Tài liệu NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ HOÀN KIẾM, HÀ NỘI

®¹i häc quèc gia hµ néi VIÖN VI SINH VËT Vµ C¤NG NGHÖ sinh häc -----o0o----- BÁO CÁO ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT CẤP ĐHQG ®Ò tµi nghiªn cøu khoa häc 2007-2008 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ HOÀN KIẾM, HÀ NỘI Mã số: QG.07.24 Chñ tr× ®Ò tµi : NguyÔn ThÞ Hoµi Hµ Hµ néi - 2008 BÁO CÁO TÓM TẮT 1. Tên đề tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội 2. Các thành viên tham gia đề tài Chủ trì đề tài - Họ và tên: Nguyễn Thị Hoài Hà Các thành viên: Lƣu Thị Thùy Giang Nguyễn Quang Huy Lê Trung Thủy Phạm Thị Bích Đào Trần Thị Điệp 3. Tóm tắt tổng quan của đề tài Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn tới sự phát triển thƣờng xuyên và không bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu hệ động thực vật sống trong hồ. Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là microcystin.. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme protein phosphatases (nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu lên hai loại protein serine và threonin phosphatases. Đã có một số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con ngƣời. Microcystin thƣờng tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc. Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội. 4. Mục tiêu của đề tài * Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam Microcystis trong Bảo tang Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN. * Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn. 5. Tóm tắt nội dung nghiên cứu của đề tài - Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nƣớc hồ Hoàn Kiếm tại thời điểm thu mẫu. - Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng Microcystis. - Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc. - Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC). - Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc). 6. Kết quả chính của đề tài - Hồ Hoàn Kiếm đang ở tình trạng ô nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD vƣợt tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần. Với giá trị NH4+ từ 0,1290,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO43- từ 0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P khá cao. - Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi Microcystis theo phƣơng pháp của Shirai có cải tiến. Môi trƣờng thạch agarose B12 với tỷ lệ 0,4% là môi trƣờng thích hợp nhất cho việc phân lập Microcystis. - Các chủng Microcystis đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng Bold 3N với số lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Đặc biệt chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 19. Trên môi trƣờng J, các chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào của các chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ×106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Trong đó chủng LT2 vẫn phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao nhất 76,46 × 106 tế bào/ml sau ngày thứ 19. Trên môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tế bào/ml sau 12 đến 15 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng này chủng LT8 phát triển với mật độ tế bào đạt cao nhất 54,78 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 15. - Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng Microcystis LT2 và LT8. trong đó thành phần axit palmitic (C16H32O2) chiếm lƣợng lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là 0,9683 μg/mg trọng lƣợng khô. Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lƣợng của 7 loại axit béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8. - Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học và phƣơng pháp phân loại hiện đại dựa trên phân tích trình tự rADN 16S, 2 chủng vi khuẩn LT 2, LT8 đƣợc xác định là Microcystis aeruginosa, 2 chủng vi khuẩn nƣớc N4 và N7 đƣợc xác định thuộc các loài Sphingomonas mali và Sphingomonas asaccharolytica - Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn nhất là 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô, độc tố MC – YR là 236,8 ng/mg và thấp nhất là độc tố MC – LR: 114,25 ng/mg. - Hai chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn đƣợc có khả phân giải microcystin khá nhanh. Ở nồng độ microcystin 3 µg/l thời gian bán phân giải là 1,34 giờ và với nồng độ 20µg/l, thời gian là 3,43 giờ. - Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các chủng vi khuẩn Sphingomonas mali N4 và Sphingomonas asaccharolytica N7 là 30°C. Sau 7 ngày sự phân giải gần nhƣ hoàn toàn là 100%. 7. Các công trình công bố và sản phẩm đào tạo  Công trình công bố - Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà 2008. Đánh giá sự biến động số lượng theo mùa và theo tầng nước của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 125 – 128. - Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà 2008. Tìm hiểu khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis trong hồ Hoàn kiếm bằng vi khuẩn. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 119 – 122.  Đào tạo 4 Cử nhân - Bƣớc đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội. 2007. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Đặng Thị Kim Anh. - Bƣớc đầu đánh giá khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn Sphingomonas. 2008. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Nguyễn Thị Hoài. - Khảo sát sự biến động theo mùa của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm và khả năng ức chế sinh trƣởng của chúng bằng dịch chiết vỏ chuối, vỏ quýt. 2009. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Lê Thị Trang. - Phân lập, nghiên cứu một số đặc tính của tảo độc Microcystis tách chiết độc tố và thăm dò biện pháp xử lý.2009. Đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hữu Hiếu  Đào tạo 1 Thạc sỹ Phân giải tế bào Microcystis và sự phân huỷ độc tố microcystin bằng vi khuẩn nƣớc 2007 - 2009. Những đóng góp của đề tài: - Là công trình đầu tiên tách và lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam Microcystis. - Phân lập đƣợc 2 chủng vi khuẩn thuộc chi mới Sphingomonas có khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam Microcystis. - Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin. 8. Tình hình sử dụng kinh phí của đề tài - Kinh phí đƣợc cấp: 100 000 000 đồng - Kinh phí thực hiện: 100 000 000 đồng Hà Nội , ngày 18 tháng 10 năm 2008 Chủ trì đề tài Thủ trƣởng đơn vị (ký tên, đóng dấu) TS. Nguyễn Thị Hoài Hà ABSTRACT OF PROJECT 1. Title of the project: “Study on biological characteristis and capacity of biodegradation toxin of some Microcystis isolated from Hoan Kiem Lake, Hanoi” 2. Coodinator: Nguyen Thi Hoai Ha Member: Luu Thuy Giang Nguyen Quang Huy Le Trung Thuy Pham Thi Bich Dao Tran Thi Diep 3. Introduce Hoan Kiem Lake is a famous place because of its historical and cultural value. This is the habitat of valuable and rare species with endemicity and is also diversifying about the component of microalgae species. In recent years, the socioeconomic developmental process caused a lot of influences on the lake ecosystem especially on water quality. Mesotrophic situation of this lake resulted in the bloom water reducing specific microalgae species and concurrently increasing the species component and density of toxic algae. Among toxic cyanobacterial genera, Microcystis accounts for highest population (approximately 80% of total cyanobacterial strains that cause the bloom water). Microcystis aeruginosa Krutzing is the most popular species. This is a species which produces hepatotoxin, a type of liver toxin, composed from cyclic peptides called microcystin. They have effect on both animals and plants in waters. microcystin usually accumulates in cells or releases to surrounding waters. Thus the research on toxic cyanobacteria Microcystis in Hoan Kiem lake, Hanoi and finding effective methods to diminish their negative effects are essential. In this report, we describe the isolation, selection and classification location as well as biological characters of some Microcystis strains from Hoan Kiem lake, as a basic for the next researches. 4.The airm of project - Isolation, identification, inoculation and maitainance of Microcystis strains (blue-green, Cyanobacteria) at Microalgal Technology and Enviromental Biology Lab, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National of University, Hanoi. - Capacity of toxin degradation by aquatic bacteria. 5. Brief summary: - Biophysical and biochemical analysis of freshwater in Hoankiem lake at sampling time. - Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated. - Identification of Microcystis isolated. - Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC. - Capacity of toxin degradation by fresh bacteria 6. Results obtained - Hoankiem lake is in pollution condition in the aspect of chemical evacuation such as COD and BOD concentration is over the corresponding ones in Vietnamese standard system, TCVN 4942-1995 (type B) 20 times. Concentration of ammonium cation 0,129- 0,699 (mg/l), nitrite 0.012- 0,05 (mg/l), nitrate 0,0470,129 (mg/l), and phosphate 0,08- 0.64 (mg/l) that demonstrate concentration of nitrogen and phosphorus are relatively high. - Based on modified Shirai method, 10 pure strains of Microcystis were isolated and cultured. B12 medium (0.4% agarose) was selected as the most suitable for Microcystis isolation. - All of Microcystis strains were grown well on the Bold 3N medium that the numbers of cell from 68,6 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture. Especially, the maximal cell number of LT2 strain increased to 68,6 ×106 cells/ml after 19th culture. For J medium, the cell density was from 40,42 – 76,46 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture in which LT2 was the best growth strain with the numbers of cell 76,46 ×106 cells/ml after 19th culture. - Analytical results of unsaturated fatty acid in Microcystis LT2 and LT8 strains showed different 7 types of C15, C17 and C19 in which Palmitic acid occupied as major part with 1,302 μg/mg and 0,9683 μg/mg (in dry weight) in LT2 and LT8, respectively. The results indicated the diference in the concentration between 7 types of fatty acid. - Based on morphological and molecular taxonomy (for example comparision the sequence of 16S rDNA), LT2 and LT8 cyanobacterial strains were identified as M. aeruginosa; aquatic N4 and N7 bacterial strains were type of Sphingomonas mali và Sphingomonas asaccharolytica. - HPLC analysis showed the maximal concentration of MC-RR of 512,8 ng/mg in dry weight, 236,8 ng/mg of MC-YR and the lowest 114,25 ng/mg MCLR. - Sphingomonas strain was demonstrated to degrade microcystin in relatively good level. Time for degradation of a half of 3 µg/l and 20µg/l microcystin was 1,34 h and 3,43 h; respectively. - The suitable temperature for microcystin degradation by Sphingomonas mali N4, Sphingomonas asaccharolytica N7 strains was at 30°C. The degradation was completely after 7 day. 7. Publications and training activity Publications - Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha. Investigate water quality and the composition of algae in some lakes in Hanoi. 2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol 24, No 18, pp 125 – 128. - Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha. Study on toxin lysis in blue green algae by some strains bacteria isolated in Hoan Kiem lake. 2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol 24, No 18, pp 119 – 122. Training activity Master thesis completed in 2009 - Lysis of Microcystis and degradation of microcystin by aquatic bacteria. 2007-2009. Tran Thi Diep‟s official undergraduate thesis. Bacheler thesis completed - Isolation and screening of Microcystis toxin-degrading bacterial strains in Hoankiem lake, Hanoi, 2007. Dang Thi Kim Anh‟s official undergraduate thesis. - Investigation of Microcystis aeruginosa microcystin degradation by Sphingomonas. 2008. Nguyen Thi Hoai ‟s official undergraduate thesis. - Study on the seasonal fluctuation of cyanobacterial Microcystis aeruginosa in Hoankiem lake and growth restriction by banana skin and mandarin peel extracted solution, 2009. Le Thi Trang‟s official undergraduate thesis. - Isolation and study on Microcystis toxic cyanobacterial characteristics: toxin extraction and treatment investigation, 2009. Nguyen Huu Hieu‟s official undergraduate thesis. 8. Contributions of project: - Here is the first report that described isolation, maintaince and preservation of Microcystis strain. - Two Sphingomonas bacterial strains were isolated and proved as potent microcystin-degrading agent. - Establishment of toxin microcystin extraction procedure. 