Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max(L.) Merrill)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS. TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 04 năm 2015 TÁC GIẢ Lò Thanh Sơn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Chu Hoàng Mậu, PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, TS. Lâm Đại Nhân, TS. Nguyễn Trung Nam, TS. Nguyễn Thị Thuý Hường - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Bộ môn Di truyền&Sinh học hiện đại trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ ADN và ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp là thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh Hoá - Trường Đại học Tây Bắc đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 04 năm 2015 TÁC GIẢ Lò Thanh Sơn iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan...................................................................................................... i Lời cảm ơn ......................................................................................................... ii Mục lục .............................................................................................................. iii Danh mục những chữ viết tắt trong luận án ........................................................ iv Danh mục bảng trong luận án ............................................................................. v Danh mục hình trong luận án .............................................................................. vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 3 4. Những đóng góp mới của luận án ................................................................... 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án ............................................ 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 5 1.1. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ............................................................................. 5 1.1.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương ........................ 5 1.1.2. Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương ...................................... 7 1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT ........... 12 1.2.1. Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ ...................... 12 1.2.2. Expansin và cơ chế kéo dài rễ ................................................................... 14 1.3. CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG NHỜ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ....................................................... 25 1.3.1. Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương thông qua A.tumefaciens ..................................................................................................... 25 1.3.2. Cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương bằng chuyển gen liên quan đến bộ rễ............................................................................................................. 33 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 38 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................................................... 38 2.1.1. Vật liệu thực vật ....................................................................................... 38 2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector ...................................................... 39 2.1.3. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 39 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................ 39 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu .................................................................... 39 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 40 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 40 2.3.1. Phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ ...................................... 40 2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen ........................ 42 2.3.3. Phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1 ................................ 44 2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ........ 46 2.3.5. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen .................................... 51 2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu .................................................. 53 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................. 54 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU .................................................................................... 54 3.1.1. Sự kéo dài rễ chính của đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo ......... 54 3.1.2. Thể tích bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo ....................... 54 3.1.3. Khối lượng khô của bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo ..... 57 3.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG .................................................................................................... 59 3.2.1. Đặc điểm của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ một số giống đậu tương .................................................................................................................. 59 3.2.2. Sự đa dạng của trình tự vùng mã hoá gen EXP1 ở một số loài thực vật ..... 67 3.3. PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN GmEXP1 .............. 69 3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 ........................................................ 70 3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển gen GmEXP1 ...................................................................................................... 72 3.4. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ .............. 76 3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá nhờ A.tumefaciens ..................................................................................................... 76 3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 ................................................................................................................... 78 3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T1 ................................................................ 85 3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 ... 95 3.5.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ A.tumefaciens ..................................................................................................... 