các tinh bào một tiếp tục phân chia giảm phân lần thứ nhất để tạo ra tinh bào hai. Đến lượt mình, các tinh bào hai phân chia giảm phân lần thứ hai để tạo ra các tinh tử dạng tròn. Sau khi giảm phân hoàn thành, tinh tử sẽ được biệt hóa thành các tinh trùng với các đặc trưng: thân được kéo dài ra, NST được nén gọn lại, histone được thay thế bằng protamine, bào tương được loại bớt, đuôi được hình thành [5]. Việc phát hiện ra các gen điều khiển quá trình sinh tinh trên NST Y đã mở ra một lĩnh vực nghiên cứu mới về quá trình sinh tinh. Ngày nay, cấu trúc NST Y, trình tự cũng như số lượng gen trên NST Y đã được làm sáng tỏ. Theo đó, NST Y có tổng kích thước là 60Mp, phần gen giả chiếm 3Mp, còn lại 57Mp của vùng dị nhiễm sắc là nhiễm sắc thực, hầu hết các gen thuộc vùng nhiễm sắc thực. Vùng nhiễm sắc thực có kích thước 23Mp bao gồm 8Mp phần vai ngắn và 14.5Mp ở phần vai dài. Các trình tự thuộc vùng nhiễm sắc thực gồm có 3 nhóm: Nhóm thứ nhất là nhóm được chuyển vị từ NST X trong quá trình tiến hóa (Xtransposoned), nhóm thứ 2 là nhóm có trình tự tương đồng trên NST X (X – degenrate) và nhóm thứ 3 là nhóm bao gồm các trình tự lặp lại phần đầu gần thuộc vai ngắn của NST Y (Yp) và hầu hết phần vai dài Yq. Tổn thương trên NST Y có thể gặp các loại: mất đoạn lớn, mất đoạn nhỏ và mất đoạn một phần. Tổn thương mất đoạn lớn của NST Y liên quan tới nhiều gen. Ngoài ra, một kiểu hình có thể gây ra bởi nhiều mất đoạn hoặc đột biến khác nhau, do đó khó xác định chính xác nguyên nhân của một số kiểu hình vô sinh [10] Tổn thương mất đoạn nhỏ trên NST Y là một nguyên nhân hay gặp của vô sinh nam. Tổn thương mất đoạn nhỏ được định nghĩa là những mất đoạn NST trên vài gen nhưng không đủ lớn để có thể phát hiện bằng phương pháp di truyền tế bào thông thường [54]. Mất đoạn nhỏ xảy ra chủ yếu ở một vùng đặc biệt trên nhánh dài của NST Y (Yq). Tiepolo và cs (1976) khi nghiên cứu hình ảnh NST của các bệnh nhân vô sinh nam đã cho rằng nhất định phải có một yếu tố gây vô tinh về mặt di truyền mà họ gọi là “yếu tố vô tinh”: Azoospermia factor nằm trên nhánh dài của NST Y [62]. Năm 1995, Reijo và cs đã xác định được vị trí của vùng AZF ở phần xa Yq11 và đặt tên là vùng AZF [48]. Năm 1996 khi nghiên cứu trên 370 bệnh nhân vô tinh và thiểu tinh nặng, Vogt và cs đã phát hiện mất đoạn ở 13 bệnh nhân. Các mất đoạn trên NST Y của bệnh nhân vô tinh và thiểu tinh nặng liên quan đến nhiều locus thuộc về 3 phân vùng khác nhau trên Yq11 được đặt tên là AZFa, AZFb, AZFc trên Yq. AZFa nằm ở phần gần, AZFb nằm ở phần giữa Yq11 còn AZFc nằm ở phần xa Yq11 và trùng với vùng AZF do Reijo và cs đã mô tả. Mất đoạn được phát hiện thấy ở 13/370 bệnh nhân. Trong đó mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất 7/13 trường hợp, sau đó là mất đoạn ở AZFa và AZFb đều chiếm 3/13 trường hợp [64]. Kent- First và cs (1999) đề nghị gọi phần nằm giữa AZFb và AZFc là AZFd [31]. Như vậy vùng AZF cũng có thể được chia thành 4 phân vùng: AZFa, AZFb, AZFc, AZFd. Tuy nhiên hầu hết các tài liệu đều sử dụng cách chia thành 3 phân vùng, với phân vùng AZFc bao gồm cả AZFd do Kent- First đề nghị. Hình 1.1 : Mô hình cấu trúc NST Y [16] Việc phân chia các vùng trên NST Y cũng khác nhau tùy thuộc vào cách phân chia của từng tác giả. Theo Vollrath và cs, vùng Yq 11 nằm ở vị trí 5A đến 5Q, 6A tới 6F, theo đó vùng Yq11 lại phân chia tiếp thành Yq11.21 và Yq11.22. Vogt và cs., lại sử dụng trình tự khác khi lập bản đồ NST Y. NST Y được phân chia thành 25 vùng từ D1 đến D25, trong đó vùng Yq11 thuộc D25. Lahn và Page (1997) đã phân chia gen trên vùng Yq11 thành 2 nhóm gen chính: Nhóm 1 bao gồm các gen có nhiều bản copy và