Tài liệu Nghiên cứu bệnh đốm đen (phaeoisariopsis personata) hại lạc tại nghệ an

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ THỊ MAI VI NGHIÊN CỨU BỆNH ĐỐM ĐEN (Phaeoisariopsis personata) HẠI LẠC TẠI NGHỆ AN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ THỊ MAI VI NGHIÊN CỨU BỆNH ĐỐM ĐEN (Phaeoisariopsis personata) HẠI LẠC TẠI NGHỆ AN Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số: 62.62.01.12 Người hướng dẫn khoa học PGS. TS. NGUYỄN VĂN VIÊN HÀ NỘI, NĂM 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được dùng để bảo vệ lấy bất kỳ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày ….. tháng….. năm 2017 Tác giả luận án Ngô Thị Mai Vi i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo cùng với sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Viên đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài để hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tôi xin cảm ơn sự giúp đõ nhiệt tình của các cán bộ Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các vấn đề, giải pháp trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện thuận để tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày ..... tháng .... năm 2017 Tác giả luận án Ngô Thị Mai Vi ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình xi Trích yếu luận án xiii Thesis abstract xv PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 5 2.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 5 2.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam 6 2.2 Nghiên cứu về bệnh đốm đen hại lạc 7 2.2.1 Phân bố và tầm quan trọng của bệnh đốm đen hại lạc 7 2.2.2 Phân loại 10 2.2.3 Xác định các mẫu nấm gây bệnh bằng giải trình tự vùng ITS 11 2.2.4 Phân tích đa dạng di truyền của nấm dựa trên phân tích Rep - PCR 13 2.2.5 Triệu chứng bệnh đốm đen hại lạc 13 2.2.6 Đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc 14 2.2.7 Đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc 15 2.2.8 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh đốm đen hại lạc 19 2.2.9 Biện pháp phòng chống bệnh 21 iii PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 36 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37 3.2.1 Đánh giá mức đô ̣ phổ biế n và tác ha ̣i của bệnh đốm đen hại lạc 37 3.2.2 Xác đinh ̣ loài nấ m gây bê ̣nh đố m đen và đánh giá mức độ đa dạng phân tử của các mẫu nấm thu thập được 37 3.2.3 Nghiên cứu mô ̣t số đặc điểm sinh học của nấ m gây bê ̣nh đố m đen ha ̣i la ̣c 37 3.2.4 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bê ̣nh đố m đen hại lạc do nấm P. personata gây ra 38 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.3.1 Phương pháp đánh giá mức độ phổ biến và tác hại của bệnh đốm đen hại lạc 39 3.3.2 Phương pháp xác đinh ̣ loài nấ m gây bê ̣nh đố m đen và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của của nấm P. personata bằng kỹ thuật rep-PCR 3.3.3 40 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hı̀nh thái và sinh học của nấm P. personata 43 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh đốm hại lạc 47 3.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 58 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60 4.1 Mức độ phổ biến và tác hại của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An 60 4.1.1 Mức độ phổ biến của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An 60 4.1.2 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An 62 4.1.3 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến sinh trưởng và các yếu tố cấu thành năng suất của cây lạc 4.2 71 Xác định loài nấm gây bệnh đốm đen và đánh giá mức độ đa dạng phân tử của các mẫu nấm thu thập được 84 4.2.1 Một số đặc điểm hình thái của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc 84 4.2.2 Xác định các mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu tại Nghệ An bằng giải trình tự vùng ITS 4.2.3 85 Phân tích đa dạng di truyền của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc dựa trên phân tích Rep - PCR 89 iv 4.3 Một số đặc điểm sinh học của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc 4.