95 3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 ................................. 97 Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................... 100 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 109 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 112 PHỤ LỤC.......................................................................................................... 128 iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN ABA Abscisic Acid AS Acetylseringone bp base pairs cs Cặp bazơ nitơ Cộng sự CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy Ct Threshold of Cycle Ngưỡng chu kỳ DAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride DRE Dehydration Responsive Element Yếu tố điều hoà phản ứng với sự mất nước DREBs Dehydration Responsive Element Binding protein Protein gắn với DRE DREB factor Dehydration Responsive Element Binding - factor Yếu tố gắn với DRE DPBB Double Psi Beta-Barrel structure Vùng cấu trúc DPBB ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Xét nghiệm ELISA EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EXP Expansin Protein expansin EXP1 Expansin 1 Gen expansin 1 FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương thế giới GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang lục GM Germination Medium Môi trường nảy mầm GmEXP1 Glycine max expansin1 gene Gen expansin 1 ở đậu tương GUS β-Glucuronidase HRP Horse Radish Peroxidase IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MCS Multi Cloning Site Vùng cắt gắn đa vị MS Murashige và Skoog, 1962 Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp P5CR l-Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Reductase P5CS l-Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ rpm Revolution Per Minute Số vòng/phút RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine UTR UnTranslated Region Vùng không dịch mã WT Wild Type Kiểu dại X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside v DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN Trang Bảng 2.1. Thống kê một số giống đậu tương địa phương sử dụng làm vật liệu nghiên cứu .......................................................................................................... 38 Bảng 2.2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................... 39 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix ........................................ 42 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng ........... 43 Bảng 2.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn .......................................... 43 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI ....... 44 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI ............................. 45 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII.................................. 46 Bảng 2.9. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá ...................................... 48 Bảng 2.10. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84 .. 50 Bảng 2.11. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR......................................... 52 Bảng 2.12. Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR ........................ 52 Bảng 3.1. Chiều dài rễ chính của các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn ............................................................................................................. 55 Bảng 3.2. Thể tích bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn ..................................................................................................................... 55 Bảng 3.3. Khối lượng khô của bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn ...................................................................................................... 56 Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide trên gen EXP1 của đậu tương SL1 và DT84 ............................................................................................................. 67 Bảng 3.5. Thống kê một số trình tự gen EXP1 để phân tích đa dạng di truyền .... 68 Bảng 3.6. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N. tabacum.............................................................................................................. 78 Bảng 3.7. Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 .............................................. 83 Bảng 3.8. Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 so với cây T026 .................. 87 Bảng 3.9. Kết quả xác định sự khác biệt về mức độ biểu hiện phiên mã ở hai dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 bằng t-Test .................................................. 88 Bảng 3.10. Khối lượng chất khô của bộ rễ các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn ............................................................................................................. 91 Bảng 3.11. Thể tích bộ rễ thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn ............................... 93 Bảng 3.12. Chiều dài rễ chính của các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn....... 94 Bảng 3.13. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84 .... 97 vi DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN Trang Hình 1.1. Cấu trúc protein expansin suy diễn ...................................................... 20 Hình 1.2. Mô hình cấu trúc 3D protein α-expansin1 của đậu tương ................... 20 Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào thực vật ............................................................ 21 Hình 1.4. Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin ............................ 24 Hình 1.5. Sơ đồ các phương pháp phân tích cây chuyển gen ............................... 29 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ................................................................. 41 Hình 2.2. Sơ đồ phát triển vector chuyển gen mang gen GmEXP1 ...................... 45 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm .... 49 Hình 3.1. Mối quan hệ giữa các giống đậu tương nghiên cứu dựa trên dữ liệu về sự phát triển bộ rễ trong điều kiện gây hạn nhân tạo....................................... 56 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1; colony-PCR chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp và sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng BamHI ................................................................................................ 