chỉ có trên NST Y như: CDY, DAZ, RBM, TSPY, TTY1, TTY2; nhóm 2 gồm các gen có bản tương đồng trên NST X như: DBY, DFFRY, EIF1AY, SMCY, UTY [39]. Qua các nghiên cứu mất đoạn trên các phân vùng AZFa, AZFb, AZFc các tác giả nhận thấy có 6 kiểu mất đoạn chính trên Yq: chỉ mất phân vùng AZFa hoặc AZFb hoặc AZFc, mất đoạn AZFb/c, mất cả 3 phân vùng AZFa/b/c và mất một phần AZFc, trong đó phổ biến nhất là mất đoạn AZFc và AZFb. Dưới đây chỉ ra 6 kiểu mất đoạn chính xảy ra ở vùng AZF trên NST Y và kiểu hình tương ứng. Hình 1.2: Phân loại mất đoạn trên vùng AZF [28]  Mất đoạn trên AZFa Vùng AZFa nằm ở vị trí khoảng 5, nhánh dài và ở gần tâm NST Y, kích thước của nó từ 1 đến 3Mp. Nhiều nhóm gen đã được xác định ở vùng này: DFFRY, USP9Y, DBY, UTY, TB4Y,...[33]. Mất đoạn nhỏ ở những gen riêng rẽ trên phân vùng AZFa chủ yếu liên quan tới gen USP9Y (ubiquitin- specific protease 9 Y chromosome) và gen DBY (Dead box on the Y) liên quan đến kiểu hình thay đổi của tinh hoàn. Tổn thương cả hai gen sẽ dẫn tới hội chứng chỉ có tế bào Sertoli (SCOS), biểu hiện bằng sự có mặt của tế bào Sertoli mà không có các tế bào dòng tinh trong các ống sinh tinh và không có tinh trùng trong tinh dịch. Gen DBY được coi là có vai trò đáng kể trong vô sinh vì nó có liên quan tới sự phát triển của tế bào dòng tinh trước phân bào giảm nhiễm [63]. Lardone và cộng sự (2007) khi nghiên cứu hoạt động sao mã của một số gen trên AZFa nhận thấy ở những bệnh nhân bị hội chứng SCO hoạt động sao mã của gen DBY giảm trong khi các gen khác vẫn hoạt động bình thường [37]. Gen USP9Y cũng liên quan đến quá trình sinh tinh. Gen USP9Y bị cắt ngắn hoặc bị mất đoạn gây ra vô tinh, thiểu tinh nặng và tinh trùng giảm vận động hoặc thiểu tinh. Nhưng dường như gen này chỉ liên quan tới hiệu quả quá trình sinh tinh vì nó có thể được truyền cho thế hệ sau [43]. Tuy nhiên cần nhiều nghiên cứu hơn nữa để làm sáng tỏ vai trò của mỗi gen trong quá trình sinh tinh.  Mất đoạn trên AZFb Phân vùng AZFb nằm giữa khoảng 5 và 6, kích thước của nó từ 1 đến 3 Mp. Có 5 nhóm gen được xác định ở vùng AZFb như: CDY, XKRY, SMCY, E1F- 1AY và RBMY1Y [33]. Phân vùng AZFb có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh sản, mất đoạn của vùng này gây dừng quá trình sinh tinh tại giai đoạn tinh bào 1. Gen chủ yếu trên AZFb là RBMY (RNA binding motif on the Y) có 6 bản sao. Đáng chú ý nhất là RBMY1, gen này mã hóa cho một protein gắn RNA. Theo nghiên cứu của Lavery và cộng sự (2007) biểu hiện của gen RBMY1 giảm ở các bệnh nhân vô tinh [38]. Ở một nghiên cứu khác, một nhóm gen khác là PRY (PTA-BL related Y) cũng được tìm thấy ở vùng AZFb. Các gen PRY liên quan đến việc điều khiển quá trình chết theo chương trình, một quá trình quan trọng có tác dụng loại bỏ những tinh trùng bất thường. Trong trường hợp phá hủy tất cả các gen tại phân vùng AZFb ngoại trừ RBMY và PRY, bệnh nhân sẽ bị giảm sinh tinh. Tuy nhiên, nếu cả hai gen RBMY và PRY bị phá hủy, quá trình sinh tinh sẽ bị dừng hoàn toàn [61]. Điều đó chứng tỏ RBMY và PRY là những gen chính của vùng AZFb liên quan tới sinh tinh. Ferlin và cs đã tìm thấy mối liên quan giữa sự bất thường trong quá trình sinh tinh và mất đoạn một phần của vùng AZFb thuộc các gen: SMCY EIF-1AY, HSFY. Protein được mã hóa bởi bởi HSFY được tìm thấy trong tế bào Sertoli và tế bào sinh tinh [24]. Theo Huynh và cs (2002) thì mất đoạn nhỏ trên AZFb liên quan chủ yếu đến gen E1F-1AY và RBMY1Y [59] Mất đoạn ở phân vùng AZFb thường xảy ra hơn so với AZFa nhưng cũng chiếm một tỷ lệ nhỏ ở những người không có tinh trùng [46]. Mất đoạn hoàn toàn phân vùng AZFb và AZFb/c đã được mô tả bởi hình ảnh mô học tinh hoàn (hội chứng tế bào Sertoli đơn thuần) và dẫn đến suy giảm quá trình sinh tinh. Một số báo cáo cho thấy, tương tự như mất đoạn hoàn toàn phân vùng AZFa, người ta cũng không tìm thấy tinh trùng khi tách bằng kỹ thuật TESE. Cũng như mất đoạn hoàn toàn trên vùng AZFa, chẩn đoán mất đoạn hoàn toàn vùng AZFb và AZFb/c là phù hợp với việc không nên khuyên những bệnh nhân này tìm tinh trùng để tiến hành kỹ thuật ICSI.  