9. Research grant - Supplied expenditute: 100 000 000 Vnd - Used expenditute: 100 000 000 Vnd The project is supported by Vietnam, National University, Hanoi Hanoi, 18th October 2008 Project Coodinator Institute of Microbiology and Biotechnology Nguyen Thi Hoai Ha Vietnam, National University, Hanoi MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM .........................................................................3 1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC .......................................3 1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis................................................................................... 6 1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis .................................................................. 6 1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin ......................................................................... 8 1.3. SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƢỚC Sphingomonas .............................................................................................................9 1.3.1. Vi khuẩn Sphingomonas ...................................................................................... 9 1.3.2. Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas .............................. 10 1.4. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƢỜI VÀ GIA SÚC ............................11 1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM..........................................................................................................................13 1.5.1. Trên thế giới ........................................................................................................ 13 1.5.2. Ở Việt Nam ......................................................................................................... 14 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................16 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................16 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................ 16 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 16 2.1.3. Máy móc, dụng cụ .............................................................................................. 17 2.1.4. Hóa chất ............................................................................................................... 17 2.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn .............................................. 18 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................18 2.2.1. Phƣơng pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh giá chất lƣợng nƣớc ............................................................................................................. 18 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis ..................... 18 2.2.2.1. Làm giàu mẫu .......................................................................................18 2.2.2.2. Phƣơng pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa ...................................18 2.2.3. Phân loại vi khuẩn lam Microcystis ................................................................. 19 2.2.3.1. Bằng phƣơng pháp hình thái .................................................................19 2.2.3.2 . Phƣơng pháp tách ADN .......................................................................19 2.2.3.3. Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo .......................................20 2.2.4. Xác định mật độ tế bào ...................................................................................... 21 2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis ....... 22 2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng trên máy quang phổ ................................ 22 2.2.7. Các phƣơng pháp sắc ký .................................................................................... 22 2.2.7.1. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) ..................................................23 2.2.7.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................................23 2.2.8. Phƣơng pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas ................................. 24 2.2.9. Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải microcystin ................................ 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................26 3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU THỦY LÝ, THỦY HÓA NƢỚC HỒ HOÀN KIẾM .........................................................................................................................26 3.1.1. Nhiệt độ ............................................................................................................... 26 3.1.2. pH ......................................................................................................................... 26 3.1.3. Các chất lơ lửng SS ............................................................................................ 26 3.1.4. Hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen) ........................ 27 3.1.5. Nhu cầu oxy hóa học (COD- Chemical oxygen demand) ............................. 27 3.1.6. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD- Biochemical oxygen demand)....................... 27 3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI Microcystis PHÂN LẬP ĐƢỢC ...................................................................................................27 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................................. 27 3.2.2. Phân lập các khuẩn lạc của Microc ystis ......................................................... 29 3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4, LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trên các môi trƣờng khác nhau ................. 32 3.2.4. Thành phần acid béo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 ........................ 35 3.2.5. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S ...................................................... 36 3.3. TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN ....................................................38 3.3.