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện ánh sáng đến sinh trưởng và sinh bào tử của nấm P. personata 4.3.2 106 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc do nấm P. personata gây ra 4.4.1 101 Xác định hình thức sinh sản hữu tính của nấm P. personata trong điều kiện tự nhiên 4.4 94 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ bào tử và tuổi lá đến khả năng gây bệnh của nấm P.personata bằng phương pháp lá tách 4.3.3 94 107 Nghiên cứu khả năng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc bằng biện pháp hóa học 109 4.4.2 Nghiên cứu khả năng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc bằng chất kích kháng 117 4.4.3 Nghiên cứu khả năng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc bằng biện pháp sinh học 122 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 143 5.1 Kết luận 143 5.2 Kiến nghị 144 Danh mục các công trình công bố 145 Tài liệu tham khảo 146 Phụ lục 163 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (Cặp bazơ) bt/ml Bào tử/mililiter BVTV Bảo vệ thực vật cs. Cộng sự CSB Chỉ số bệnh CT Công thức CDD-CT Cà độc dược dạng chiết tươi CDD-ĐS Cà độc dược dạng đun sôi ở 1000C CGL-CT Cà gai leo dạng chiết tươi CGL-ĐS Cà gai leo dạng đun sôi ở 1000C CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) DNA Deoxy nucleic acid D. metel Datura metel DTLNB Diện tích lá bị nhiễm bệnh ĐKVB Đường kính vết bệnh EM EMINA ERIC enterobacterial repetitive intergenic consensus FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp Quốc) GĐST Giai đoạn sinh trưởng ha Hecta HL Hiệu lực HLPT Hiệu lực phòng trừ kb Kilo base KC Khuyến cáo KH Ký hiệu RCB Randomized Complete Design (Thiết kế theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh) vi PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Rep Repetitive extragenic palindromic P. personata Phaeoisariopsis personata PLX Peanut leaf extract (Dịch chiết lá lạc). SVB Số vết bệnh TGUB Thời gian ủ bệnh TLB Tỷ lệ bệnh Trầu-CT Trầu không dạng chiết tươi Trau-ĐS Trầu không dạng đun sôi ở 1000C TSN Tần số nhiễm TT Thứ tự VĐ Vòng đời WA Water agar µl Microliter µM Micromol vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của thế giới (năm 2000 - 2012) 5 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) 6 3.1 Các mồi được sử dụng trong Rep-PCR 42 3.2 Mô tả các loại cà sử dụng trong thí nghệm 53 4.1 Mức độ phổ biến của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An trong vụ Xuân từ năm 2012 đến 2014 4.2 61 Mức độ phổ biến của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An trong vụ Thu từ năm 2012 đến 2014 4.3 62 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến sinh trưởng và các yếu tố cấu thành năng suất lạc giống L14 vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An 4.4 73 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến sinh trưởng và các yếu tố cấu thành năng suất lạc giống L14 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An vụ thu 2014 79 4.5 Đặc điểm tản nấm P. personata trên môi trường nhân tạo 85 4.6 Nguồn gốc và kết quả giải trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc 4.7 86 So sánh trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc với các nấm Mycosphaerella 4.8 87 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của 33 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu thập năm 2013 trong phân tích Rep - PCR 4.9 90 Sản phẩm của phân tích Rep-PCR đối với 33 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc 92 4.10 Quan hệ của các nhóm phả hệ với nguồn gốc địa lý, giống, đặc điểm hình thái 94 4.