Mất đoạn thuộc AZFc Phân vùng AZFc cũng chứa các gen liên quan tới quá trình sinh tinh, trong đó gen có vai trò được nghiên cứu nhiều hơn cả là gen DAZ (deleted in azoospermia). Gen DAZ có 4 bản sao trên NST Y. Những gen DAZ này được cho là có nhiều vai trò trong suốt quá trình sinh tinh, vì chúng được biểu hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của tế bào tinh. Các gen này có chức năng: điều khiển quá trình dịch mã, mã hóa cho các protein gắn RNA đặc hiệu cho các tế bào dòng tinh và tham gia điều khiển sự phân bào giảm nhiễm và duy trì quần thể tế bào dòng tinh nguyên thủy. Nghiên cứu của Reijo và cs (1995) cho thấy mất đoạn của gen DAZ có thể gây ra các kiểu hình từ thiểu tinh tới vô tinh [48]. Thêm vào đó, một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng sự biểu hiện ở gen DAZ giảm ở những bệnh nhân vô tinh [38]. Mất đoạn tại AZFc gây ra nhiều kiểu hình, trong đó chủ yếu là kiểu hình có liên quan tới lượng tinh trùng thấp do giảm quá trình sinh tinh. Theo KudoraKawaguchi và cs (2001), mất đoạn tại AZFc là nguyên nhân gây ra khoảng 12% các trường hợp vô tinh không do tắc nghẽn và 6% thiểu tinh nặng [34]. Nhiều bệnh nhân nam bị mất đoạn AZFc vẫn có thể thụ tinh được nhờ kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng chỉ có vùng AZFa, AZFb là cần thiết cho quá trình khởi động quá trình sinh tinh, nhưng nếu không có vùng AZFc thì quá trình sinh tinh sẽ không thể kết thúc bình thường [26]. Hopp và cs đã chứng minh, đối với những mất đoạn trên AZFa, AZFb, AZFb/c không có khả năng tách tinh trùng khi sử dụng kỹ thuật TESE. Trong khi đó, đối với những mất đoạn trên AZFc khả năng tách tinh trùng từ tinh hoàn thành công lên đến 75% [27]. Tương đồng với những kết quả nghiên cứu trên, Krausz đã phát hiện 50% xuất hiện tinh trùng ở trường hợp mất đoạn thuộc vùng AZFc và những mất đoạn thuộc vùng AZFa, AZFb hiếm khi tách được tinh trùng từ tinh hoàn [33]. Những nghiên cứu chỉ ra, ICSI kết hợp cùng với kỹ thuật TESE có thể sử dụng được ở những bệnh nhân KCTT nguyên nhân do mất đoạn nhỏ trên NST Y. Tuy nhiên trước khi tiến hành kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, các bệnh nhân vô tinh và thiểu tinh nặng cần phải được kiểm tra mất đoạn nhỏ để có được các tư vấn di truyền phù hợp. Trên thế giới có rất nhiều công trình khoa học và nghiên cứu về ảnh hướng của vi mất đoạn NST Y và vô sinh ở nam giới từ những thập niên 70 của thế kỷ XX. Tiepolo & Zuffardi (1976) đã công bố hình ảnh NST của 6 bệnh nhân nam bị tổn thương, sự thiểu tinh nặng được chẩn đoán bằng sinh thiết tinh hoàn. Cả 6 bệnh nhân nam giới vô sinh do bị mất đoạn ở nhánh dài của NST Y [58]. Sarah Girardi (1997) nghiên cứu ở Mỹ phát hiện tỷ lệ mất đoạn nhỏ NST Y là 7% ở những nam KCTT, 10% ở những nam giới có số lượng tinh trùng dưới 1 triệu/ml tinh dịch, 8% ở những nam giới có số lượng tinh trùng từ 1 đến dưới 5 triệu/ml tinh dịch [53]. Năm 2003, các kết quả nghiên cứu của F. Akbari Asbagh (Iran), Rima (Ấn Độ) lần lượt với tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên NST Y ở vô sinh nam giới là 5 % và 9,63 % [50]. Năm 2004, Mostafa nghiên cứu trên 33 bệnh nhân vô sinh nam giới ở Ai cập cũng phát hiện 12% có mất đoạn nhỏ trên NST Y [42].