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) .................................................................................... 38 3.3.2. Xác định hàm lƣợng microcystin trên máy quang phổ .................................. 38 3.3.3. Hàm lƣợng microcystin trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................. 39 3.4. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NƢỚC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MICROCYSTIN .....................................................................44 3.4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nƣớc .................................................................. 44 3.4.2. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 2 chủng N4 và N7 ..................... 47 3.5. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA 2 CHỦNG Sphingomonas N4 VÀ N7 .........................................................................................49 3.5.1. Hiệu quả phân giải microcystin của 2 chủng N4 và N7 ................................ 49 3.5.2. Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của chủng Sphingomonas N4 và N7 .................................................................................. 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................56 PHỤ LỤC 1 ...............................................................................................................62 PHỤ LỤC 2 ...............................................................................................................65 PHỤ LỤC 3 ...............................................................................................................66 PHỤ LỤC 4 ...............................................................................................................77 PHỤ LỤC 5 ...............................................................................................................78 PHỤ LỤC 6 .................................................................................................................1 DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG Danh mục hình Hình 1.1. Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội ................................................................................3 Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62] ........................................................................6 Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63] .......................................................................6 Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54] ..................................7 Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54] ..................................7 Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54] ..................................8 Hình 1.7. Hình dạng tế bào của Sphingomonas [57] .................................................9 Hình 1.8. Con đƣờng phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20] .....................11 Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu ...................................................................................16 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng C .........................28 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng Bold 3N ................28 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng B12 .......................28 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng J ...........................28 Hình 3.5. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1 ..........................................29 Hình 3.6. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT2 ..........................................29 Hình 3.7. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT3 ..........................................30 Hình 3.8. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT4 ..........................................30 Hình 3.9. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT5 ..........................................30 Hình 3.10. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6 ........................................30 Hình 3.11. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT7 ........................................31 Hình 3.12. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT8 ........................................31 Hình 3.13. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT9 ........................................31 Hình 3.14. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10 ......................................31 Hình 3.15. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể Bold 3N ..............................................................................................................................33 Hình 3.16. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể Bold 3N ...................................................................................................................................33 Hình 3.17. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể J .....34 Hình 3.18. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể J ..........34 Hình 3.19. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể B12 35 Hình 3.20. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể B12.....35 Hình 3.21. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của 2 chủng LT2, LT8 và các loài có quan hệ họ hàng gần ...................................................................37 Hình 3.22. Kết quả chạy TLC trƣớc khi nhuộm nihyđrin .........................................38 Hình 3.23. Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm nihyđrin ............................................38 Hình 3.24. Đồ thị đƣờng chuẩn microcystin .............................................................39 Hình 3.25a. Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn .........................................................40 Hình 3.25b. Sắc ký đồ microcystin YR chuẩn .........................................................40 Hình 3.25c . Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn ..........................................................41 Hình 3.25d. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT2 .................................................41 Hình 3.25e. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8 .................................................42 Hình 3.26. Nuôi cấy làm giàu các chủng vi khuẩn nƣớc trên môi trƣờng NA và M7 ...................................................................................................................................45 Hình 3.27. Cấy pha khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng NA ...................................45 Hình 3.28. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N4 và các loài có quan hệ họ hàng gần................................................................................48 Hình 3.29. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với các loài có quan hệ họ hàng gần................................................................................49 Hình 3.30. Thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau của 2 chủng N4, N7. ...........................................................................................................50 Hình 3.31. Khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas N4 ở các nhiệt độ khác nhau ....................................................................................................52 Hình 3.32. Khả năng phân giải của vi khuẩn Sphingomonas N7 ở nhiệt độ khác nhau ...........................................................................................................................53 Danh mục bảng Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16] ..............4 Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng Bold3N ...................................................................................................................................32 Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng J ........33 Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của các chủng Microcystis trên môi trƣờng B12 ..34 Bảng 3.4. Thành phần acid béo có trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 ..............36 Bảng 3.5. Hàm lƣợng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 ................................43 Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn nƣớc N4 và N7 .......................46 Bảng 3.7. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng N4 và N7 ...................................46 Bảng 3.8. Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau ....................................................................................................50 Bảng 3.9. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N4 ở các nhiệt độ khác nhau ..............................................................................................52 Bảng 3.10. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N7 ở các nhiệt độ khác nhau ..............................................................................................52 BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt Tên đầy đủ Adda 3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6dienoic acid MC-LR Leucine and arginine in the positions of X and Z of microcystin MC-RR Arginine and arginine in the positions of X and Z of microcystin MC-YR Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of microcystin PCR Phản ứng trùng hợp (Polymerase chain reaction) WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organisation) TLC Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography) HPLC Sắc ký lỏng cao áp (High permormance liquid chromatography) bp Cặp bazơ (Base pair) tb Tế bào MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn tới sự phát triển thƣờng xuyên và không bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu hệ động thực vật sống trong hồ [1, 2, 5, 9]. Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là microcystin (MC) [14, 15, 19, 23, 29]. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme protein phosphatases (nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu lên hai loại protein serine và threonin phosphatases [15, 16, 17, 18, 22]. Đã có một số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con ngƣời [16,17, 19, 20, 21]. Microcystin thƣờng tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc [16, 18, 35, 36, 42]. Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội”. Mục tiêu của đề tài * Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam Microcystis trong Bảo tàng Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN. * Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn. 1 Nội dung của đề tài - Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nƣớc hồ Hoàn Kiếm tại thời điểm thu mẫu. - Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng Microcystis. - Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc. - Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC). - Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc). 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM Hồ Hoàn Kiếm nằm ở trung tâm thủ đô Hà Nội, xƣa là một đoạn của dòng sông hồng và còn có tên gọi khác là sông Nhị. Diện tích hồ ƣớc tính khoảng 12 hecta, chiều dài Nam - Bắc là 700m. Chiều rộng Đông – Tây là 200m. Trong vài thập kỷ gần đây song song với quá trình phát triển kinh tế xã hội của Hà Nội,do không có biện pháp ngăn chặn những tác động gây ô nhiễm làm biến đổi hệ sinh thái hồ, ảnh hƣởng tới chất lƣợng nƣớc hồ, hàm lƣợng N và P tăng lên đã dẫn tới sự phát triển bùng nổ của vi khuẩn lam. Hồ Hoàn Kiếm trở thành một Hình 1.1. Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội trong những hồ phú dƣỡng ở Hà Nội. Trong hồ có sự phát triển mạnh mẽ của một số vi khuẩn lam thuộc chi Microcystis, tạo thành những váng lớn nổi bồng bềnh che kín mặt một góc hồ. Kết thúc sự nở hoa, vi khuẩn lam chết hàng loạt gây mùi hôi lan xung quanh khu vực hồ [6]. 1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC Vi khuẩn lam là nhóm cơ thể cổ xƣa nhất và mang nhiều tên gọi khác nhau trong quá trình nghiên cứu: thực vật phân cắt (Schizophyceae), tảo nhầy (Myxophyceae), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam (Cyanobacteria). Từ năm 1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh. Trong phân loại hiện đại, sinh vật chƣa có cấu trúc nhân hoàn hảo (Procaryota) gồm vi khuẩn lam và vi khuẩn, căn cứ vào đặc điểm cả hai đều không có nhân điển hình, chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể. Vi khuẩn lam và vi khuẩn còn có những nét giống nhau nhƣ: màng tế bào đều cấu tạo từ murein, một loại glucozaminopeptit; 3