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của nấm P. personata ở điều kiện 12 giờ chiếu sáng/ngày 4.12 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng nấm P. personata trong điều kiện 24 giờ tối/ngày 4.13 96 99 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện ánh sáng đến khả năng sinh bào tử của nấm P.personata 100 viii 4.14 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 khi lây nhiễm trên lá lạc 5 tuần tuổi 4.15 Ảnh hưởng của tuổi lá đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 khi lây nhiễm với nồng độ 5.104 bào tử/ml 4.16 112 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của thuốc Carbenvil 50SC trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An 4.20 110 Ảnh hưởng của thuốc hóa học đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo 4.19 105 Hiệu lực ức chế của thuốc hóa học đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.17 103 115 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của thuốc hóa học Daconil 75WP trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An 4.21 117 Ảnh hưởng của chất kích kháng đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo 4.22 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của chất kích kháng trên giống lạc L14 trong điều kiện nhà lưới 4.23 120 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của chất kích kháng trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An 4.24 126 Hiệu lực ức chế của dịch chiết lá trầu không dạng chiết tươi đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.29 125 Hiệu lực ức chế của dịch chiết lá Cà độc dược dạng đun sôi đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.28 124 Hiệu lực ức chế của dịch chiết lá Cà độc dược dạng chiết tươi đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.27 123 Hiệu lực ức chế của dịch chiết Cà gai leo dạng chiết tươi đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.26 121 Hiệu lực ức chế của một số loại dịch chiết khác nhau ở nồng độ 10% đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.25 118 127 Hiệu lực ức chế của dịch chiết lá trầu không dạng đun sôi đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro ix 127 4.30 Ảnh hưởng của dịch chiết lá trầu không đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo 4.31 Ảnh hưởng của dịch chiết lá cà độc dược đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo 4.32 131 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của dịch chiết cà độc dược dạng chiết tươi (CDD-CT) trên giống L14 trong điều kiện nhà lưới 4.34 130 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của dịch chiết lá trầu không dạng đun sôi (Trau-ĐS) trên giống L14 trong điều kiện nhà lưới 4.33 129 132 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của dịch chiết lá trầu không dạng đun sôi (Trau-ĐS) trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An vụ xuân 2014 4.35 134 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen trên giống lạc L14 của dịch chiết cà độc dược dạng chiết tươi ngoài đồng ruộng tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An vụ xuân 2014 4.36 135 Hiệu lực ức chế của chế phẩm sinh học đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro 4.37 Ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo 4.38 138 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc của chế phẩm sinh học trên giống lạc L14 trong điều kiện nhà lưới 4.39 137 140 Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen trên giống lạc L14 của chế phẩm sinh học ngoài đồng ruộng tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An vụ xuân 2014 x 141 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Bản đồ phân bố trên thế giới của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc 7 2.2 Sơ đồ phân cấp bệnh đốm đen hại lạc (P. personata) 9 2.3 Phân tích phả hệ các nấm thuộc chi Mycosphaerella 12 2.4 Triệu chứng bệnh đốm đen hại lạc 14 2.5 Đặc điểm hình thái của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc 15 2.6 Chu kỳ bệnh của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc 20 4.1 Triệu chứng bệnh đốm đen do nấm P. personata gây ra trên giống L14 tại Nghi Lộc, Nghệ An 4.2 60 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc giống L14 tại huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An từ năm 2013 đến 2014 4.3 64 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc giống Sen lai tại huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An từ năm 2013 đến 2014 4.4 65 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc giống L14 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An từ năm 2013 đến 2014 4.5 66 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc giống Sen lai tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An từ năm 2013 đến 2014 4.6 68 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc giống L14 tại huyện Nam Đàn, tỉnh Nghệ An từ năm 2013 đến 2014 4.7 69 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc giống Sen lai tại huyện Nam Đàn, tỉnh Nghệ An từ năm 2013 đến 2014 70 4.8 Năng suất lạc tương ứng với từng cấp bệnh (vụ xuân 2014) 72 4.9 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến chiều cao cây vụ xuân 2014 74 4.10 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến chiều dài cành cấp 1 vụ xuân 2014 74 4.11 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số cành trên cây vụ xuân 2014 74 4.12 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số quả trên cây vụ xuân 2014 74 4.13 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số quả chắc trên cây vụ xuân 2014 74 4.14 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng quả chắc trên cây vụ xuân 2014 74 4.15 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số hạt trên cây vụ xuân 2014 75 4.16 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng hạt trên cây vụ xuân 2014 75 4.17 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng 100 quả vụ xuân 2014 75 xi 4.18 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng 100 hạt vụ xuân 2014 75 4.19 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến năng suất lý thuyết vụ xuân 2014 75 4.20 Năng suất lạc tương ứng với từng cấp bệnh (vụ thu 2014) 78 4.21 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến chiều cao cây vụ thu 2014 80 4.22 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến chiều dài cành cấp 1 vụ thu 2014 80 4.23 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số cành trên cây vụ thu 2014 80 4.24 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số quả trên cây vụ thu 2014 80 4.25 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số quả chắc trên cây vụ thu 2014 80 4.26 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng quả chắc trên cây vụ thu 2014 80 4.27 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến số hạt trên cây vụ thu 2014 81 4.28 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng hạt trên cây vụ thu 2014 81 4.29 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng 100 quả vụ thu 2014 81 4.30 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến khối lượng 100 hạt vụ thu 2014 81 4.31 Ảnh hưởng của bệnh đến năng suất lý thuyết vụ thu 2014 81 4.32 Kích thước sợi nấm, cành và bào tử phân sinh của nấm P. personata (Độ phóng đại 400 lần, 1 vạch thước = 2,5 μm) 4.33 84 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 11 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu tại Việt Nam (đánh dấu bằng chấm đen) và các mẫu nấm sẵn có trên GenBank. 4.34 88 Box-PCR trên 33 mẫu nấm đốm đen hại lạc M. berkeleyi thu thập ở 4 tỉnh năm 2013. 4.35 92 Phân tích cụm dựa trên số liệu BOX-PCR của các mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu thập tại Việt Nam 93 4.36 Đường kính tản nấm sau 10 tuần nuôi cấy (12 giờ chiếu sáng/ngày) 95 4.37 Đường kính tản nấm sau 10 tuần nuối cấy (24 giờ tối/ngày) 98 4.38 Lây bệnh nhân tạo trên lá tách 4.39 Thí nghiệm đánh giá hiệu lực ức chế khả năng nảy mầm của nấm 102 P. personata của các các chế phẩm trong phòng thí nghiệm 107 4.40 Thí nghiệm phòng trừ bệnh trong điều kiện in vivo 108 4.41 Thí nghiệm phòng trừ bệnh trong nhà lưới 108 4.42 Thí nghiệm phòng trừ bệnh ngoài đồng ruộng (thí nghiệm ô nhỏ 108 xii TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Ngô Thị Mai Vi Tên luận án: Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An. Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 62 01 12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá được thiệt hại, mức độ đa dạng và biện pháp phòng trừ nấm Phaeoisariopsis personata gây bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An. Phương pháp nghiên cứu * Vật liệu nghiên cứu: Các giống lạc được trồng phổ biến tại Nghệ An (giống L14, giống Sen lai), các mẫu bệnh đốm đen hại lạc thu thập tại tỉnh Nghệ An và một số tỉnh khác. * Nội dung nghiên cứu - Đánh giá mức đô ̣ phổ biế n và tác ha ̣i của bệnh đốm đen hại lạc. - Xác đinh ̣ loài nấ m gây bê ̣nh đố m đen hại lạc và đánh giá mức độ đa dạng phân tử của các mẫu nấm thu thập được. - Nghiên cứu mô ̣t số đặc điểm hình thái và sinh học của nấ m gây bê ̣nh đố m đen ha ̣i la ̣c. - Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bê ̣nh đố m đen hại lạc do nấm Phaeoisariopsis personata gây ra. * Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp điều tra theo QCVN 01- 38: 2010/BNNPTNT. - Phương pháp đánh giá thiệt hại của bệnh đốm đen đến sinh trưởng và năng suất lạc được thực hiện theo Das and Roy (1995). - Các mẫu nấm thuần được chiết DNA tổng số theo phương pháp của Doy and Doy (1987); Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm; Mức độ đa dạng di truyền của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc được đánh giá bằng kỹ thuật Rep-PCR theo Versalovic et al. (1991, 1994). xiii - Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm P. personata được thực hiện theo Stenglein et al. (2006) và Mallikarjuna (2012). - Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng thuốc hóa học được thực hiện theo Labrinos and Nutter (1993); Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng chất kích kháng được thực hiện theo Zhang et al. (2001); Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng dịch chiết thực vật được thực hiện theo Kishore et al. (2001); Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng chế phẩm sinh học được thực hiện theo Zhang et al. (2001). - Tính hiệu lực của thuốc hóa học, chất kích kháng, dịch chiết thực vật, chế phẩm sinh học theo công thức Abbott (1925). - Phân tích đa dạng được thực hiện dùng các phầm mềm ClustalX và MEGA 6.0. Các số liệu thí nghiệm khác được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng phần mềm IRRISTART 4.0. Kết quả chính và kết luận Xác định được mức độ phổ biến, tác hại và thiệt hại năng suất do nấm P. personata gây ra trên giống lạc L14 ngoài dồng ruộng tại Nghệ An. Trong điều kiện tỉnh Nghệ An, bệnh đốm đen có thể làm giảm tới 30,24% trong vụ xuân và 49,90% năng suất trong vụ thu. Dựa trên giải trình tự ITS của 11 mẫu nấm thu thập tại Việt Nam đã góp phần xác định danh tính của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc là Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính). Dựa trên phân tích Rep - PCR cũng đã chứng tỏ quần thể nấm ở Nghệ An có mức độ đa dạng thấp và không có mối quan hệ giữa các nhóm phả hệ với đặc điểm hình thái, nguồn gốc của câc mẫu nấm thu thập. Xác định được các đặc điểm sinh học và dịch tễ đặc trưng của nấm P. personata tại Nghệ An. Trong đó, khám phá khoa học quan trọng nhất là chưa phát hiện thấy dạng sinh sản hữu tính của nấm trong điều kiện tự nhiên tại Nghệ An. Kết quả nghiên cứu của luận án cũng đã chứng tỏ hoạt chất Carbendazim và dịch chiết thực vât từ cây cà độc được (Datura metel), cây trầu không (Piper betel) có khả năng phòng chống hiệu quả nấm P. personata trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng như ngoài đồng ruộng. Ở ngoài đồng ruộng, có hai thời điểm xử lý bệnh đốm đen hiệu quả nhất, bao gồm phun khi cây mọc 5 tuần, 6 tuần hoặc khi cây mọc 8 tuần và 9 tuần. xiv THESIS ABSTRACT PhD candidate: Ngo Thi Mai Vi Thesis title: Study on Peanut Black Spot Disease (Phaeoisariopsis personata) in Nghe An. Major: Plant Protection Code: 62 62 01 12 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: To investigate the damage and losses of the black spot disease, to identify the genetic diversity level and control measures of the pathogenic fungus, Phaeoisariopsis personata, causing black spots located in Nghe An. Materials and Methods * Materials - The popular varieties grown in Nghe An (type L14, Sen lai), and the black spot fungus samples collected in Nghe An province and