60 Hình 3.3. So sánh trình tự gen GmEXP1_cDNA của Ngân hàng gen quốc tế (AF516879) và của bảy giống đậu tương nghiên cứu .......................................... 63 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự DNA và cDNA của gen GmEXP1 phân lập từ giống SL1....................................................................................................... 65 Hình 3.5. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide đoạn mã hoá của gen EXP1 ở một số loài thực vật .............................................. 69 Hình 3.6. Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI và sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pRTRA7/3_GmEXP1 .................................................................................. 70 Hình 3.7. Sơ đồ sản phẩm cắt plasmid bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen GmEXP1 và hình ảnh điện di sản phẩm DNA đích đã tinh sạch từ vector pCB301 cắt bởi HindIII ...................................................................................... 72 Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR bằng mồi SoyEXP1F_NcoI/SoyEXP1R_NotI chọn dòng vi khuẩn E.coli và A.tumefaciens mang vector chuyển gen ............................................................. 74 Hình 3.9. Sơ đồ kiểm tra gen GmEXP1 trên vector chuyển gen bằng NotI ......... 75 Hình 3.10. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen ........................................................................................................ 77 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen GmEXP1 trong các cây thuốc lá chuyển gen ....................................................... 78 Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen GmEXP1 trong các cây thuốc lá chuyển gen ...................................................... 79 Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của các cặp mồi chuẩn bị cho phản ứng Real-time RT-PCR trên các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 ........... 81 Hình 3.14. Đồ thị ngưỡng nhiệt, và đồ thị phân tích nhiệt độ nóng chảy của hai gen GmEXP1 và actin ở các mẫu thuốc lá chuyển gen T0 trong phản ứng Realtime RT-PCR...................................................................................................... 82 Hình 3.15. Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 ............... 84 Hình 3.16. Hạt thuốc lá gieo trên môi trường MS không kháng sinh và có kháng sinh chọn lọc kanamycin ......................................................................... 85 Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ gen GmEXP1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 ............................................................................. 86 Hình 3.18. Biểu đồ so sánh tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 so với mẫu cây chuyển gen T026 ....................................... 88 Hình 3.19. Kết quả lai Western các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 ............. 89 Hình 3.20. Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuốc lá và so sánh hình thái rễ cây có tưới nước và cây không tưới nước ở giai đoạn 5 ngày gây hạn ..... 90 Hình 3.21. Hình ảnh minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen ......................................................................................................... 96 Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển GmEXP1 trong các cây đậu tương chuyển gen ................................................... 98 Hình 3.23. Kết quả lai Western trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 ..... 99 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Hạt có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin...) và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K...) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Hạt đậu tương được sử dụng trực tiếp làm thực phẩm cho con người, làm thức ăn cho gia súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao trên thế giới. Đậu tương là cây trồng cải tạo đất. Thân lá để lại trong đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên đất. Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ... Ngoài những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản xuất nông nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Theo thống kê của FAO, năng suất đậu tương trên thế giới giảm khoảng 11,13% trong ba năm trở lại đây. Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Khô hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn của cây đậu tương. Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% năng suất hạt đậu tương so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa. Chính vì vậy chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết và mang tính thời sự trên thế giới cũng như ở Việt Nam. 2 Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và sự phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Thực vật có bộ rễ phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới những lớp đất sâu sẽ có cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện khô hạn. Đồng thời, sự điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những cơ chế tích luỹ chất khô, tăng cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp và trao đổi ion... cũng giúp thực vật dễ dàng lấy được lượng nước ít ỏi trong đất. Mặt khác, trong điều kiện hạn, thực vật còn có một loạt các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước, tăng cường tích nước tế bào… Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật dưới điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên... được xem là biện pháp hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương. Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay. Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công nghệ gen được coi là biện pháp có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao. Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ bằng kỹ thuật chuyển gen. 2.2. Mục tiêu cụ thể (i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu tương địa phương. 3 (ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương. (iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen. (iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển kéo dài rễ. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ. (2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen này từ cây đậu tương. (3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ. (4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1. Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế hệ T1 trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ. (5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương Việt Nam. Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được mức độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1. 4 Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng. Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam. Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. Về mặt thực tiễn Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn. Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam. 5 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN 1.1.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương 1.1.1.1. Cây đậu tương Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill (2n = 40) thuộc họ Đậu (Fabaceae). Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc giống phụ G.Soja, chi Glycine. Hiện nay, đậu tương trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội [3], [8]. Đậu tương là loại cây trồng thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ bên, trên có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm của không khí. Thân tròn, mang 8 - 14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân... Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có màu trắng hay tím. Thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Quả đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen. Hạt đậu tương có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt; vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen... [2], [3]. Cây đậu tương là cây trồng ngắn ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ... rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp để khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới. Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn. Yêu cầu về độ ẩm đồng ruộng trung bình là 50 - 60%, giai đoạn ra hoa, hình thành quả phải đạt 70 80% nên đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng có nhu cầu về nước cao [2], [14]. Đối với ngành trồng trọt, đậu tương có khả năng tích luỹ đạm của không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt sần ở bộ rễ và sinh khối thân, cành lá. Các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hoá 6 học và tăng độ phì nhiêu cho đất. Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu tương có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống nạn ô nhiễm do lạm dụng phân bón hoá học và thuốc trừ sâu [2], [5]. 1.1.1.2. Tác động của hạn đối với cây đậu tương Đậu tương tuy là cây trồng cạn nhưng cần nhiều nước cho quá trình sinh trưởng và phát triển để có thể cho năng suất cao. Nhu cầu về nước tăng theo thời gian sinh trưởng của cây cùng với sự tăng trưởng mạnh của thân, lá. Quá trình sinh trưởng của cây phụ thuộc vào cường độ quang hợp, hiệu suất quang hợp, tổng diện tích lá và thế năng quang hợp (thời gian lá xanh). Tổng sản phẩm quang hợp của cây nếu bị thiếu nước sẽ giảm do tỷ lệ CO2 hấp thụ trên một đơn vị diện tích lá giảm và diện tích quang hợp giảm do sự phát triển của lá kém và chóng tàn [84]. Thiếu nước trầm trọng ảnh hưởng tới sự hình thành diệp lục dị hình, giảm sự vận chuyển điện tử trong quang phosphoryl hoá, ảnh hưởng hoạt tính các enzyme khác tham gia vào quá trình đồng hoá carbon. Từ đó dẫn tới giảm hiệu quả quang hợp và sự tích luỹ chất khô của cây [57], [84]. Nước rất cần cho sự phát triển bình thường của cây đậu tương cả giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ sử dụng nước ở pha nảy mầm và cây con thấp do tán còn nhỏ. Nhu cầu nước tăng dần khi cây đạt 3 - 5 lá kép, tăng nhanh khi bắt đầu bước vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, cây rất nhạy cảm với tình trạng thiếu nước. Phần lớn biến động về năng suất là do biến động về lượng nước cho cây trong thời kỳ ra hoa đậu quả. Ở giai đoạn ra hoa, đậu quả nếu thiếu nước, hoa và quả non bị rụng nhiều. Giai đoạn quả phát triển và hạt vào mẩy cần nhiều nước nhất, thiếu nước ở giai đoạn này sẽ dẫn đến giảm kích thước hạt, năng suất giảm đáng kể. Nếu thiếu nước xảy ra trước giai đoạn hạt phát triển, sau đó đủ nước thì quang hợp có thể phục hồi, sinh trưởng có thể trở lại bình thường và hạt có thể phát triển tới kích thước bình thường [5]. Theo Manavalan và cs (2009), năng suất của đậu tương giảm từ 32 đến 44% nếu gây hạn ở giai đoạn làm hạt [84]. 7 Khả năng cố định đạm ở các loài cây họ Đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất. Mất quá nhiều nước, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng cố định CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định đạm cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng, làm giảm sinh tổng hợp protein [101]. Quá trình cố định đạm giảm một phần do lượng sản phẩm quang hợp chuyển về rễ giảm, một phần do ảnh hưởng trực tiếp của thế nước ở trong nốt sần. Theo Huang và cs (1975), hoạt động cố định đạm giảm khi thế nước giảm và ngừng lại khi trọng lượng nốt sần giảm dưới 80% so với khi đủ nước [58]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định đạm trong điều kiện hạn đã được xác định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2 giảm, nguồn carbon tới các nốt sần giảm, hoạt tính của enzyme tổng hợp sucrose giảm, hàm lượng ure và amino acid tự do tăng. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình quang hợp giảm khoảng 5% [69]. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần [111]. 1.1.2. Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương 1.1.2.1. Đặc điểm kiến trúc bộ rễ liên quan đến sự hấp thu nước Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu tương, sự thích nghi với các điều kiện khô hạn chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu. Hệ thống rễ phát triển giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao, giàu dinh dưỡng [59]. Đậu tương là thực vật hai lá mầm có hệ rễ cọc phát triển gồm một rễ cái và nhiều rễ bên. Rễ cái phát triển dài ăn xuyên vào lòng đất từ 30 - 50 cm. Rễ bên phát sinh quanh cổ rễ, lan toả theo bề ngang xung quanh gốc, hút nước và khoáng trên tầng đất mặt chừng 15 - 25 cm. Bộ rễ của đậu tương phát triển rất khoẻ theo từng giai đoạn và cho thu hoạch thì rễ mới ngừng phát triển [5].