some other provinces. * Research content - Evaluation of the disease progress and damage level of the black spot disease of peanut in the fields. - Molecular Identification of peanut black spot fungus and genetic diversity of the selected fungal isolates. - Characterization of morphological and biological characteristics of the peanut black spot fungus. - Identification of the effective control measures to the peanut black spots fungus. * Methods: - Field surveys were conducted folowing a protocol QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT. - Assessment of the damage and losses of the diseased peanut plants was conducted following the method described by Das and Roy (1995). - Fungal DNA extraction was condected following the method described by Doy and Doy (1987). - The ITS region of the fun gal isolates was amplified using two primers ITS4 and ITS5 (White et al., 1990. ITS region was direct sequenced using primer ITS4. Sequence analysis was conducted using MEGA 6.0 and aClustalX softwares. xv - The level of genetic diversity of the slected fungal isolates was identified using a Rep-PCR technique following a prorocol described by Versalovic et al. (1991, 1994). - Biological characterisation of the fungi was cmplimented as describied by Stenglein et al. (2006) and Mallikarjuna (2012). - Identification of the control efficacy of fungicides and antagonistic microorganisms to the fungus was conducted following the protocols described by Labrinos and Nutter (1993) and Zhang et al. (2001), respectively. - Identification of the control efficacy of plant extracts to the fungus was cobducted following the protocol described by Kishore et al (2001). - Control effectiveness of fungicides, plant extracts and antagonistic microorganisms was identified using a formula of Abbott (1925). Main findings and conclusions The thesis provided additional data on yield losses of peanut (L14 cultivar) caused by the fungus P. personata in Nghe An. In Nghe An conditon, the black spot disease could reduced the peanut yield from 30,24% in spring season to 49,90% in fall seasion. It was for the first time in Vietnam the identify of the black spot fungus of peanut was identified as P. personata based on ITS sequencing. Based on the Rep-PCR analysis, it was known that the genetic diversity level of the fungus population in Nghe An was low and not related with the morphological, pathogenic characteristics and the origins of the tested isolates. It was for the first time in Viet nam, all important biological and epidemic characteristics of the black spot fungus were characterized. The most importantly scientific finding was the finding that the sexual stage of the fungus has not been observed Nghe An. The thesis work also demonstrated that a fungicide, carbendazime, and two extracts extracted from Datura metel and Piper betel plants had highly control efficacy to the fungus under laboratory and field conditions. Under field condition, the most suitable time of application of fungicide or plant extract were at 5 to 6 or 8 to 9 weeks after emergence of seedlings. xvi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh đốm đen do nấm Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính) là một trong các bệnh hại lá nguy hiểm nhất đối với cây lạc trên toàn thế giới. Thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen trên toàn cầu ước tính gần 3 triệu USD (CABI, 2006). Mức độ thiệt hại năng suất của bệnh đốm đen hại lạc thay đổi theo khu vực và vụ trồng. Tại các khu vực không phòng trừ bằng thuốc trừ nấm, thiệt hại có thể tới 50%. Tại các khu vực, nơi áp dụng biện pháp phòng trừ (chẳng hạn như ở phía Nam Hoa Kỳ) thì thiệt hại năng suất cũng xấp xỉ 10%. Tại vùng nhiệt đới bán khô hạn, nơi hiếm khi sử dụng thuốc trừ nấm thì thiệt hại do bệnh đốm đen thường vượt quá 50% (CABI, 2006). Theo Zhang et al. (2001) và Dwivedi et al. (2003), bệnh đốm đen, đốm nâu và gỉ sắt là ba loại bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lạc và có thể làm giảm năng suất lạc tới 50%. Theo Pensuk (2003), bệnh đốm đen có thể làm giảm tới 80% năng suất của cây lạc. Theo Khedikar (2010), khi cây lạc vừa bị ảnh hưởng của bệnh gỉ sắt và bệnh đốm đen thì năng suất có thể giảm 50 - 70% . Trên đồng ruộng, nấm tạo cả 2 giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính nhưng bào tử phân sinh hình thành từ tàn dư tồn tại trong đất là nguồn bệnh quan trọng nhất. Nhìn chung, nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc không truyền qua hạt nhưng được xem là tác nhân truyền qua đất. Khi bắt đầu vụ trồng, bào tử phân sinh nấm từ tàn dư trong đất sẽ nhiễm các lá phía dưới và nhanh chóng phát tán lên các lá phía trên và có thể gây tàn lụi bộ lá nếu điều kiện ngoại cảnh thuận lợi (McDonald et al., 1985). Tác nhân gây bệnh đốm đen là một loài nấm túi thuộc nhóm sinh dưỡng “biotrophe” và quan hệ của nấm với cây lạc tuân theo quan hệ gen đối gen điển hình. Hiện nay đã có một số nghiên cứu trên thế giới về tính kháng của cây lạc đối với nấm gây bệnh đốm đen (Dwivedi et al., 2002; Mace et al., 2006; Mondal and Badigannavar, 2009; Mondal et al., 2009; Mallikarjuna et al., 2012). Các chủng nấm khác nhau về nền di truyền có thể có phản ứng mẫn cảm khác nhau đối với thuốc hóa học cũng như khác nhau về tính gây bệnh trên các 1 giống cây (Adiver et al., 2009). Vì vậy, mức độ đa dạng về các đặc điểm sinh học cũng như di truyền của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc nói riêng và tác nhân gây bệnh nói chung cần phải được nghiên cứu để áp dụng hiệu quả các biện pháp phòng chống. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về mức độ đa dạng của nấm gây bệnh được thực hiện. Cho tới nay, mới chỉ có 2 nghiên cứu về mức độ đa dạng phân tử của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc tại Ấn Độ dựa trên phân tích RAPD (Adiver et al., 2009) và phân tích phổ isozyme (Adiver et al., 2008). Tương tự, cũng chỉ có 2 nghiên cứu về mức độ biến động về tính gây bệnh của nấm P. personata gây bệnh đốm đen (Hossain, 1997; Hossain and Ilag, 2000). Nghê ̣ An là tı̉nh có diê ̣n tı́ch trồ ng la ̣c lớn với gầ n 20000 ha, tâ ̣p trung chủ yế u ở các huyện như Quỳnh Lưu, Diễn Châu, Nghi Lô ̣c, Thanh Chương và Nam Đàn. Cùng với tiề m năng đấ t đai và điề u kiê ̣n sinh thái phù hơ ̣p nên cây la ̣c đươ ̣c coi là cây trồng chủ lư ̣c ở Nghê ̣ An. Đặc biê ̣t, cây la ̣c là một trong những đinh ̣ hướng phát triể n quan trọng của tı̉nh nhằm hướng tới xuấ t khẩ u ổ n đinh ̣ và mang la ̣i nguồ n thu nhâ ̣p lớn cho người dân. Tuy nhiên, thực tế sản xuấ t trong tı̉nh cho thấy tình hı̀nh phát triể n la ̣c còn nhiề u ha ̣n chế, chưa xứng đáng với tiề m năng đấ t đai và điề u kiê ̣n sinh thái của vùng, năng suất cũng như phẩ m chấ t la ̣c ở đây còn thấ p và không ổ n định so với các tı̉nh khác trong cả nước. Trong đó, viê ̣c áp dụng các biện pháp thâm canh làm phát sinh ngày càng nhiề u dich ̣ ha ̣i nguy hiể m, đă ̣c biê ̣t là loại nấm gây ha ̣i trên lá như P. personata. Tại Nghê ̣ An nói riêng và Việt Nam nói chung, bệnh đốm đen hại lạc xuất hiện và gây hại phổ biến trên đồng ruộng. Tuy nhiên, cho tới nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu sâu và thực hiện một cách hệ thống về bệnh này ở Việt Nam. Bên ca ̣nh đó, do bệnh hiếm khi làm chết cây nên người dân cũng như các cơ quan chuyên môn chưa đánh giá đúng tác ha ̣i của nhóm bê ̣nh ha ̣i lá đế n năng suấ t và phẩ m chất la ̣c. Chính vı̀ vậy, công tác chỉ đạo trong phòng trừ bê ̣nh chưa phù hợp dẫn đế n sự giảm sút nghiêm tro ̣ng về năng suấ t cũng như phẩ m chấ t la ̣c của vùng. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, việc nghiên cứu về bệnh đốm đen hại lạc là cần thiết ở Việt Nam. Nghiên cứu này tập trung vào đánh giá thiệt hại, mức độ đa dạng của nấm cũng như đánh giá một số biện pháp phòng trừ bệnh trong điều kiện tỉnh Nghệ An. Các kết quả nghiên cứu của luận án sẽ là cơ sở để nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp trừ bệnh đốm đen nhằm phòng chống hiệu quả sự phát triển, lây lan của bệnh trên đồng ruộng, góp phần làm tăng năng suất và phẩm chất lạc. 2